姜 力 陳思原 王園園 王淑芳

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300071)

小口徑人工血管構(gòu)建研究現(xiàn)狀與展望

姜 力 陳思原 王園園 王淑芳*

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300071)

人工血管在臨床上的需求不斷增長，但問題也較普遍，特別是小口徑人工血管植入后再狹窄率較高，其低通暢率限制了其臨床應(yīng)用。本文介紹了小口徑人工血管構(gòu)建研究的國內(nèi)外發(fā)展動(dòng)態(tài)，包括人工血管支架的制備及修飾方法，細(xì)胞及細(xì)胞外微環(huán)境在人工血管構(gòu)建中的作用，并對(duì)小口徑人工血管構(gòu)建面臨的問題及研究方向進(jìn)行了討論與展望。

人工血管；生物活性物質(zhì)；血管構(gòu)建；再狹窄

引言

全世界醫(yī)療領(lǐng)域?qū)ρ芴娲锏男枨蟪掷m(xù)增長。血管病變，如動(dòng)脈粥樣硬化，可引起血管內(nèi)膜層下斑塊的積累，造成下游組織血流量減少，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致患者死亡[1]。美國每年有140萬的患者需要移植血管，花費(fèi)超過250億美元[2]。

血管移植物一般分為3種：自體血管、同種異體血管和合成血管。其中自體血管最為合適，但數(shù)量有限，會(huì)給患者造成機(jī)體損傷；同種異體血管易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；合成血管則受限于支架直徑大小。合成高分子材料，即由膨體聚四氟乙烯(ePTFE)[3]或滌綸(Dacron)等材料制成的血管支架，已成功應(yīng)用于大口徑血管，但小口徑血管(直徑≤6 mm)至今尚未得到成功應(yīng)用。

構(gòu)建小口徑人工血管的主要手段是組織工程(tissue engineering)，即應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理來構(gòu)建新型的組織工程人工血管(tissue engineered vascular grafts，TEVGs)[4-7]。傳統(tǒng)的組織工程血管構(gòu)建方法包括支架、種子細(xì)胞和生物反應(yīng)器三要素，需要在體外將細(xì)胞種植于支架上，培養(yǎng)一定時(shí)間后植入體內(nèi)。另一種思路被稱為“誘導(dǎo)性組織工程血管”，也叫“原位再生型組織工程血管”，即單純依賴血管材料，使其在體內(nèi)捕捉相關(guān)細(xì)胞(如內(nèi)皮祖細(xì)胞)或依靠血管細(xì)胞的遷移和分化來實(shí)現(xiàn)血管再生。

影響血管再生的因素是多方面的，包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞來源、材料的細(xì)胞化等。細(xì)胞的來源及其與血管功能重建之間的關(guān)系一直為人們所關(guān)注。對(duì)血管支架的研究還包括用支架模擬細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的成分和結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞的募集、黏附、增殖、分化及新組織的再生[6, 8]。這些研究為構(gòu)建低免疫原性，抗血栓且具有生物反應(yīng)性和生理功能的人工血管奠定了基礎(chǔ)。此外，為進(jìn)一步滿足臨床需求，還需降低TEVGs的制備成本[9]。

1 人工血管的制備及修飾

人體天然血管壁由內(nèi)膜、中膜和外膜[10]組成(見圖1)。三層膜分別由不同的細(xì)胞及組織構(gòu)成，具有不同的功能(見表1)。血管壁中的彈力膜使三層膜相互分離。

圖1 血管壁結(jié)構(gòu)[10] Fig.1 Schematic representation of distinct layers of arterial wall[10]

血管結(jié)構(gòu)細(xì)胞及組織功能內(nèi)膜 內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells,ECs)防凝血、感染和炎癥,調(diào)節(jié)氣體和分子的交換等中膜 平滑肌細(xì)胞(smoothmusclecells,SMCs)、彈性纖維維持血管彈性外膜 成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞,膠原、彈性纖維增加血管剛性

1.1 人工血管的基本要求及血管支架的構(gòu)建方法

為適應(yīng)體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，血管支架要滿足以下幾個(gè)方面的要求：

