顏正豪褚昊月，2郭靜張晟亓慶國

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不同齲敏感兒童牙菌斑微生物多樣性分析

顏正豪1褚昊月1，2郭靜1張晟1亓慶國1

【摘要】目的 利用高通量測序方法，研究ECC兒童和S-ECC兒童牙菌斑微生物的多樣性變化，探索兒童齲病的病因?qū)W。方法 采集ECC兒童和S-ECC兒童牙菌斑樣本，利用Illumina MiSeq測序方法，針對16SrRNA基因V4變異區(qū)設(shè)計通用引物進(jìn)行測序分析菌群微生物的群落變化。結(jié)果 測序總共測得1 669 057條有效序列，平均有效率為89.16%，共1 514個操作分類單位（OTU）。結(jié)論 兒童齲病的發(fā)生發(fā)展與鏈球菌屬等菌屬密切相關(guān)，其種群的多樣性呈現(xiàn)特異性的富集。

【關(guān)鍵詞】低齡兒童齲；牙菌斑微生物；微生物多樣性；高通量測序

兒童齲病嚴(yán)重影響兒童的口腔及身心健康，其發(fā)病是口腔牙菌斑生態(tài)平衡失調(diào)的結(jié)果[1-2]。本研究利用高通量測序平臺對ECC兒童和S-ECC兒童牙菌斑進(jìn)行群落分析，以期為兒童齲病生態(tài)學(xué)的評估提供新的研究策略。

1 材料及方法

1.1 樣本采集、兒童牙菌斑微生物總DNA提取

由兩名口腔專業(yè)醫(yī)師擔(dān)任檢查者，無菌探針刮取乳磨牙頰面菌斑。記錄齲失補牙面數(shù)低齡兒童齲（early childhood caries，ECC；dmfs≥1），重度低齡兒童齲（severe early child-hood，S-ECC）納入標(biāo)準(zhǔn)為患兒口內(nèi)齲失補牙面數(shù)（dmfs）≥4（3歲），≥5（4歲），≥6（5歲）[3]。每組各20人。隨機(jī)抽取8名ECC兒童和7名S-ECC兒童牙菌斑。采用CTAB法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并送諾禾致源公司進(jìn)行測序。

1.2 信息分析流程

1.2.1 α-多樣性分析 分析樣品內(nèi)的群落多樣性，利用Qiime軟件（Version1.7.0）對樣品復(fù)雜度指數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.2 物種豐度注釋 根據(jù)樣品在門和屬水平的OTU進(jìn)行聚類分析。

1.2.3 OTU分析 利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效序列進(jìn)行聚類并形成OTU并行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有結(jié)果使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)特征

測序總共得到1 856 169條原始序列，經(jīng)過預(yù)處理和統(tǒng)計分析得到1 669 057條有效序列，平均每個樣本57 554條序列，平均有效率為89.16%。所有樣本的平均序列讀長249bp。

2.2 測序結(jié)果分析口腔菌群組成和分布

2.2.1 在門水平上進(jìn)行分類 通過測序可以獲知菌斑微生物群落中一共有27種菌門。在ECC和S-ECC兒童中有10種菌門占優(yōu)勢，它們是：變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）等。這些菌門占到90%以上，隨著時間推移這些菌門在ECC和S-ECC中呈現(xiàn)富集狀態(tài)。在菌斑中所占比重較多的為螺旋菌門，TM7等。在兩個時間點的ECC兒童和SECC兒童中均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001），但僅在ECC兒童中隨時間變化呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.001）。

2.2.2 在屬水平上進(jìn)行分類 在屬水平上有525種菌屬，有10種菌屬占主導(dǎo)地位，Streptococcus（鏈球菌屬）等在ECC和SECC中占主導(dǎo)地位的菌屬，其在基線和1年后的ECC和SECC比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），在ECC兒童中隨時間變化呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），在SECC中并未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1）。

3 討論

利用16SrRNA基因擴(kuò)增子進(jìn)行微生物概貌分析，可以提取到更高數(shù)目的序列參與分析并能檢測低豐度的細(xì)菌種類[4-5]。我們采用了Illmina MiSeq測序方法檢測菌斑微生物群落的多樣性，在很大程度上取決于用來分析的測序總序列數(shù)[6]。 與他人研究[7]相比，我們的研究序列數(shù)量較高，可能與PCR中的有一定的偏離率、DNA提取過程中存在一些未知的雜質(zhì)[8]有關(guān)，我們用測序方法對微生物群進(jìn)行分析，并達(dá)到一定的深度，雖然在16S rRNA的高度變異區(qū)V4區(qū)僅選取了這些短的序列，但其具有良好的辨識度，并且足以用來進(jìn)行分類分析。

本研究發(fā)現(xiàn)有27種菌門和525種菌屬。在研究中口腔微生物群落分析中主要有5種菌門所占比例較高，提示這些菌屬是與齲病發(fā)生相關(guān)是優(yōu)勢菌屬，且隨著年齡的改變這些種群的轉(zhuǎn)換在ECC和S-ECC中基本上未發(fā)生有差異的改變，說明這些菌群微生物與齲病的進(jìn)展高度有關(guān)。在主成分分析中，微生物群落組成相似并呈現(xiàn)聚集性，說明 ECC兒童與S-ECC兒童之間在門、屬和種等微生物分類上差異性不明顯；且同一群體在基線和1年后僅有個別門屬有差異，表明在齲病的發(fā)展進(jìn)程中呈現(xiàn)群落聚集性。

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作者單位：1 250012濟(jì)南，山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室；2 271000 山東省泰安市中心醫(yī)院口腔科

Analysis of Children With Different Caries Plaque Microbial Diversity

YAN Zhenghao1CHU Haoyue1, 2GUO Jing1ZHANG Sheng1QI Qingguo1, 1 School of Stomatol-ogy Shanodong University / Shandong Province Key Lab of Oral Biomedicine, Ji’nan 250012, China, 2 Department of Stomatology Tai'an City Central Hospital, Tai'an 271000, China

[Abstract]Objective To study the microbial diversity of ECC and S-ECC in the dental plaque with high-throughput sequencing, and investigate the possible etiology of dental caries of children.Methods Describe the bacterial profile shifting in different caries states by pyrosequencing analysis based on 16SrRNA gene V4 hyper variable regions.Apply Illumina MiSeq pyrosequencing for analysis random drawing for the ECC and S-ECC.Results In the clonal analysis, a total of 1 669 057 high-quality sequences were produced, accounting for 89.16 % of valid sequences, a total of 1 514 operating units (OTU).Conlusion With the occurrence and development of Streptococcus spp.and other dental caries in children is closely related to the diversity of the population showed specific enrichment.

[Key words]Early childhood caries, Dental plaque microorganisms, Microbial diversity, High-throughput sequencing

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.07.020

【文章編號】1674-9308（2016）07-0029-02

【中圖分類號】R788

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A