駱歡歡，趙昉，張奉學(xué)，劉妮

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞分泌作用的影響

駱歡歡，趙昉，張奉學(xué)，劉妮

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

目的：觀察苦杏仁苷對肝星狀細(xì)胞（HSC）-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA、Ⅲ型膠原mRNA活化，以及Ⅰ型膠原、透明質(zhì)酸等分泌的影響。方法：將HSC-T6細(xì)胞系分為以下4組，每組細(xì)胞均置于6孔板中。4組分別為：正常組，苦杏仁苷高劑量（10-3mol/L）組，苦杏仁苷中劑量（10-4mol/L）組和苦杏仁苷低劑量（10-5mol/L）組。RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA、Ⅲ型膠原mRNA，酶聯(lián)免疫法檢測HSC-T6Ⅰ型膠原的分泌，放射免疫法檢測透明質(zhì)酸的含量。結(jié)果：各苦杏仁苷組對Ⅰ型膠原基因表達(dá)均有明顯的抑制作用，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以苦杏仁苷中劑量組最為明顯，苦杏仁苷高劑量組次之，苦杏仁苷低劑量組再次之。提示苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，但這種抑制作用或并不與劑量成正比。各苦杏仁苷組對Ⅲ型膠原基因表達(dá)均有明顯的抑制作用，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以苦杏仁苷高、中劑量組明顯，苦杏仁苷低劑量組次之。24 h時(shí)，Ⅰ型膠原的OD450值苦杏仁苷各組與正常組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。72 h時(shí)，苦杏仁苷各組與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但苦杏仁苷各組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常組透明質(zhì)酸分泌曲線與苦杏仁苷低劑量組稍有重疊，位置較苦杏仁苷高、中劑量組分泌曲線高。但24 h、72 h時(shí)，4組透明質(zhì)酸含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。96 h時(shí)，苦杏仁苷高、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），其余組間比較，差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞活化后的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌功能有明顯的抑制作用，此可能是其抗肝纖維化的主要機(jī)制之一。

肝纖維化；肝星狀細(xì)胞（HSC）；苦杏仁苷；分泌

肝纖維化的發(fā)展是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增加且同時(shí)降解減少的結(jié)果。肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，HSC的分泌作用導(dǎo)致ECM大量合成。本實(shí)驗(yàn)觀察苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA、Ⅲ型膠原mRNA活化，以及Ⅰ型膠原、透明質(zhì)酸等分泌的影響。報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HSC-T6細(xì)胞株，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒室凍存復(fù)蘇。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 苦杏仁苷購自中國藥品生物制品檢定所，每支約20 mg，分子量457.4，編號：110820-200403。在實(shí)驗(yàn)前對苦杏仁苷水溶物進(jìn)行低溫間歇滅菌，-20℃保存?zhèn)溆?。臨時(shí)配成所需的藥物溶度，且用5%血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋。即用DMEM培養(yǎng)基溶解藥物為20 mmol/L母液濃度后，以微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液HEPEPS購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季清生物制品公司；L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶均購自Sigma公司；EDTA購自上海生物工程公司，由Amresco進(jìn)口分裝；青霉素、鏈霉素購自華北制藥有限公司。TIANGEN RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP、RNA酶抑制劑、Oligo-dt均為TIANGEN公司產(chǎn)品。DNA Marker、PCR試劑盒、優(yōu)化PCR試劑盒為天為時(shí)代生物技術(shù)公司產(chǎn)品。透明質(zhì)酸放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所(批號：20091020)。Ⅰ型膠原ELISA試劑盒購自Bioscience Laboratories，R&D公司分裝(批號：E0900951)。

1.4 主要儀器 YJ-875型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning美國公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板、微孔濾膜(0.45 μm、0.2 μm)，上海半島實(shí)業(yè)有限公司；Leica熒光生物顯微鏡，倒置顯微鏡(Olympus BX600)；－86℃超低溫冰箱，美國Revco；美國SHELDON2300-2E型電熱恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱；美國寶特ELX800型全自動酶標(biāo)儀；美國UNO的PCR儀；上海原子核所日環(huán)儀器TSN-695B型放射免疫γ測量儀。