1)力學(xué)特性：具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，在體內(nèi)能承受一定的壓力而不變形。

2)可降解性：體內(nèi)降解速率與組織再生速度匹配。

3)生物相容性：不引起炎癥反應(yīng)和毒性反應(yīng)。

4)表面生物活性：利于細(xì)胞的黏附、生長和增殖。

5)合適的多孔結(jié)構(gòu)[11]。

具體要求包括：人工血管的爆破壓不小于1 700 mmHg，對(duì)生理循環(huán)的疲勞耐受最少達(dá)到30 d(體外實(shí)驗(yàn))[12]，植入期間口徑不發(fā)生明顯的擴(kuò)張，可自體內(nèi)皮化等。

但通常情況下，小口徑人工血管，在植入后幾個(gè)月之內(nèi)，由于與天然血管的順應(yīng)性不匹配，會(huì)產(chǎn)生免疫排斥、血栓、動(dòng)脈瘤和內(nèi)膜增生等問題[13-16]。

制備血管支架的技術(shù)包括相分離、自組裝和靜電紡絲等[17]。其中，靜電紡絲技術(shù)(簡稱“電紡”)由于材料來源廣泛且制備的纖維直徑近似于ECM中的纖維，得到廣泛應(yīng)用。電紡纖維可誘導(dǎo)細(xì)胞定位和胞外基質(zhì)蛋白的聚集，為細(xì)胞的黏附和生長提供適宜的環(huán)境。電紡材料可分為兩類：天然高分子和合成高分子(見表2)。兩種材料具有不同的特點(diǎn)，互補(bǔ)性很強(qiáng)。理想的復(fù)合纖維支架應(yīng)在具備合適的力學(xué)性能的同時(shí)具有生物活性[18]，使其能夠適應(yīng)體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。

表2 電紡材料種類及特點(diǎn)Tab.2 Types and characteristics of electrospinning materials

完整內(nèi)皮層的形成對(duì)TEVGs功能的正常化非常重要。為實(shí)現(xiàn)小口徑TEVGs內(nèi)皮化，通常需要在體外預(yù)先種植ECs，并借助生物反應(yīng)器進(jìn)行組織培養(yǎng)?？刹捎米越M裝細(xì)胞膜片技術(shù)來構(gòu)建具有完整ECs層的TEVGs。該技術(shù)過程是：先在基質(zhì)表面種植并培養(yǎng)血管細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞和SMCs)，然后將形成的細(xì)胞膜片包裹在圓軸上(見圖2)[19]，制成由成纖維細(xì)胞層包裹著平滑肌細(xì)胞層的血管三維支架，最后在管腔內(nèi)接種ECs。

圖2 從細(xì)胞層到三維血管的制備過程示意圖[19] Fig.2 Schematic illustrating the process of creating a 3D vascular conduit from a 2D cell layer[19]

基于膜片技術(shù)的TEVGs還首次被應(yīng)用于臨床[20]。該技術(shù)可使用患者自身血管細(xì)胞，避免了植入后的免疫排斥反應(yīng)。但是體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間過長(6～8周)，過程復(fù)雜，無法及時(shí)滿足患者的需求。

此外，人們還嘗試?yán)锰烊坏慕M織構(gòu)建TEVGs。如將去細(xì)胞小腸黏膜下層(small intestinal submucosa，SIS)用作血管替代物。SIS由膠原、纖維蛋白、蛋白多糖和黏多糖等構(gòu)成，力學(xué)性能優(yōu)良。其缺點(diǎn)是有可能攜帶有病原菌[21]，存在生物相容性和安全性問題。

為促進(jìn)宿主細(xì)胞的浸潤和生長，合成材料的TEVGs還需具備可生物降解的特性。使其在新生血管形成過程中被逐步降解吸收；降解同時(shí)留出空間，便于細(xì)胞浸潤生長。依據(jù)在體外是否脫去細(xì)胞，經(jīng)典的可降解TEVGs植入策略有兩種[22-23]。

