孫鵬宋遠周曉晶

肝細胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達及對侵襲的影響分析

孫鵬1宋遠1周曉晶2

目的 探討肝細胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達及其對侵襲的影響。方法 采用實時定量PCR檢測的方法，對28對癌細胞、ANLT及不同細胞系中的AF-6mRNA表達水平進行檢測，分析AF-6mRNA對侵襲的影響。結(jié)果 26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達，發(fā)生率為92.9%；肝癌細胞株中AF-6mRNA表達低于正常桿細胞株（P＜0.05）；低侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系（P＜0.05）。結(jié)論 肝細胞肝癌中AF-6mRNA低表達可能與高侵襲能力有關(guān)。

肝細胞肝癌；AF-6mRNA；侵襲

肝細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，會影響患者預(yù)后。當(dāng)前，臨床上尚未尋找到有效的方法，對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進行控制[1]。AF-6是一種極性蛋白，為細胞緊密連接的成分[2]。有研究認為，在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中，AF-6mRNA發(fā)揮著重要的作用[3]。但臨床上針對其在肝細胞肝癌中的表達及侵襲轉(zhuǎn)移中影響的研究仍較少[4]?；诖?，本研究檢測了癌細胞、ANLT及不同細胞系中的AF-6mRNA表達水平，分析其對侵襲轉(zhuǎn)移的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年6月～2016年6月本院收治的28對肝細胞肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織標本。28例標本中，男20例，女8例；患者平均年齡（45.3±2.4）歲，平均腫塊大?。?.1±0.9）cm。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 購自上海生命技術(shù)科學(xué)院的正常肝細胞株L02、肝癌HepG2、HCCLM3等；購自羅氏公司的Faststart Universal SYBRGreen Master瑞士試劑盒；購自Gibco公司的Taq DNA聚合酶等。

1.2.2 培養(yǎng)細胞系 分別復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代并凍存人肝L02細胞及肝癌HepG2、HCCLM3等。

1.2.3 提取肝癌組織標本及細胞株總RNA 將1.0 ml裂解液溶入研磨好的新鮮肝癌及ANLT標本中，以移液器進行吹打；將0.2 ml氯仿溶入，進行15 s劇烈震蕩，靜置3 min。做10 000 r離心處理，持續(xù)15 min。在新管中轉(zhuǎn)移上層水相，溶入0.5 ml異丙醇沉淀RNA，靜置10 min；做10 000 r離心處理，持續(xù)10 min，將上清液移去，將100 μl無RNA酶水溶入，充分溶解后，置入零下80℃冰箱中保存。

1.2.4 定量PCR檢測 按照GeneBank數(shù)據(jù)庫中人AF-6基因的序列，內(nèi)參為人GAPDH，交由上海生工生物技術(shù)公司合成，嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性，持續(xù)10 min；95℃變性，持續(xù)15 s；60℃退火，持續(xù)60 s；72℃延伸，持續(xù)30 s，持續(xù)40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)且方差齊性時，以獨立樣本t檢驗；數(shù)據(jù)滿足正態(tài)但方差不齊時，以校正t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AF-6mRNA在肝癌組織中的表達

本組28對組織標本中，26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達，發(fā)生率為92.9%。

2.2 不同細胞株中AF-6mRNA表達水平

設(shè)正常肝細胞株L02相對表達量為1。肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H的AF-6mRNA表達分別為（0.6±0.1）、（0.2±0.1）、（0.3±0.1），均低于正常桿細胞株，差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義（t=25.298、50.596、44.272，P=0.000、0.000、0.000）；低侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系HCCLM3、MHCC97-H，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.889、13.416，P=0.000、0.000）。

3 討論

僅有部分早期確診的肝癌患者能及時進行手術(shù)治療，延長生存時間，但整體上病死率仍居高不下[5]。影響肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵，

是較高的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。這就需要尋找肝細胞肝癌患者術(shù)后潛在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分子機制。

