席晅，任小瓊

1.甘肅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部生理學(xué)教研室，甘肅 蘭州 744000 2.甘肅醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，甘肅 蘭州 744000

◆實(shí)驗(yàn)研究◆

姜黃素通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)研究

席晅1，任小瓊2

1.甘肅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部生理學(xué)教研室，甘肅 蘭州 744000 2.甘肅醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，甘肅 蘭州 744000

目的：觀察姜黃素對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制是否與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。方法：分離新生24 h昆明小鼠的海馬組織，提取原代神經(jīng)干細(xì)胞并培養(yǎng)，并用免疫熒光檢測鑒定。收集第3代神經(jīng)干細(xì)胞并隨機(jī)分為空白組、缺血模型組及不同濃度姜黃素干預(yù)組（0、0.1、0.5、2.5、12.5及62.5 μmol/L），通過3-（4，5）-2-噻唑-（2，5）-二苯基溴化四氮唑藍(lán)藥敏試驗(yàn)（MTT）檢測姜黃素干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞的存活情況，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）增殖試劑盒檢測神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況。利用免疫蛋白印跡（Western blotting）法檢測不同濃度姜黃素干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞pPI3K、AKT蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：觀察到立體感強(qiáng)且折光好的神經(jīng)球。MTT結(jié)果顯示：姜黃素可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力，并具有濃度和時間依賴性。Brdu檢測結(jié)果顯示：隨著姜黃素濃度增加和干預(yù)時間延長，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡逐漸受抑制。姜黃素可上調(diào)PI3K、AKT蛋白的表達(dá)，并隨著濃度逐漸上調(diào)，增強(qiáng)作用更加明顯。結(jié)論：姜黃素可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，這可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

姜黃素；神經(jīng)干細(xì)胞；PI3K/AKT信號通路

神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有高度自我增殖、自我更新及分化的細(xì)胞，在一定條件刺激下其自發(fā)有絲分裂分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而發(fā)揮修復(fù)受損神經(jīng)的作用[1]。在以往的研究過程中，研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞自發(fā)激活潛在修復(fù)神經(jīng)的能力相當(dāng)微弱，當(dāng)神經(jīng)受損時，其遠(yuǎn)無法滿足神經(jīng)再生的需求，因此認(rèn)為通過一定的手段促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞對增殖信號作出積極反應(yīng)，將使內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的優(yōu)越性得到充分發(fā)揮。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取得到的黃色色素，現(xiàn)已被證實(shí)具有顯著的抗炎、抗氧化、抗癌等藥理作用，文獻(xiàn)[2]報(bào)道姜黃素對阿爾茨海默病等神經(jīng)變性疾病有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，磷酸肌醇三磷酸激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinsitol 3-OH kinase-RAC-alphaserine/threonineprotein kinase，PI3K/AKT)信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)重要信號通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，對細(xì)胞增殖、分化、蛋白質(zhì)合成進(jìn)行調(diào)控，在細(xì)胞生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用[3]。因此筆者提出設(shè)想：姜黃素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用是否與激活神經(jīng)干細(xì)胞增殖有關(guān)？其作用機(jī)制是否與PI3K/AKT信號通路有關(guān)？現(xiàn)將一系列研究報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 取20只新生24 h的昆明小鼠，體重3.5～5.8 g，平均體重(4.1±0.24)g，所有小鼠由上海維通利華動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(Biosharp公司)；DMSO (Sigma公司)；ECL發(fā)光液(碧云天)；β-acting(博奧森)；胎牛血清(Biosharp公司)、胰酶(Biosharp公司)；PI3K、pPI3K、AKT、pAKT單克隆抗體(北京中杉)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、磷酸緩沖鹽溶液(PhosphateBuffer Saline，PBS)、鼠抗巢蛋白(Nestin)、兔抗Brdu、抗兔二抗均購于福州沃森生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(蘇州安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)；S3006L型高壓勻質(zhì)機(jī)(Niro Soavi公司)；冷凍干燥機(jī)(Abeonco公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將小鼠置于冰上，斷頭取腦后將腦組織快速放入D-Hank液中，在顯微鏡輔助下小心取出完整的海馬組織，隨后用眼科剪將海馬組織剪碎成糊狀，使用200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨過濾剪碎的海馬組織，后置于4℃1000 g轉(zhuǎn)速下離心，摒棄上清液，加入含有神經(jīng)因子(bFGF 20 μg/L和LEGF 20 μg/L)的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于37℃，飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5天后進(jìn)行細(xì)胞傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)至第3代。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 取第3代細(xì)胞，接種于包被多聚賴氨酸24孔板內(nèi)，每孔0.5 mL，將細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，吸去培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，每次5 min，往24孔板中加入4%多聚甲醛，并在室溫中固定30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min；隨后使用0.3% Triton-X100進(jìn)行破膜處理，室溫下靜置20 min，用PBS漂洗3次，每次5 min，再使用5%山羊血清室溫下封閉30 min，去除山羊血清，加入預(yù)先稀釋(1∶100)的Nestin一抗，4℃下放置過夜，用PBS漂洗3次，每次5 min；避光條件下加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG-FITC，并靜置2 h，用PBS漂洗3次，每次5 min，常溫下干燥后樹脂封片，后置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 建立神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧模型 根據(jù)文獻(xiàn)[3]，采用氧糖剝奪法(OGD)模擬在體缺血，細(xì)胞培養(yǎng)至第9～10天時，以無糖Earle氏液替代原培養(yǎng)液。Earle氏液放入缺氧罐中預(yù)平衡30 min后，將培養(yǎng)板置于缺氧罐內(nèi)，93%N2加7%CO2接缺氧罐的進(jìn)氣口，出氣口外接水瓶。缺氧罐放于培養(yǎng)箱中至箱體溫度與培養(yǎng)箱一致(37℃)，缺氧罐內(nèi)分上層、隔層和下層，上層用來放置細(xì)胞和用以燃燒耗盡O2的蠟燭；隔層可模擬正常的CO2培養(yǎng)箱；下層盛超純水以維持罐體內(nèi)合適濕度。通入93%N2加7%CO2的混合氣體30 min，關(guān)閉缺氧罐進(jìn)口并置于培養(yǎng)箱內(nèi)3 h以模擬腦缺血缺氧狀態(tài)。