第1種方法是先從患者靜脈壁上分離細(xì)胞并在體外擴(kuò)增，接著種植到可生物降解支架上，然后將支架連同細(xì)胞植入患者體內(nèi)。支架會(huì)在幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)降解并被機(jī)體所吸收。

第2種方法是在可降解支架上培養(yǎng)細(xì)胞，得到細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)蛋白后再脫去細(xì)胞和材料并冷凍保存。使用時(shí)根據(jù)需要可直接植入人體(直徑不小于6 mm)或在基質(zhì)上種植接受者的內(nèi)皮細(xì)胞后再植入(直徑3～4 mm)。

以上方法均體現(xiàn)了組織工程在血管制備方面的優(yōu)勢，利用了天然和合成材料各自的優(yōu)點(diǎn)，但問題同樣存在。例如，細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)間較長，成本較高，易受到細(xì)菌感染等。

1.2 血管支架的修飾

為增強(qiáng)血管支架的表面活性及生物相容性(如抗凝血)，需要對(duì)其進(jìn)行一定程度的修飾。支架材料表面修飾的方法有很多種，如共價(jià)修飾(抗原-抗體、蛋白與蛋白間的親和作用等)及非共價(jià)修飾(生物活性分子的吸附、涂層等)。其中生物活性分子(如肝素、生長因子、蛋白多肽、殼聚糖、膠原等)因其優(yōu)良的生物相容性及與細(xì)胞相互作用的能力，在人工血管構(gòu)建中得到廣泛關(guān)注。

Sato等將絲素蛋白涂覆在支架上以改善生物相容性[24]。還有實(shí)驗(yàn)室使用殼聚糖-膠原蛋白-熱塑性聚氨酯納米纖維支架，通過戊二醛蒸汽交聯(lián)[25]以制得血管支架。該支架易彎曲，可承受高強(qiáng)度的拉力，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的細(xì)胞相容性。

Soletti等將去細(xì)胞的聚氨酯支架作為動(dòng)脈介入支架，植入大鼠體內(nèi)[26]。在支架的內(nèi)側(cè)覆有抗凝血的甲基丙烯酰氧乙基和磷脂共聚物。24周后與無磷脂的支架相比，涂有磷脂的支架上血小板黏附明顯減少，通暢性得到改善。

Wise等利用電紡制造了一種重組人類彈性蛋白原/PCL支架[13]。將10% 總濃度的彈性蛋白原和PCL溶于六氟異丙醇，通過調(diào)整支架的力學(xué)性能來模擬人內(nèi)乳動(dòng)脈的彈性模量、順應(yīng)性、滲透性和爆破壓。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，與無彈性蛋白的支架相比，彈性蛋白/PCL支架的血小板黏附有所減少且內(nèi)皮化程度增加。結(jié)果顯示彈性蛋白原的加入顯著促進(jìn)了ECs的黏附和增殖。

此外，天然血管中ECs能夠持續(xù)釋放出一氧化氮(nitric oxide，NO)，其具有舒張血管、抗血液凝集的作用?？捎肗O供體或催化劑修飾血管支架，模擬原生血管的功能，減少血管再狹窄的發(fā)生[27-29]。作者所在實(shí)驗(yàn)室[30]制備了一種新型血管支架，即在電紡PCL材料上固載含有機(jī)硒催化劑的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，SePEI)，與透明質(zhì)酸層層自組裝，同時(shí)在最外層連接REDV多肽。該支架可顯著促進(jìn)ECs的黏附，實(shí)現(xiàn)支架在原位的快速內(nèi)皮化，為構(gòu)建具有良好抗血栓性能和長期通暢率的人工血管提供了一種新思路。

