趙 亮 陳紅麗 王 勉 解麗芹 徐艷麗 何 孟 馮志偉 李 敏*(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 35008)

2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003; 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)用材料重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架的體內(nèi)降解及體外生物相容性的研究

趙 亮1,2陳紅麗1王 勉1解麗芹1徐艷麗1何 孟1馮志偉1李 敏1*1(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108)

2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003; 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)用材料重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

探討蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架的體內(nèi)降解性能和生物相容性，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。通過靜電紡絲儀，將RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR16)、聚己內(nèi)酯(PCL)、明膠(Gt)、殼聚糖(CS)共混形成的紡絲液進行電紡，制得(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架，并將其植入SD大鼠腿部肌肉中，通過肉眼外觀觀察、組織切片HE染色評價等方法，評價蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架的體內(nèi)降解情況。分析支架浸提液對間充質(zhì)干細(xì)胞集落形成、細(xì)胞分裂指數(shù)、臺盼藍拒染率、細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期的影響，評價血管支架的生物相容性。血管支架在整個植入期內(nèi)不斷降解，(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架降解程度更深，纖維斷裂嚴(yán)重，12周時失重率為20.3%，其降解速度明顯快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架，后者在12周時僅降解了13.2%。在(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面積和分裂指數(shù)都顯著高于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架組。血管支架毒性等級均低于1 級，無細(xì)胞毒性。與血管支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)的MSC生長狀態(tài)良好，臺盼藍拒染率高于95%，復(fù)合培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞G0/1期比例降低，S、G2/M期比例均升高。蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架的體內(nèi)降解和生物相容性良好，應(yīng)用于臨床具有一定的可行性。

組織工程血管; 蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架; 體內(nèi)降解; 體外生物相容性

引言

血管移植手術(shù)是治療心血管疾病的主要手段[1]。自體血管和人工合成血管是臨床上常用的血管移植物，但自體血管來源有限，難以滿足臨床需求。人工合成血管(如滌綸(Dacron)和膨脹聚四氟乙烯(ePTFE))在大直徑血管(內(nèi)徑>6mm)移植中有較佳的效果，但在小直徑血管(內(nèi)徑<6mm)移植中容易形成血栓、內(nèi)膜增生、血管狹窄甚至阻塞等現(xiàn)象[2]。組織工程血管技術(shù)為小直徑血管移植物提供了新來源。組織工程血管的構(gòu)建主要有兩個方面：種子細(xì)胞的選取和組織工程血管支架的制備。支架材料為種子細(xì)胞的增殖和遷移提供支撐結(jié)構(gòu)，在組織工程血管的構(gòu)建中起關(guān)鍵作用。蜘蛛絲纖維來源于自然界，力學(xué)性能優(yōu)異，其柔韌性能和彈性遠遠優(yōu)于人造纖維，由于其具有良好的生物力學(xué)性能和細(xì)胞相容性，因此可作為一種新型的生物醫(yī)學(xué)支架材料廣泛應(yīng)用。天然蛛絲的來源有限，目前將其應(yīng)用于組織工程的研究相對較少[3]。目前報導(dǎo)以人工合成蜘蛛絲蛋白為原料構(gòu)建組織工程血管支架材料的研究工作，主要見于李敏教授課題組發(fā)表的相關(guān)文獻[4-9]。

該課題組在前期以98%甲酸為溶劑，基于有較高力學(xué)強度和良好組織相容性的重組蛛絲蛋白(pNSR16)、優(yōu)良生物降解性的聚己內(nèi)酯(PCL)、優(yōu)異生物相容性的殼聚糖(CS)和無抗原性且親水性良好的明膠(Gt)，發(fā)揮每種成分的優(yōu)良特性，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)，構(gòu)建了 (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)蛛絲蛋白雙層小直徑血管支架，并研究了其生物力學(xué)性能和體外降解性能[10-11]。研究結(jié)果表明，其爆破強度的范圍為39～150 kPa，高于生理血壓；縫合強度大于0.19 N，滿足體內(nèi)移植的要求；拉伸強度高于人體橈動脈血管，滿足體內(nèi)移植的要求；水滲透性為0.3～0.6 mL·min-1·cm-2。該支架的降解程度高于同等條件下的(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架，血管支架在酶解液中的降解程度均高于在PBS中的降解程度。體內(nèi)降解性能及其生物相容性也是血管支架能否應(yīng)用于臨床治療的重要評價指標(biāo)，基于此，筆者在本研究中對這兩方面進行評價，為其后續(xù)運用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：SD大鼠15只，雌雄不限，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。在實驗過程中，對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。