2.4 MTT法測細(xì)胞存活情況 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，接種于24孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為空白組、姜黃素組，各組6個復(fù)孔。將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔細(xì)胞濃度為5×103個/100 μL，每組4個復(fù)孔，邊緣孔不加細(xì)胞，37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的藥物：①空白組(培養(yǎng)液)，再次放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；②姜黃素組給藥濃度分別為0、0.1、0.5、2.5、12.5及62.5 μmol/L，以上各組給藥后分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，繼續(xù)孵育4 h后，吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀在490 nm波長處讀取OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取A平均值，計(jì)算神經(jīng)干細(xì)胞活力(%)=(1-姜黃素組A/空白組A)×100%[4]。

2.5 Brdu檢測細(xì)胞增殖情況 利用Brdu檢測各組細(xì)胞的增殖情況，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/ mL，接種于96孔板(預(yù)先用多聚賴氨酸包被)，分組情況同2.4項(xiàng)，將各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，隨后每孔加入20 μL 20%Brdu培養(yǎng)基，再次將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測，顯色后采用492 nm波長，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

2.6 免疫蛋白印跡（Western blotting） 法檢測各組pPI3K蛋白及AKT蛋白的表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，加入不同濃度的姜黃素：0、0.1、0.5、2.5、12.5及62.5μmol/L，同時設(shè)立空白組(培養(yǎng)液)，于37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，將細(xì)胞收集后加入100 μL裂解液(Tris pH=7.5，1 mM EDTA中，50 mM NaCl，0.5% Triton-X-100)，4℃持續(xù)振搖30 min，將上清轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管，SDS-PAGE凝膠上樣量50 μL在150 V穩(wěn)壓電場中電泳，電泳后用380 mA電流將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，脫脂奶粉封閉1 h后，剪膜，根據(jù)分子量分開后分別加1∶500稀釋的一抗(PI3K/AKT)及內(nèi)參抗體(β-acting，1∶3000)室溫孵育2 h，HRP標(biāo)記二抗孵育1 h后，洗膜，ECL發(fā)光液發(fā)光后X線片曝光，掃描記錄結(jié)果，Gel-analyze分析軟件分析條帶灰度，進(jìn)行半定量比較分析，以IOD值表示蛋白的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 研究結(jié)果