2 細(xì)胞及支架結(jié)構(gòu)在人工血管構(gòu)建中的作用

理想的TEVGs應(yīng)能夠“現(xiàn)取現(xiàn)用”(off-the-shelf)，即人工血管產(chǎn)品可像藥物一樣隨時(shí)取用。在原位組織工程(誘導(dǎo)性組織工程)中，無細(xì)胞支架作為生物反應(yīng)器被植入患者體內(nèi)，同時(shí)在血管組織形成的過程中材料會(huì)逐步降解，在體內(nèi)通過支架材料對(duì)血管新生和細(xì)胞分化、增殖的誘導(dǎo)，促進(jìn)組織的修復(fù)與再生，最終形成由患者自身細(xì)胞和組織所構(gòu)成的新生血管。

2.1 血管重建中的細(xì)胞及細(xì)胞因子

人工血管的植入會(huì)使宿主組織產(chǎn)生一定程度的免疫反應(yīng)，血管重建中也涉及到一系列的細(xì)胞及細(xì)胞因子(見表3)。

表3 參與血管重建的細(xì)胞及細(xì)胞因子Tab.3 Cells and cytokines in vascular remodeling

支架植入后，其與天然血管的縫合處會(huì)形成復(fù)雜的炎癥環(huán)境，受損組織會(huì)釋放出細(xì)胞因子。特別是由環(huán)境缺氧而引發(fā)的反應(yīng)，其釋放的趨化因子會(huì)調(diào)動(dòng)周圍細(xì)胞補(bǔ)充到受損的組織部位。

接著，細(xì)胞因子會(huì)刺激細(xì)胞黏附分子(如整合素)的表達(dá)，使細(xì)胞黏附到鄰近受損區(qū)域的ECM和內(nèi)皮上。同時(shí)，釋放到周圍環(huán)境中的細(xì)胞因子和自由基，刺激鄰近的ECs、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴隨著基質(zhì)降解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放。巨噬細(xì)胞(macrophages)會(huì)從M1型(炎癥型)轉(zhuǎn)化為M2型(抗炎型)，其中，M2型巨噬細(xì)胞與炎癥修復(fù)相關(guān)[31]。

此外，外周細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(messenchymal stem cells，MSCs)也會(huì)受被高濃度趨化因子吸引，沿濃度梯度遷移并產(chǎn)生第二信使，進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥和修復(fù)過程[31]。

組織修復(fù)中的主要信號(hào)蛋白包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子b(PDGF b)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α (SDF1α)。其中，SDF1α是在組織受傷和缺氧環(huán)境(如骨髓中)高度表達(dá)的趨化因子，其高度保守，在不同物種和多種組織(如腦、腎、肺、心和血管)中表達(dá)。具有吸引祖細(xì)胞和修復(fù)損傷組織的作用。在TEVGs中，可利用生物活性因子在材料中的傳遞，幫助血管形成新的組織。例如，人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SDF1α的傳遞會(huì)加強(qiáng)組織的修復(fù)[31]。

炎癥反應(yīng)在TEVGs重建過程中起重要作用[32]。該實(shí)驗(yàn)在可生物降解的滌綸支架上種植人的骨髓細(xì)胞，接著植入小鼠體內(nèi)。骨髓細(xì)胞和滲入支架的單核/巨噬細(xì)胞會(huì)釋放出多種血管生成素和生長因子，隨后，血液中的祖細(xì)胞(progenitor cell)及鄰近的血管成熟細(xì)胞(SMCs或ECs)向支架方向遷移和增殖；最后支架中的細(xì)胞組織形成成熟的血管結(jié)構(gòu)。隨著支架的降解，在原位會(huì)形成新生血管。

除炎癥反應(yīng)外，研究顯示，血管內(nèi)膜增生中也有多種類型的細(xì)胞參與，包括SMCs、成纖維細(xì)胞、循環(huán)祖細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞[33]。

在血管重建中，血管內(nèi)層和中層的形成與再生非常重要。這將影響到新生血管是否具備基本的血管功能。

血管內(nèi)層是由連續(xù)的單層ECs組成的，作為血管壁和血液之間的屏障，ECs能夠合成并分泌調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的因子(如NO)，調(diào)節(jié)其表型，從而抑制其過度增殖。此外，血管的ECs還通過分泌各種血管活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管舒張、生長和重塑。