1.5 引物及序列 Ⅰ、Ⅲ型膠原引物由INVITROGEN公司合成。引物序列如下：Ⅰ型膠原引物：上游：5'-CAT AAA GGG TCA TCG TGG CTT C-3'，下游：5'-GTG ATA GGT GAT GTT CTG GGA G-3'；Ⅲ型膠原引物：上游：5'-CGA GGT AAC AGA GGTGAA AGA-3'，下游：5'-AAC CCA GTATTC TCC AGT CTT-3'。β-actin引物：上游：5'-TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT C-3'，下游：5'-CAT GGC TGG GGTGTTGAAGGTCTCA-3'。

2 實(shí)驗(yàn)方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.1 細(xì)胞分組 HSC-T6細(xì)胞系是由大鼠HSC經(jīng)過SV40病毒轉(zhuǎn)染后形成的永生細(xì)胞系，具有無限傳代的特性。本研究將HSC-T6細(xì)胞系分為以下4組，每組細(xì)胞均置于6孔板中。4組分別為：正常組，苦杏仁苷高劑量(10-3mol/L)組，苦杏仁苷中劑量(10-4mol/L)組和苦杏仁苷低劑量(10-5mol/L)組。

2.2 RNA的提取 在6孔板中接種1×106HSC-T6細(xì)胞，用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，使細(xì)胞貼壁生長，至鋪滿50%面積后更換培養(yǎng)液。同時(shí)按前述分組劑量加入干預(yù)藥物。每個(gè)藥物濃度做6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)做不加藥物的正常組。細(xì)胞經(jīng)藥物作用48 h后，進(jìn)行消化、收集，采用TIANGEN總RNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。取細(xì)胞加1 mL裂解液，混勻后靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷，劇烈震蕩 30 s，靜置 10 min，4℃12000 rpm離心10 min。取上清加1/2體積無水乙醇，靜置2 min，后轉(zhuǎn)入離心柱中，4℃12000 rpm離心30 s。然后加入0.5 mL去蛋白液，靜置2 min后4℃離心30 s，加入漂洗液0.7 mL，靜置2 min，4℃離心30 s，再加入0.5 mL的漂洗液，同上。轉(zhuǎn)收集管后空離心柱4℃12000 rpm離心2 min后，干燥RNA 10 min。加入無RNA酶水50 μL，靜置2 min，4℃12000 rpm離心，收集離心液-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RT-PCR檢測 反應(yīng)體系為20 μL，內(nèi)含cDNA 4 μL，10×buffer 2 μL，dNTP(10 mol/L)0.4 μL，上、下游引物各0.2 μL，Taq酶 0.5 U，用水補(bǔ)至20 μL。用 PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳后，采用凝膠成像分析儀進(jìn)行掃描，觀察條帶的灰度強(qiáng)弱。

2.4 酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測 細(xì)胞按1×105接種于48孔板中，每孔0.3 mL，代細(xì)胞匯合達(dá)60%后棄上清，加入經(jīng)過2%DMEM稀釋的含藥培養(yǎng)基0.3 mL。每個(gè)濃度接種8個(gè)復(fù)孔。加藥24 h后吸取上清(每個(gè)濃度吸4個(gè)復(fù)孔)，72 h后吸取另4個(gè)復(fù)孔。按試劑盒說明書操作檢測HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原的分泌。

2.5 放射免疫法檢測 細(xì)胞培養(yǎng)上清液每24 h收集1次，以放射免疫法檢測上清液中透明質(zhì)酸的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 4組RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)比較 見圖1、表1。各苦杏仁苷組對Ⅰ型膠原基因表達(dá)均有明顯的抑制作用，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以苦杏仁苷中劑量組最為明顯，苦杏仁苷高劑量組次之，苦杏仁苷低劑量組再次之。提示苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，但這種抑制作用或并不與劑量成正比。