4.1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 將原代單核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中觀察。第3天出現(xiàn)立體感強(qiáng)且折光好的神經(jīng)球，神經(jīng)球的體積和數(shù)目隨著時間的推移不斷增加，培育至第7天后出現(xiàn)大小不等的神經(jīng)團(tuán)，直徑約0.2 mm，將神經(jīng)團(tuán)機(jī)械吹打成單個細(xì)胞并繼續(xù)培育72 h后接種96孔板(預(yù)先用多聚賴氨酸包被)，繼續(xù)于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h后進(jìn)行熒光鑒定，利用Nestin標(biāo)記陽性細(xì)胞，具體如圖1、2。

圖1 常規(guī)顯微鏡下神經(jīng)球(200倍)

圖2 免疫熒光鑒定NSCs(200倍)

4.2 各組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡及增殖情況 表1的MTT結(jié)果顯示：姜黃素可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力，并具有濃度和時間依賴性，在同一個時間點(diǎn)，隨著姜黃素濃度的增加，神經(jīng)干細(xì)胞增殖越加明顯，并且隨著干預(yù)時間的延長，也促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。表2的Brdu檢測結(jié)果顯示：隨著姜黃素濃度增加和干預(yù)時間延長，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡逐漸受到抑制。

表1 各組神經(jīng)干細(xì)胞不同時間點(diǎn)增殖情況()

表1 各組神經(jīng)干細(xì)胞不同時間點(diǎn)增殖情況()

與空白組同期比較，①P<0.05，②P<0.01；與姜黃素5組同期比較，③P<0.05

組別空白組姜黃素1組( 0 μ g / m L )姜黃素2組( 0 . 1 μ g / m L )姜黃素3組( 0 . 5 μ g / m L )姜黃素4組( 2 . 5 μ g / m L )姜黃素5組( 1 2 . 5 μ g / m L )姜黃素6組( 6 2 . 5 μ g / m L ) 0 h 0 . 2 6 ± 0 . 0 2 0 . 2 7 ± 0 . 0 2 0 . 2 4 ± 0 . 0 4 0 . 2 5 ± 0 . 0 5 0 . 2 6 ± 0 . 0 3 0 . 2 4 ± 0 . 0 5 0 . 2 4 ± 0 . 0 4 2 4 h 0 . 2 4 ± 0 . 0 2 0 . 2 4 ± 0 . 0 3 0 . 3 1 ± 0 . 0 7 0 . 3 9 ± 0 . 0 1②0 . 4 8 ± 0 . 0 6①0 . 7 3 ± 0 . 1 1②1 . 3 0 ± 0 . 0 2②4 8 h 0 . 2 1 ± 0 . 0 8 0 . 2 7 ± 0 . 0 4 0 . 4 7 ± 0 . 0 5①0 . 5 7 ± 0 . 0 9①0 . 6 3 ± 0 . 1 2②0 . 9 3 ± 0 . 2 3②1 . 3 7 ± 0 . 0 4②③7 2 h 0 . 3 1 ± 0 . 0 8 0 . 3 4 ± 0 . 0 6 0 . 7 2 ± 0 . 1 3①0 . 9 9 ± 0 . 2 7②1 . 5 1 ± 0 . 0 6②1 . 8 7 ± 0 . 0 9②2 . 6 1 ± 0 . 0 9②③