血管中層主要由SMCs構(gòu)成，其與血管的舒張收縮有關(guān)。通常情況下血管的SMCs表現(xiàn)為收縮型，但在病理狀態(tài)，如在動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等疾病中，SMCs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即由收縮型向增殖型轉(zhuǎn)化，從血管壁中層遷入內(nèi)膜并大量增殖，最終導(dǎo)致血管壁增厚，血管腔變窄。

2.2 人工血管的細(xì)胞來源

對(duì)于體外TEVGs構(gòu)建而言，如何選擇ECs和SMCs來源是TEVGs的一個(gè)難點(diǎn)[4]。從患者體內(nèi)分離的成熟細(xì)胞是最佳來源，但難以獲得，而且在年長患者體內(nèi)細(xì)胞的增殖能力有限，無法滿足血管細(xì)胞的增殖。在具有免疫原性低、增殖迅速及能分化為成熟細(xì)胞的干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)之后，人們逐漸傾向于在TEVGs的制備中使用干細(xì)胞。Krawiec等詳述了骨髓單核干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用，該應(yīng)用主要集中于脫細(xì)胞支架或非電紡材料[34]。

而對(duì)于體內(nèi)TEVGs構(gòu)建而言，血管再生的細(xì)胞來源觀點(diǎn)不一，包括骨髓和外周血、相鄰血管及血管外部組織。只有認(rèn)清細(xì)胞的來源，才能相對(duì)應(yīng)地設(shè)計(jì)TEVGs的結(jié)構(gòu)。人們也嘗試設(shè)計(jì)了不同的支架來驗(yàn)證誘導(dǎo)性組織工程血管細(xì)胞的主要來源。

與人體血管移植后的情況不同，在小動(dòng)物體內(nèi)，血管再生易受到吻合處的細(xì)胞向內(nèi)生長的干擾。為此，Talacua等設(shè)計(jì)了一種新的大鼠模型，該模型可通過Gore-Tex(ePTFE)的遮蓋，抑制血管鄰近組織的向內(nèi)生長[35]。他們的實(shí)驗(yàn)說明，功能化的血管可以由血液攜帶的細(xì)胞在炎癥反應(yīng)下原位形成。實(shí)驗(yàn)中，將填充有纖維蛋白的PCL電紡支架予以改造，在其兩端分別接上一段性別錯(cuò)配的動(dòng)脈片段(見圖3)，然后將其植入大鼠的腹主動(dòng)脈。1～3個(gè)月后，超過90%的浸潤細(xì)胞來源于血液，3個(gè)月后，形成了由SMCs、彈性纖維和具有方向性的膠原基質(zhì)構(gòu)成的血管中層，以及融合的ECs構(gòu)成的血管內(nèi)層。從而證明了循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞在原位組織工程血管構(gòu)建中的潛力。

圖3 帶有雄性大鼠動(dòng)脈片段的遮蓋支架[35] Fig.3 The sex-mismatched shielded graft[35]

近期研究顯示，新組織來源于TEVGs周圍向內(nèi)生長的血管細(xì)胞及鄰近血管中的細(xì)胞，即透壁微血管的向內(nèi)生長[36-37]。這與過去人們對(duì)TEVGs中出現(xiàn)的細(xì)胞主要來自于血液中的看法有所不同。

Hibino等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持再生血管的ECs或SMCs來源于相鄰的血管，而不是源于骨髓[36]。他們利用小鼠骨髓再造模型，將轉(zhuǎn)基因雄性小鼠來源的骨髓細(xì)胞移植到雌性小鼠骨髓中，制備嵌合體小鼠，以研究材料中再生細(xì)胞的來源問題；此外，他們還使用一段雄鼠的天然靜脈血管(Male IVC)與TEVGs連接后移植到雌鼠體內(nèi)，考察細(xì)胞的遷移是否來源于相鄰血管組織。