OriCellTM SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(賽業(yè)生物技術(shù)公司)，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 ( beyotime )，肝素鈉、多聚甲醛、Gt、CS、98%甲酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，最適切片溫度混合物(OCT)(Sakura Finetek, 日本)，碘伏(南昌利爾康藥械實業(yè)有限公司)，醫(yī)用酒精(山東利爾康消毒科技有限公司)，pNSR16(分子量60KD，自制)，PCL(分子量8000，日本大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會社)。

智能化靜電紡絲儀(自主專利，福州凱特電氣有限公司)，HM550型冰凍切片機(德國MICRO公司)，靜脈輸液針(湖南平安醫(yī)療器械有限公司)，手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)，3-0醫(yī)用真絲編織線、5×12縫合針、7×17縫合針(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 靜電紡絲制備蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架

以98%甲酸為溶劑，配制pNSR16∶PCL∶CS質(zhì)量比為5∶85∶10的混合電紡溶液作為內(nèi)層紡絲液，配制pNSR16∶PCL∶Gt質(zhì)量比為5∶85∶10的混合電紡溶液作為外層紡絲液，兩種紡絲液的總濃度分別為10%和18%，各成分含量見表1。應(yīng)用恒溫振蕩器在室溫下振蕩溶解紡絲液，使其形成均一透明的溶液。電紡參數(shù)設(shè)置為：電壓18 kV，固化距離15 cm，擠出速度1 mL/h，轉(zhuǎn)軸直徑1.2 mm，溫度為30℃，相對濕度50%。啟動高壓發(fā)生裝置和推進器進行電紡，內(nèi)層制備后，以內(nèi)層的外表面作為接收棒電紡的外層紡絲液。

表1 紡絲液中各成分含量(總體積10 mL)Tab.1 Composition content of blend solution (10 mL system)

1.2.2 血管支架的體內(nèi)降解

1.2.2.1 動物體內(nèi)植入

將雙層血管支架裁剪成長條形狀(10 mm×2 mm×1 mm)，70%乙醇浸泡36 h，無菌PBS洗滌3次×2 min，備用。選取健康SD大鼠，用10%水合氯醛麻醉，10 min后，將其固定于手術(shù)臺上，酒精消毒液消毒手術(shù)部位。在大鼠雙腿部肌肉處各選一個埋植點，將皮膚及肌肉剪開，切口寬約1.5 cm，深1～1.5 cm。植入血管支架，縫合肌肉與皮膚。每種材料做3個平行，對照組植入(PCL/CS)/(PCL/Gt)。術(shù)后應(yīng)用取暖器保暖，大鼠醒后分籠飼養(yǎng)。植入2、4、8、12周時斷頸處死SD大鼠，取出支架，盡量保持支架的完整性。

1.2.2.2 支架大體觀察及失重率測定

觀察植入支架材料降解情況和周圍皮膚的變化。在植入前及按期取出后進行風(fēng)干處理，保證水分完全揮發(fā)，然后分別用電子天平測量支架材料重量，失重率的計算公式如下：

1.2.2.3 組織切片HE染色

將支架材料置于PBS，洗滌2 min×3次；在4℃的條件下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2 min×3次；20%蔗糖溶液中4℃過夜，待樣品沉入溶液底部即可；OCT包埋，冷凍切片，厚度7 μm，可放入4℃暫時保存，或-40℃長期保存。HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察支架的降解情況。

1.2.3 血管支架浸提液的制備

根據(jù)ISO10993—12:2009，分別取(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)、(PCL/CS)/(PCL/Gt)雙層血管支架，以0.1 g/mL的比例添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃條件下浸提24 h，以0.22 μm的濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.4 MSC集落形成實驗

從SD大鼠骨髓中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，制備濃度為2×105個/mL的間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液，以每孔0.5 mL種入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3 d后吸除培養(yǎng)液，分3組(4孔/組)換液。第一組仍換入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，第二組加(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)浸提液，第三組加(PCL/CS)/(PCL/Gt)浸提液。在相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d后用Giemsa染液染色，應(yīng)用顯微鏡計數(shù)MSC集落，大于50個細(xì)胞的細(xì)胞群落視為一個MSC集落，應(yīng)用顯微測微尺測量集落的直徑大小，以此計算集落面積。