表2 各組神經(jīng)干細(xì)胞不同時間點(diǎn)抑制率比較() %

表2 各組神經(jīng)干細(xì)胞不同時間點(diǎn)抑制率比較() %

與空白組同期比較，①P<0.05，②P<0.01；與姜黃素2組及姜黃素3組同期比較，③P<0.05，④P<0.01

組別空白組姜黃素1組( 0 μ g / m L )姜黃素2組( 0 . 1 μ g / m L )姜黃素3組( 0 . 5 μ g / m L )姜黃素4組( 2 . 5 μ g / m L )姜黃素5組( 1 2 . 5 μ g / m L )姜黃素6組( 6 2 . 5 μ g / m L ) 2 4 h 4 8 h 7 2 h 0 0 0 0 0 0 8 9 . 6 8 3 ± 0 . 0 5 4①6 4 . 5 1 2 ± 0 . 0 2 0①5 3 . 6 7 9 ± 0 . 0 4 1①4 3 . 7 9 1 ± 0 . 0 4 3①③3 4 . 5 9 3 ± 0 . 0 1 7②④6 2 . 5 6 0 ± 0 . 0 7 3①5 0 . 6 3 1 ± 1 . 2 5 3①4 0 . 2 6 7 ± 1 . 6 2 3①3 9 . 4 0 3 ± 1 . 6 8 5②③2 5 . 8 5 3 ± 1 . 6 2 5②④5 2 . 6 2 5 ± 1 . 3 1 5①4 5 . 1 3 8 ± 1 . 5 6 2①3 6 . 8 8 3 ± 1 . 9 1 3②2 0 . 6 2 1 ± 1 . 6 2 7②③1 4 . 1 2 2 ± 1 . 6 2 3②④

4.3 姜黃素對各組pPI3K、AKT蛋白表達(dá)的影響 隨著姜黃素干預(yù)時間的延長，pPI3K、AKT蛋白的灰度值逐漸增加，提示姜黃素可上調(diào)PI3K、AKT蛋白的的表達(dá)，并隨著濃度逐漸上調(diào)，增強(qiáng)作用更加明顯，具體見圖3及表3。

圖3 各組pPI3K的表達(dá)

表3 各組不同時間點(diǎn)神經(jīng)干細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)情況比較()

表3 各組不同時間點(diǎn)神經(jīng)干細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)情況比較()

與空白組同期比較，①P<0.05，②P<0.01；與姜黃素2組及姜黃素3組同期比較，③P<0.05，④P<0.01

組別空白組姜黃素1組( 0 μ g / m L )姜黃素2組( 0 . 1 μ g / m L )姜黃素3組( 0 . 5 μ g / m L )姜黃素4組( 2 . 5 μ g / m L )姜黃素5組( 1 2 . 5 μ g / m L )姜黃素6組( 6 2 . 5 μ g / m L ) 2 4 h 9 4 0 . 4 2 2 ± 0 . 0 4 3 9 3 0 . 4 7 8 ± 0 . 0 5 6 1 0 2 3 . 5 8 1 ± 0 . 0 5 8 1 2 9 3 . 6 7 2 ± 0 . 0 6 3 1 5 2 0 . 6 5 1 ± 0 . 0 7 1①1 7 2 0 . 3 9 2 ± 0 . 0 2 7①③2 0 8 0 . 3 2 8 ± 0 . 0 8 4②④4 8 h 9 5 0 . 6 2 5 ± 0 . 0 5 8 1 1 8 0 . 7 0 8 ± 0 . 0 6 2①1 3 2 0 . 8 2 5 ± 0 . 1 6 1①1 8 3 0 . 8 3 3 ± 0 . 1 7 6①1 9 4 0 . 7 9 4 ± 0 . 1 3 5①2 1 2 0 . 2 9 3 ± 0 . 6 2 3①③2 4 0 0 . 7 9 4 ± 0 . 1 3 5②④7 2 h 9 5 8 . 7 8 1 ± 0 . 0 6 3 1 3 2 3 . 8 5 3 ± 0 . 0 6 6①1 6 6 7 . 9 6 2 ± 0 . 1 4 8 2 0 2 3 . 9 9 6 ± 0 . 1 5 8②2 1 2 1 . 0 2 8 ± 0 . 1 9 0②2 5 2 1 . 2 6 5 ± 0 . 2 7 6②③3 2 2 1 . 3 5 6 ± 0 . 2 8 1②④