與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的是，Pennel等認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞主要來源于支架外側(cè)透壁微血管的向內(nèi)生長[37]。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種支架來驗(yàn)證此觀點(diǎn)，即用不同孔隙大小的支架相結(jié)合以考察內(nèi)皮細(xì)胞的來源。同時(shí)通過延長支架的長度(環(huán)狀支架)，避免相鄰天然血管細(xì)胞向內(nèi)生長對(duì)結(jié)果造成的干擾。研究發(fā)現(xiàn)，在排除了動(dòng)物模型中吻合口處內(nèi)皮細(xì)胞的過快生長所造成的干擾后，支架中間的ECs主要來源于血管周圍的透壁微血管，這使得他們的結(jié)論更接近于人體新生血管的生成過程。

筆者認(rèn)為，誘導(dǎo)性人工血管再生過程中細(xì)胞的來源與所構(gòu)建的血管支架材料種類、支架的結(jié)構(gòu)(孔徑大小、孔隙率和致密程度)以及材料的順應(yīng)性、生物相容性等都有關(guān)系；血管材料不同，材料的修飾方法和負(fù)載生物活性因子不同，再生血管的細(xì)胞主要來源也會(huì)有所不同。

2.3 支架結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為的影響

細(xì)胞的分化、增殖和胞外基質(zhì)的產(chǎn)生受到生物體內(nèi)微環(huán)境的力學(xué)強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)的影響。支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)(如纖維直徑和取向、支架的三維結(jié)構(gòu)、孔隙大小、表面形貌等)會(huì)對(duì)細(xì)胞的這些行為產(chǎn)生相應(yīng)的作用。

自然狀態(tài)下的ECM呈三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中的結(jié)構(gòu)蛋白和多糖纖維直徑均為納米級(jí)50～500 nm[16]。新的電紡/網(wǎng)(electro-spinning/netting，ESN)技術(shù)[38-41]可制備出蜘蛛網(wǎng)般粗細(xì)的納米級(jí)纖維網(wǎng)(直徑<50 nm)[40]，使其纖維更近似于天然血管的ECM。

支架中纖維的取向?qū)S持血管的正常功能起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)組織或器官(如坐骨神經(jīng)、心臟、肌腱和血管)中的ECM具有各向異性的結(jié)構(gòu)[8]。但是電紡制成的纖維是隨機(jī)取向的，這與天然的ECM有所差別。因此需要制備均一取向的電紡支架來模擬天然纖維，引導(dǎo)細(xì)胞的遷移和伸展[8, 42]。不同類型的電紡纖維支架(如軸向均一和徑向均一)在細(xì)胞形態(tài)形成、細(xì)胞遷移和分化過程中均產(chǎn)生了較好的影響[43-45]。

Zhu等制備出一種雙層血管支架——內(nèi)層用濕法紡絲制成圓周取向的纖維，影響SMCs的排列方向；外層通過靜電紡絲制成隨機(jī)取向的納米纖維，用于加強(qiáng)支架的力學(xué)性能及防止植入后的滲血(見圖4)[46]。3個(gè)月的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SMCs類似于天然血管中的細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還證明了圓周取向的纖維還可調(diào)節(jié)SMCs的表型——由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變。對(duì)新生血管的生理功能測試發(fā)現(xiàn)其對(duì)血管舒張和收縮劑均有一定程度的敏感性，說明該新生血管具備了一定的生理功能。

圖4 軸向取向人工血管制備示意圖[46](上圖為軸向取向血管構(gòu)建設(shè)計(jì)假說，下圖為制備過程)Fig.4 Schematic illustrating the fabrication process of circumferentially aligned TEVG[46](The above showed the hypothesis of circumferentially aligned TEVG, the bottom showed the fabrication process)

具有三維復(fù)雜多孔結(jié)構(gòu)的支架能夠更好地模擬天然ECM，而通常制備的纖維結(jié)構(gòu)是二維的，在三維組織中的應(yīng)用有限[47-48]。利用電紡技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合，可以制備出管狀和螺旋狀結(jié)構(gòu)的納米纖維支架。例如，Centola等開發(fā)了一種結(jié)合熔融沉積成型的電紡新技術(shù)，通過螺旋盤繞的PCL來加強(qiáng)和改善血管支架的力學(xué)性能[49]。實(shí)驗(yàn)中，種植到支架上的人MSCs分化為ECs。