圖1 各組Ⅰ型膠原mRNA電泳結(jié)果圖

表1 4組RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)比較()

表1 4組RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)比較()

與正常組比較，①P<0.05

組別苦杏仁苷高劑量組苦杏仁苷中劑量組苦杏仁苷低劑量組正常組Ⅰ型膠原m R N A 1 9 5 4 1 ± 8 9 9①1 3 6 5 8 ± 1 4 3①2 9 2 6 9 ± 1 3 1 4①4 5 3 1 2 ± 3 9 1 β -a c t i n 6 0 3 3 1 3 2 1 7 1 5 1 7 9 7 4 6 9 3 3比值0 . 3 2 0 . 4 2 0 . 5 7 0 . 9 7

3.2 4組RT-PCR檢測Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比較 見圖2、表2。各苦杏仁苷組對Ⅲ型膠原基因表達(dá)均有明顯的抑制作用，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以苦杏仁苷高、中劑量組明顯，苦杏仁苷低劑量組次之。提示苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，但這種抑制作用也不與劑量明顯成正比。

圖2 各組Ⅲ型膠原mRNA電泳結(jié)果圖

表2 4組RT-PCR檢測Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比較()

表2 4組RT-PCR檢測Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比較()

與正常組比較，①P<0.05

組別苦杏仁苷高劑量組苦杏仁苷中劑量組苦杏仁苷低劑量組正常組Ⅲ型膠原m R N A 1 8 4 3 2 ± 6 7 7①1 7 0 6 7 ± 3 9 1①2 8 4 1 6 ± 1 1 1 6①4 0 7 0 4 ± 2 5 6 β -a c t i n 6 0 3 3 1 3 2 1 7 1 5 1 7 9 7 4 6 9 3 3比值0 . 3 1 0 . 5 3 0 . 5 5 0 . 8 7

3.3 4組ELISA法檢測Ⅰ型膠原比較 見表3。24 h時(shí)，Ⅰ型膠原的OD450值苦杏仁苷各組與正常組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。72 h時(shí)，苦杏仁苷各組與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但苦杏仁苷各組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示苦杏仁苷作用72 h后對Ⅰ型膠原的分泌有明顯抑制作用，這一作用不呈現(xiàn)劑量依賴。

表3 4組ELISA法檢測Ⅰ型膠原比較()

表3 4組ELISA法檢測Ⅰ型膠原比較()

與正常組比較，①P<0.05

組別苦杏仁苷高劑量組苦杏仁苷中劑量組苦杏仁苷低劑量組正常組2 4 h 0 . 0 8 9 ± 0 . 0 0 2 0 . 0 9 0 ± 0 . 0 1 0 0 . 0 9 3 ± 0 . 0 1 0 0 . 1 0 4 ± 0 . 0 1 0 7 2 h 0 . 0 7 8 ± 0 . 0 0 5①0 . 0 7 8 ± 0 . 0 0 2①0 . 0 7 9 ± 0 . 0 1 0①0 . 0 9 1 ± 0 . 0 0 5

3.4 4組放射免疫法檢測透明質(zhì)酸含量比較 見表4、圖3。24 h的苦杏仁苷高劑量組、苦杏仁苷中劑量組各有1孔因處理不當(dāng)干竭，其值被剔除。正常組分泌曲線與苦杏仁苷低劑量組稍有重疊，位置較苦杏仁苷高、中劑量組分泌曲線高，提示苦杏仁苷高、中劑量組均有抑制透明質(zhì)酸分泌的趨勢。但24 h、72 h時(shí)，4組透明質(zhì)酸含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。96 h時(shí)，苦杏仁苷高、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余組間比較，差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示苦杏仁苷對透明質(zhì)酸分泌可能有一定的抑制作用，但效果并不顯著，也不呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。