1.2.5 血管支架浸提液對MSC分裂指數(shù)的影響

采用細(xì)胞爬片法。在培養(yǎng)第4代MSC的過程中加入血管支架浸提液，培養(yǎng)2d再添加秋水仙素反應(yīng)6 h后，將蓋玻片取出，應(yīng)用95%乙醇固定，HE染色，應(yīng)用中性樹膠封片。每個玻片應(yīng)用顯微鏡觀察2 000個細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞，計算細(xì)胞分裂指數(shù)的公式如下：

細(xì)胞分裂指數(shù)(%)=

(1)

1.2.6 支架浸提液細(xì)胞毒性評價[13]

取間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，96孔板每孔加100 μL細(xì)胞懸液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1 d后，棄培養(yǎng)液，加100 μL支架浸提液繼續(xù)培養(yǎng)，陰性對照組加100 μL間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，每組4個平行，隔天換液。每日鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)，分別于1、2、3、4、5、6、7 d取出進行MTT檢測，具體步驟如下：每孔滴加20 μL MTT，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h；棄孔內(nèi)液體，加150 μL DMSO，吹吸混勻以溶解紫色結(jié)晶；酶標(biāo)儀讀取OD值，檢測波長570 nm，參比波長630 nm。以時間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞相對增殖度(relative growth rate，RGR)的計算公式[14]如下：

(2)

根據(jù)細(xì)胞RGR反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)(見表2)，評價血管支架的細(xì)胞毒性程度。

1.2.7 臺盼藍拒染率

將正常生長的第3代MSC接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在對照組中加入正常培養(yǎng)基，實驗組加入血管支架浸提液。培養(yǎng)5 d后，胰蛋白酶/EDTA消化液(TE)消化各組貼壁細(xì)胞，2%臺盼藍染液染色，每組觀察1 000個細(xì)胞，計數(shù)著色細(xì)胞數(shù)。計算細(xì)胞拒染率如下：

表2 反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Response grading standards

(3)

1.2.8 血管支架浸提液對細(xì)胞周期的影響

第4代間充質(zhì)干細(xì)胞與支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)7 d后，應(yīng)用TE消化后轉(zhuǎn)移至離心管中，2 000 r/min離心5 min。去除上清，添加預(yù)冷的PBS重新懸浮細(xì)胞后吸至無菌的離心管中，再次離心后添加1 mL、-20℃預(yù)冷的70%乙醇搖勻，在4℃的條件下固定12 h。1 000 r/min離心5 min，去除上清，添加1 mL、4℃預(yù)冷的PBS使細(xì)胞重懸，應(yīng)用300目細(xì)胞篩過濾。依照細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的方法，檢測細(xì)胞周期。每個離心管均加入0.5 mL碘化丙錠染色液使細(xì)胞重懸，37℃細(xì)胞避光孵育30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀，在激發(fā)光488 nm波長下檢測紅色熒光散射情況，ModiFit軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差定量表示實驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS11.0軟件。應(yīng)用廣義線性模型統(tǒng)計分析生物學(xué)數(shù)據(jù)，均數(shù)的比較使用單因素方差來分析，組間比較使用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管支架體內(nèi)降解

2.1.1 血管支架的大體變化及失重率情況

所有實驗動物在手術(shù)過程中及手術(shù)后均無死亡狀況，進食無異常，切口無紅腫、無感染。由圖1可知，雙層血管支架在整個實驗周期內(nèi)都在不斷降解，(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)雙層血管支架的降解速度明顯快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架，其在12周時已經(jīng)降解了20.3%，而(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架在12周時僅降解了13.2%。雙層血管支架植入2～4周后，支架被周圍纖維組織緊密包裹，支架部分降解，并有部分新生組織長入支架中，新生組織與周圍纖維組織界限不明顯。8周后，外圍包裹的纖維組織逐漸消失，有大量的新生組織出現(xiàn)，兩者并有了一定的界限。12周后，外圍包裹的纖維組織完全消失，血管支架降解較為嚴(yán)重。

圖1 血管支架體內(nèi)降解失重率的變化Fig.1 Weight loss of vascular scaffold in vivo degradation

2.1.2 組織切片觀察支架材料在大鼠皮下的降解情況

圖2為支架材料植入大鼠體內(nèi)12周后的HE染色結(jié)果。在12周時，血管支架有明顯的降解，其中(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架降解程度更深，支架纖維斷裂嚴(yán)重，而(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架纖維斷裂較少，結(jié)構(gòu)排列相對有序，降解程度較低。分析認(rèn)為蛛絲蛋白作為一種蛋白質(zhì)，動物體內(nèi)含有多種酶，有利于分解蛋白質(zhì)，因而蛛絲蛋白的添加加速了降解。