AF-6為極性蛋白，在維持細胞發(fā)育、修復(fù)損傷、保持組織完整性中發(fā)揮著重要的作用，且在卵巢癌、乳腺癌、白血病等多種癌癥中存在異常表達[6]。有研究認為，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，極性蛋白的異常表達及錯誤定位具有重要意義[7]。但是，臨床上仍缺乏對肝細胞肝癌中AF-6mRNA表達及其對侵襲影響的研究[8]。

本研究中，26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達。提示在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，AF-6mRNA可能發(fā)揮著一定的作用。此外，肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H肝癌細胞株中AF-6mRNA表達低于正常桿細胞株（P＜0.05）。而且，低侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細胞系HCCLM3、MHCC97-H（P＜0.05）。由此可知，AF-6mRNA表達的變化可能與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。此外，在肝細胞肝癌組織及細胞中，AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達。因此AF-6mRNA表達的變化可能與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)負相關(guān)，提示AF-6可能會抑制肝細胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，肝細胞肝癌中AF-6mRNA低表達可能與高侵襲能力有關(guān)，今后可能發(fā)展成為分子、基因水平治療肝細胞肝癌的潛在靶點，需引起高度關(guān)注。

[1] 吳天春，馮留順，李捷，等. 極性蛋白AF-6mRNA在肝細胞肝癌中的表達及其對侵襲的影響[J]. 世界華人消化雜志，2015，23（31）：5045-5049.

[2] 陳志平. MiR-573/apoM/Bcl2A1途徑對肝細胞凋亡和肝癌形成影響及其機制研究[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015：34-35.

[3] 李慶軍. miR-10b通過抑制CADM1表達促進人肝細胞肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制研究[D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2013：15-16.

[4] 徐智，陽書華，王愷，等. 不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞株GRP78的表達及其對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中國病理生理雜志，2011，27（1）：108-112.

[5] 陳宏輝，彭蕾. 全反式維甲酸對肝癌細胞HepG2的分化、侵襲遷移的影響[J]. 世界華人消化雜志，2011，19（33）：3381-3389.

[6] 常遠鴻，李汀，陰俊，等. 靶向沉默CXCR4基因抑制肝細胞癌侵襲體外研究[J]. 中華腫瘤防治雜志，2013，20（20）：1569-1573，1579.

[7] 周亮. Notch信號通路參與肝癌細胞侵襲遷移的機制研究[D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2013：12-13.

[8] 蔣成英. GA6與SHP2蛋白在肝細胞癌中的臨床意義及其作用機制的研究[D]. 天津：南開大學(xué)，2012：8-9.

Expression of Polar Protein AF-6mRNA in Hepatocellular Carcinoma and Its Effect on Invasion

SUN Peng1SONG Yuan1ZHOU Xiaojing21Department of Gastroenterology, Jilin Provincial People’s Hospital, Changchun Jilin 130021, China, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130017, China

Objective To investigate the expression of AF-6mRNA protein and its effect on the invasion of hepatocellular carcinoma. Methods Using real-time quantitative PCR detection method, the expression levels of AF-6mRNA in 28 pairs of cancer cells, ANLT and cell lines were detected, and the influence of AF-6mRNA on the invasion was analyzed. Results 26 cases of AF-6mRNA showed low expression in hepatocellular carcinoma, the incidence rate was 92.9%, the rod was significantly lower than the normal cell line AF-6mRNA expression in hepatocellular carcinoma cell line (P＜0.05), was obviously higher than that of invasion and metastasis of AF-6mRNA cells expressing ability in cell lines with low metastasis (P＜0.05). Conclusion Low expression of AF-6mRNA in hepatocellular carcinoma may be related to high invasive ability.

Hepatocellular carcinoma, AF-6Mrna, Attack

R735

A

1674-9308（2016）33-0237-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.33.137

吉林省衛(wèi)生計生科研計劃課題（20152084）

基金項目：吉林省衛(wèi)生計生自籌經(jīng)費課題（2015s2c06）

1 吉林省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 長春 130021；2 長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 長春 130017

周曉晶，E-mail：589632478@qq.com