表4 4組放射免疫法檢測透明質(zhì)酸含量比較() ng/mL

表4 4組放射免疫法檢測透明質(zhì)酸含量比較() ng/mL

與苦杏仁苷中劑量組同期比較，①P<0.05

組別苦杏仁苷高劑量組苦杏仁苷中劑量組苦杏仁苷低劑量組正常組2 4 h 2 9 8 . 7 2 ± 1 1 . 8 4 2 7 7 . 0 5 ± 1 0 0 . 6 7 3 4 5 . 2 5 ± 6 5 . 5 8 3 3 7 . 3 1 ± 5 8 . 1 0 7 2 h 4 5 5 . 7 1 ± 1 3 3 . 8 3 6 9 8 . 8 5 ± 6 1 . 9 2 7 8 4 . 7 0 ± 1 2 0 . 4 7 7 7 8 . 1 4 ± 9 6 . 0 8 9 6 h 1 2 0 7 . 4 5 ± 6 9 . 0 5①7 9 6 . 2 7 ± 1 3 8 . 8 1 1 6 3 4 . 5 0 ± 3 7 6 . 8 7 1 4 3 4 . 2 6 ± 3 1 5 . 5 8

圖3 不同濃度苦杏仁苷透明質(zhì)酸分泌曲線比較

4 討論

肝纖維化是肝臟在損傷愈合過程中的一種反應(yīng)，其特征是ECM的過度沉積，其中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原是ECM的主要成分。HSC致肝纖維化作用的最直接途徑是大量ECM的產(chǎn)生。Ⅰ型膠原分子是由2個(gè)α1(Ⅰ)鏈和1個(gè)α2(Ⅰ)鏈組成的異質(zhì)三聯(lián)體。在所有類型的肝纖維化中都有Ⅰ型膠原的增生。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活化的HSC的Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)較靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)增加60～70倍[1]。免疫組織化學(xué)研究也證明，肝硬化大鼠肝臟Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯增加[2]。故目前抗肝纖維化治療中針對HSC的治療主要集中于抑制HSC激活、增殖及膠原合成，促進(jìn)膠原降解。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，對HSC-T6細(xì)胞Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)也有明顯的抑制作用，但這種抑制作用不與劑量成正比；同時(shí)，HSC-T6細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原作用的研究也印證了上述結(jié)果，在作用72 h后HSC對Ⅰ型膠原分泌有明顯抑制作用，且不呈現(xiàn)劑量依賴。提示苦杏仁苷對HSC-T6細(xì)胞活化后的ECM分泌功能有明顯的抑制作用，此可能是其抗肝纖維化的主要機(jī)制之一。

而透明質(zhì)酸則是反映肝纖維化發(fā)生發(fā)展動態(tài)最靈敏的ECM成分。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在24 h、72 h、96 h各不同時(shí)間段，苦杏仁苷高、中劑量組均有抑制透明質(zhì)酸分泌的趨勢，提示苦杏仁苷對透明質(zhì)酸分泌可能有一定的抑制作用，且極為敏感，在48～72 h就已有表現(xiàn)，但效果并不顯著，也難以判斷是否存在劑量依賴性。另外，本實(shí)驗(yàn)過程中，由于24 h的苦杏仁苷高、中劑量組各有1孔處理不當(dāng)干竭，其值被剔除，也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的部分偏差。

[1]Failli P，DeFraneo RM，Caligiuri A，et al． Nitrovasodilators inhibit platelet-derived growth factor-induced proliferation and migration of activated human hepatic stellate cells[J]．Gastroenterology，2000，119 (2)：479-492．

[2]Bedossa P，F(xiàn)erlicot S，Paradis V，et al．Dystroglycan expression in hepatic stellate cells：role in liverfibrosis[J]. Lab Invest，2002，82(8)：1053-1061．

（責(zé)任編輯：吳凌）

R285.5

A

0256-7415（2016）03-0224-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.03.088

2015-12-08

廣東省自然科學(xué)基金課題（S2012010008917）

駱歡歡（1980-），女，副研究員，研究方向：中醫(yī)臨床基礎(chǔ)。