圖2 體內(nèi)降解12周后血管支架的HE染色(100×，箭頭指示纖維)。(a) (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt); (b) (PCL/CS)/(PCL/Gt) Fig.2 HE staining of vascular scaffold in vivo degradation for 12 weeks (100×, arrows indicate fiber) (a) (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt); (b) (PCL/CS)/(PCL/Gt)

2.2 血管支架浸提液對大鼠骨髓MSC集落生成的影響

在(PCL/CS)/(PCL/Gt)血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠骨髓MSC集落生成率和平均集落面積較小，而在(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠骨髓MSC集落生成率和平均集落面積都顯著高于(PCL/CS)/(PCL/Gt)血管支架浸提液的情況，而與對照組相比無顯著性差異(見表3)，這說明pNSR16的添加顯著改善了血管支架的細(xì)胞相容性。

2.3 血管支架浸提液對大鼠骨髓MSC分裂指數(shù)的影響

如圖3所示，在兩種血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分裂指數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異性，而在(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分裂指數(shù)略高于常規(guī)培養(yǎng)的情況，但無顯著差異性。

表3 血管支架浸提液對大鼠骨髓MSC 集落生成能力的影響Tab.3 The effect of vascular scaffold extract on colony formation ability of rat bone marrow MSC

注：*P<0.05，與 (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)相比。

Note：*P<0.05, compared with (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt).

圖3 血管支架浸提液培養(yǎng)條件下大鼠骨髓MSC的分裂指數(shù)Fig.3 Mitotic index of rat bone marrow MSC under the culture of vascular scaffold extract

2.4 血管支架浸提液毒性試驗

圖4表示細(xì)胞在支架材料浸提液中的生長曲線。各組細(xì)胞生長曲線的趨勢十分相似，1～2 d時

細(xì)胞增殖較慢，2～5 d時細(xì)胞迅速增殖，5～7 d時細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期，表明細(xì)胞增殖狀況較好。(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt) 支架浸提液未對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，在(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架浸提液中細(xì)胞增殖略受影響。表4表示支架毒性等級和細(xì)胞的相對增殖度。應(yīng)用RGR評價支架的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明兩組血管支架的毒性等級都小于1級，血管支架浸提液無細(xì)胞毒性，有利于細(xì)胞的增殖，滿足組織工程血管支架的要求。

圖4 血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長曲線Fig.4 Cell growth curve under the culture of vascular scaffold extract

2.5 血管支架浸提液對大鼠骨髓MSC的臺盼藍拒染率的影響

如圖5所示，在血管支架浸提液培養(yǎng)條件下間充質(zhì)干細(xì)胞的臺盼藍拒染率基本上高于95%，接近于對照組，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異性。

表4 細(xì)胞相對增殖度與支架毒性等級評價Tab.4 Cells RGR and scaffold toxicity grade evaluation

圖5 血管支架浸提液培養(yǎng)條件下細(xì)胞的臺盼藍拒染率Fig.5 Cell trypan blue dye exclusion ratio under the culture of vascular scaffold extract

2.6 血管支架浸提液對間充質(zhì)干細(xì)胞周期的影響

對照組的DNA流式細(xì)胞術(shù)顯示出典型的間充質(zhì)干細(xì)胞 G0/1、S、G2/M 峰型。與對照組和(PCL/CS)/(PCL/Gt)組相比，MSC經(jīng)與(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)血管支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)48 h后，其G0/1期比例降低，S、G2/M期比例均升高(見表5)。S、G2/M 期比例越高，表明細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞增殖較快， (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)血管支架與間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞相容性更優(yōu)。

表5 血管支架浸提液對間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Tab. 5 The effect of vascular scaffold extract on MSC cell cycle

3 討論

血管支架材料的體內(nèi)降解行為不同于體外降解, 生理環(huán)境中存在更有活性的方式使高分子材料分解，這里面涉及到酶，在植入材料周圍存在有多種酶。細(xì)胞的遷移模式會受到支架表面形貌的影響，細(xì)胞通過阿米巴樣運動遷移進入納米纖維支架，合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分和有關(guān)酶蛋白，酶蛋白會在降解過程中發(fā)揮作用，致使降解行為出現(xiàn)差異。研究顯示，在植入早期血管支架降解速度相對較慢，支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)無變化。植入后2～4周，周圍纖維組織包裹血管支架纖維，發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞不斷浸潤血管移植物。隨著時間的持續(xù)，炎癥反應(yīng)有所降低，炎性細(xì)胞減少，周圍纖維組織深入到支架材料的纖維空隙內(nèi)部，與血管材料緊密結(jié)合，血管支架組織界面良好，組織相容性優(yōu)異。植入后8～12周，血管支架材料降解加速。HE染色表明，在體內(nèi)降解過程中，未發(fā)現(xiàn)異物反應(yīng)和不良刺激反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)肉芽腫或組織壞死，說明支架材料降解速率適宜，細(xì)胞毒性小，滿足體內(nèi)血管再生的要求，該雙層血管支架能用作組織工程血管支架。但是，還需要深入研究該雙層血管支架對新生組織修復(fù)過程的影響。