為進(jìn)一步模仿天然血管的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，人們采用不同的方法制備出多層支架。例如，通過在小直徑接收棒(4 mm)上混紡聚二氧六環(huán)酮(PDO)和蛋白，可制得具有三層結(jié)構(gòu)的支架(長20 cm、內(nèi)徑4 mm)[50]。此外，該種支架還可用卷起電紡纖維膜的方法制得[51]。 Ju等用共紡技術(shù)制備了PCL/膠原的雙層支架，外層用較大孔隙加強(qiáng)SMCs的滲入，內(nèi)層通過較小的孔隙來促進(jìn)ECs的黏附[52]。他們還通過調(diào)節(jié)纖維直徑來控制支架的微結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性。

除了對(duì)支架纖維直徑的調(diào)節(jié)，還可通過支架纖維表面的特殊形貌(如細(xì)微纖維和紋溝)來調(diào)控所黏附細(xì)胞的排列分布。Uttayarat等用結(jié)合旋轉(zhuǎn)投絲的電紡方法，在聚氨酯支架(長48 mm，內(nèi)徑4 mm)上形成了細(xì)微的纖維和紋溝[53]。他們研究了ECs在這些微圖案化表面的定位及細(xì)胞因子(胞間黏附因子1，ICAM-1)的形成，并發(fā)現(xiàn)這些微圖案能促進(jìn)ECs在支架上的黏附和生長[53]。

3 結(jié)語

盡管小口徑TEVGs的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但未來仍會(huì)面臨著植入后感染、血管再狹窄和血栓等風(fēng)險(xiǎn)。解決這一系列問題涉及多個(gè)學(xué)科的研究領(lǐng)域，如材料學(xué)、組織工程學(xué)和生物學(xué)等學(xué)科。TEVGs的快速內(nèi)皮化是其成功應(yīng)用的關(guān)鍵之一。由于內(nèi)皮化不足，植入后的血管再狹窄是TEVGs臨床手術(shù)的重要難題，有10%～15% 的血管再狹窄發(fā)生于病人的冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和外周動(dòng)脈的血管再生過程中[54]。

TEVGs的研究還涉及諸多的因素，例如植入前材料的選擇與修飾，植入后引起的組織炎癥反應(yīng)分析，特別是人工血管重建過程中涉及的細(xì)胞的來源問題，這關(guān)系到支架的設(shè)計(jì)和制備。細(xì)胞的遷移、分化及由此產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)及其分子機(jī)制還有待深入的探究。

此外，需要對(duì)誘導(dǎo)性組織工程血管進(jìn)行長期的監(jiān)測和更嚴(yán)格的功能評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，最終實(shí)現(xiàn)小口徑TEVGs的商品化，滿足患者的不同需求。

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Progress and Prospect of Small-Diameter Vascular Grafts Research

Jiang Li Chen Siyuan Wang Yuanyuan Wang Shufang*

(KeyLaboratoryofBioactiveMaterialsforMinistryofEducation,CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

There is a growing demand of vascular grafts for clinical treatment, the problem is also general, and especially the small-diameter vascular’s incidence rate of restenosis is high after implantation. Tissue engineering has been applied in the fabrication of vascular grafts, the bionic and tissue regeneration. Tissue engineered vascular graft have been developed as alternative to autografts, but the low patency limit their clinical application. In this review, we introduced the latest develepment of vascular grafts in both domestic and foreign research, including the fabrication and modification of artificial vascular scaffolds, the role of cellular and extracellular microenvironment in artificial vascular reconstruction. We also discussed the problems and prospects of the directions for the future research of tissue engineered vascular grafts.

vascular graft; bioactive substances; vascular engineering; restenosis

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 03.014

2015-12-18， 錄用日期:2016-03-15

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB725204)；天津市自然科學(xué)基金(13JCYBJC249000)；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目PCSIRT(IRT13023)

R318

A

0258-8021(2016) 03-0357-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:wangshufang@nankai.edu.cn