5 討論

神經(jīng)干細(xì)胞具有高度增殖、自我更新及分化能力，在一定條件下能不斷進(jìn)行有絲分裂，并分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的原始母細(xì)胞。在理想狀態(tài)下，神經(jīng)干細(xì)胞是中樞神經(jīng)修復(fù)的重要貯備及源泉，通過神經(jīng)干細(xì)胞的不斷增殖及遷移，可以到達(dá)凋亡細(xì)胞周圍，參與細(xì)胞及組織更新。因此，細(xì)胞替代被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病最有前途的治療措施。然而，盡管細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果讓人鼓舞，臨床上應(yīng)用也取得了一定的進(jìn)展，但離大規(guī)模應(yīng)用仍有相當(dāng)長的一段距離，其療效與神經(jīng)干細(xì)胞所擁有的潛能相去甚遠(yuǎn)。所以認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞移植的推廣應(yīng)用還有一些重要障礙需要克服，其中如何動員足夠數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞參與神經(jīng)修復(fù)，是需要解決的首要問題。

姜黃素是一種多酚類植物單體，研究證明其在體內(nèi)外具有抗炎、抗腫瘤等多種作用。它可以打擊多個靶位和信號通路以致產(chǎn)生多種生物效應(yīng)。國內(nèi)外有文獻(xiàn)證實(shí)姜黃素對神經(jīng)元細(xì)胞具有明顯促進(jìn)增殖的作用，從而可以發(fā)揮修復(fù)受損神經(jīng)的作用[5～7]。行妍妍等[8]通過神經(jīng)干細(xì)胞的培育并利用姜黃素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示姜黃素可明顯增強(qiáng)C17.2細(xì)胞的增殖能力，而C17.2細(xì)胞屬于多能的神經(jīng)前體，通過激活其增殖，促使胚胎皮層神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)缺血缺氧模型受損神經(jīng)的逆轉(zhuǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，利用姜黃素干預(yù)后，缺血缺氧模型的神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)增殖效應(yīng)，并且隨著干預(yù)時間的延長和干預(yù)濃度的增加，增殖效應(yīng)愈加明顯，與此同時，隨著姜黃素濃度增加和干預(yù)時間延長，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡逐漸受到抑制，提示姜黃素確實(shí)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，這和文獻(xiàn)[9～13]的結(jié)果是相一致的。然而姜黃素促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)制目前尚未清楚，筆者也開展了一系列研究，結(jié)果顯示姜黃素促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制與PI3K/AKT信號通路關(guān)系密切。

PI3K/AKT信號通路被稱為經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有大量研究證實(shí)該通路在腦組織缺血損傷后被激活，通過影響下游凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等效應(yīng)分子的活化過程而參與機(jī)體多種生理病理過程，PI3K是磷脂酰肌醇激酶的重要成員，具有特異的催化磷脂酰肌醇脂類物質(zhì)的激酶作用，也是參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分子之一，功能上是AKT活化的首要調(diào)節(jié)者。通過活化的AKT能夠阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子，從而抑制細(xì)胞凋亡。通過Western blotting法檢測得知，姜黃素可上調(diào)PI3K、AKT蛋白的的表達(dá)，并隨著濃度逐漸上調(diào)增強(qiáng)作用更加明顯，因此可得出結(jié)論：姜黃素可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

總的來說，本研究在體外證實(shí)了姜黃素具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的能力，通過姜黃素的干預(yù)，使得PI3K/AKT信號通路得以激活，如果將來在人體內(nèi)得以證實(shí)，將為預(yù)防和減輕缺血缺氧腦損傷患者的功能障礙并提高其生活質(zhì)量打開一扇希望之門。

[1]Maisano X，Carpentino J，Becker S，et al．Embryonic stem cell-derived neural precursor grafts for treatment of temporal lobe epilepsy [J]．Neurotherapeutics，2009，6(2)：263-277.

[2]Bjugstad KB，Teng YD，Redmond DE Jr，et al．Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease[J]．Exp Neurol，2008，211(2)：362-369.

[3]Shioda N，Han F，F(xiàn)ukunaga K．Role of Akt and ERK signaling in the neurogenesis following brain ischemia[J]. Int Rev Neurobiol，2009，85：375-387.