血管支架的生物相容性，是指將其移植到體內(nèi)后血管支架本身及其降解后產(chǎn)物無毒性，不會導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)和炎性反應(yīng)，促進細(xì)胞黏附和增殖[15-16]。一般情況下，天然生物材料生物相容性良好，人工合成材料的生物相容性可以用多種辦法加以改善，比如連接生長因子、添加一定量的天然生物材料、進行納米改性等[17]。支架材料與種子細(xì)胞相互作用關(guān)系密切，支架是信號因子和種子細(xì)胞的載體，將其輸送到合適的動物體內(nèi)部位，同時支持組織工程血管的形成。通過將種子細(xì)胞和血管支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)，可評價支架和細(xì)胞的相互作用機制[18]。此方法重現(xiàn)性良好、簡單快速、直觀性強，廣泛應(yīng)用于評價血管支架的細(xì)胞相容性。Meng等[17]研究表明，納米纖維支架三維結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞的存活和增殖具有重要的影響。與培養(yǎng)基對照組相比, 在直徑300 nm左右的纖維支架上培養(yǎng)8～13 d后, 有活性的成纖維細(xì)胞數(shù)量增加了3倍。

Rayatpisheh等[19]通過靜電紡絲構(gòu)建了有向的PCL支架，平滑肌細(xì)胞種植試驗表明細(xì)胞能沿著纖維的方向呈現(xiàn)有方向性和有形狀的增殖遷移。Hardy等[20]基于絲素蛋白制備的三維支架，能有效促進間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Zhang等[21]制備的中空絲素蛋白材料支架，能有效促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、內(nèi)皮生長因子的分泌和毛細(xì)管管狀結(jié)構(gòu)的形成。本研究制備的蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架, 從掃描電鏡結(jié)果能看到表面光滑的不定向纖維，纖維的直徑在100～200 nm之間, 分布均勻, 并且具有較高的比表面積和孔隙率。骨髓MSC集落生成率和平均集落面積的實驗結(jié)果表明，蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架能有效促進干細(xì)胞的增殖能力。

細(xì)胞毒性實驗作為一種評價組織工程支架與細(xì)胞的生物相容性的手段，簡單方便，能準(zhǔn)確地確定支架材料的毒性強度和細(xì)胞相容性優(yōu)劣。六級毒性評級標(biāo)準(zhǔn)為：RGR≥100%為0級，75%～99%為I級，50%～74%為II級，25%～49%為III級，1%～24%為IV級，0為V級。毒性為0～I級的生物材料可視為無細(xì)胞毒性。王宏昕等[22]制備的pNSR16/PVA 支架經(jīng)浸提后，獲得的浸提液與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，顯示 pNSR16/PVA 支架材料的細(xì)胞毒性為0 級，而細(xì)胞在4 d后可覆蓋支架材料表面，并呈一定方向排列。本研究制備的雙層血管支架的細(xì)胞毒性普遍在I級或0級，分析認(rèn)為雙層血管支架含有pNSR16，pNSR16在構(gòu)建時其內(nèi)部結(jié)構(gòu)含有RGD三肽，RGD三肽作為細(xì)胞表面整合素受體的一種配體，能有效促進細(xì)胞在蛛絲蛋白支架材料表面的黏附，因而pNSR16具有良好的細(xì)胞相容性，細(xì)胞黏附的實驗結(jié)果也進一步證明了pNSR16促進細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖。

臺盼藍染色用來評價細(xì)胞膜的完整性。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，能夠排斥臺盼藍；而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性喪失，通透性增加，細(xì)胞被臺盼藍染成藍色，很容易與活細(xì)胞區(qū)分。細(xì)胞被臺盼藍染色后，應(yīng)用顯微鏡鏡下計數(shù)活細(xì)胞或拍照后計數(shù)。臺盼藍染色試驗發(fā)現(xiàn)，不同支架浸提液培養(yǎng)條件下對間充質(zhì)干細(xì)胞的臺盼藍拒染率并無影響。從前面的實驗中發(fā)現(xiàn)，(PCL/CS)/(PCL/Gt)對間充質(zhì)干細(xì)胞的集落生成能力、分裂指數(shù)和生長曲線有一定影響，但是對臺盼藍拒染率并無影響，這說明(PCL/CS)/(PCL/Gt)可能影響細(xì)胞的增殖，但是對細(xì)胞卻無毒性，只是對細(xì)胞的增殖速度產(chǎn)生影響，因而基本上沒有出現(xiàn)死亡細(xì)胞。但是，筆者也發(fā)現(xiàn)，在(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架浸提液培養(yǎng)的條件下，干細(xì)胞臺盼藍拒染率略小于(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架。

4 結(jié)論

雙層血管支架在整個實驗周期內(nèi)都在不斷降解，在12周時，血管支架有明顯的降解，其中(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt) 支架降解程度更深，已經(jīng)降解了20.3%，支架纖維斷裂嚴(yán)重。(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架的降解速度明顯快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架，而后者在12周時僅降解了13.2%。在蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架浸提液培養(yǎng)條件下，大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面積和分裂指數(shù)都顯著高于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架浸提液的情況。細(xì)胞在支架材料浸提液中的生長曲線顯示，在1～2 d 時細(xì)胞增殖較慢，2～5 d時細(xì)胞迅速增殖，5～7 d時細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期，這表明細(xì)胞增殖狀況較好。血管支架材料毒級均低于1 級，各材料浸提液均不顯示細(xì)胞毒性。在血管支架浸提液培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞的臺盼藍拒染率基本上高于95%，接近于對照組，兩者在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異性。MSC與蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)48 h后，其G0/1期比例降低，S、G2/M期比例均升高。使用靜電紡絲法制備的蛛絲蛋白復(fù)合材料小直徑血管支架是可行的，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

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Study on theinvivoDegradation andinvitroBiocompatibility of Spider Silk Protein Composite Material Small Diameter Vascular Scaffold

Zhao Liang1,2Chen Hongli1Wang Mian1Xie Liqin1Xu Yanli1He Meng1Feng Zhiwei1Li Min1*

1(CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou350108,China)2(CollegeofLifeSciencesandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,Henan,China;KeyLaboratoryofBiomedicalMaterials，XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,Henan,China)

The in vivo degradation performance and in vitro biocompatibility of small diameter vascular scaffold made of spider silk protein composite material was evaluated for clinical application. RGD-recombinant spider silk protein (pNSR16), polycaprolactone (PCL), chitosan (CS) and gelatin (Gt) were blended to prepare spider silk protein composite material (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt) that was used for the fabrication of small diameter vascular scaffold using electrospinning technique. The scaffold was implanted into the muscle tissue of SD rat leg. The degradation property in vivo was evaluated by HE staining. The effect of scaffold extract on the mesenchymal stem cell colony formation, mitotic index, trypan blue dye exclusion rate, cytotoxicity and cell cycle were analyzed to evaluate the biocompatibility of the scaffold. During the implantation period the scaffold degraded continually, showing obvious fiber broken. The weight loss rate was 20.3% after 12 weeks of implantation, and the degradation rate was significantly higher than that of (PCL/CS)/(PCL/Gt) scaffold that degraded 13.2% after 12 weeks of implantation. When cultivated with of the extract of (pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt) scaffold, the colony formation rate, average colony area and mitotic index of rat bone marrow MSC were significantly higher than that with the extract of (PCL/CS)/(PCL/Gt) scaffold. The toxicity level of scaffold was less than level 1. The trypan blue dye exclusion rate for MSCs was greater than 95% in the extract of the composite scaffold,. After 48 h incubation with the extract, G0/1phase ratio of cells was reduced, S and G2/M phase ratio was increased. The in vivo degradation and in vitro biocompatibility of scaffold made of spider silk protein composite material were acceptable, showing certain feasibility in clinical application.

tissue engineering blood vessel; spider silk protein composite material small diameter vascular scaffold; degradation in vivo; in vitro biocompatibility

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 01.011

2014-12-17， 錄用日期:2015-06-08

國家自然科學(xué)基金(81401519); 國家自然科學(xué)基金(U1304819); 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金(2014QN138)

R318.5

A

0258-8021(2016) 01-0088-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: mli@fjnu.edu.cn