[4]Landgren H，Curtis MA．Locating and labeling neural stem cells in the brain[J]．J Cell Physiol， 2011，226 (1)：1-7.

[5]Martino G，F(xiàn)ranklin RJ，Van Evercooren AB，et al．Stem cell transplantation in multiple sclerosis：current status and future prospects[J]．NatRev Neurol，2010，6(5)：247-255．

[6] 程建華，劉雙，韓釗．姜黃素通過調(diào)控Notch通路促進(jìn)大鼠腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移[J]．中國病理生理雜志，2013，29(5)：44-47.

[7] 胡建鵬，周會，王鍵，等．益氣活血方和補(bǔ)腎生髓方對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Notch-1和Jagged1表達(dá)的影響[J]．中國病理生理雜志，2010，26 (3)：483-486．

[8]行妍妍，汪軍兵，謝賽，等．姜黃素對放線菌素D/TNF-α誘導(dǎo)的PCI2細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響[J]．中國病理生理雜志，2012，28(10)：1746-1750.

[9]He K，Yan L，Pan CS，et al．ROCK-dependent ATP5D modulation contributes to he protection of notoginsenoside NR1 against ischeia/reperfusion-induced myocardial injury[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，10(1)：572-581.

[10]Tetzlaff W，Okon EB，Karimi-Abdolrezaee S，et al．A systematic review of cellular transplantation therapies for spinal cord injury[J]．J Neurotrauma，2011，28(8)：1611-1682.

[11]Snegovskikh V，Mutlu L，Massasa E．Identification of putative fallopian tube stem cells [J]．Reprod Sci，2014，21(12)：1460-1464.

[12]Sato A，Sunayama J，Matsuda K，et al．Regulation of neural stem/progenitor cell maintenance by PI3K and mTOR[J]．NeurosciLett，2010，470(2)：115-120.

[13]Fujimoto S，Negishi M，Katoh H．RhoG promotes neural progenitor cell proliferation in mouse cerebral cortex[J]．MolBiolCell，2009，20(23)：4941-4950．

（責(zé)任編輯：吳凌）

Experimental Study of Curcumin Adjusting and Controlling Proliferation and Apoptosis of Neural Stem Cell by PI3K/AKT Signaling Pathway

XI Xuan，REN Xiaoqiong

Objective：To observe the effect of curcumin on proliferation and apoptosis of neural stem cells，and discuss its feasible mechanism.Method：Separated the hippocampus of KM mouse within 24 hours，primary neural stem cells were extracted and cultured，and then tested by immunofluorescence.The 3rd generation neural stem cells were collected and randomly divided into the blank group，ischemia model group and intervention group with different concentration of curcumin (0，0.1，0.5，2.5，2.5 and 62.5 μmol/L).Detected survival condition of neural stem cells in curcumin by means of 3-(4，5) -2-thiazole-(2，5)-diphenyl four nitrogen thiazole blue bromide drug sensitive test(MTT)，and detected the neural stem cells proliferation by means of 5-bromodeoxyuridine(Brdu).At the same time，detected the expression of neural stem cells PI3K protein and AKT protein after different concentration of curcumin intervention by the means of Western blotting.Result：When detecting Nestin and testing neural stem cells by means of immunofluorescence，green and bright，typical cell spheres could be observed under the fluorescent microscope，and clear structures existed inside spheres.MTT results showed that，curcumin could enhance the proliferation capacity of neural stem cells，possessing concentration and time dependence.Brdu showed that，apoptosis of neural stem cells was inhibited gradually with the increase of curcumin concentration and intervention time.The expression of PI3K protein and AKT protein could be up-regulated by curcumin，and this up-regulation was more obviously with the increase of concentration.Conclusion：Curcumin can promote proliferation of neural stem cellsand inhibit its apoptosis，which maybe related to activation of PI3K/AKT signal pathway.

Curcumin；Neural stem cells；PI3K/AKT signaling pathway

R285.5

A

0256-7415（2016）03-0217-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.03.086

2015-11-25

席晅（1966-），男，副教授，主要從事生理學(xué)教學(xué)研究工作。