秦麗 章碧云 鐘時(shí)勛

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，耳鼻咽喉科(重慶400016)

·基礎(chǔ)研究·

醛固酮對(duì)豚鼠耳蝸功能及AF9蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

秦麗 章碧云 鐘時(shí)勛

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，耳鼻咽喉科(重慶400016)

目的檢測(cè)豚鼠耳蝸組織中AF9蛋白的表達(dá)情況，分析醛固酮對(duì)耳蝸功能及AF9蛋白表達(dá)影響，探討醛固酮與AF9蛋白在內(nèi)淋巴積水中的作用。方法將28只豚鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（Ald組）分別腹腔注射50μl生理鹽水、0.1mg/kg/d醛固酮，各5天。1月后通過聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)耳蝸功能學(xué)改變；應(yīng)用蘇木素-伊紅染色(HE)檢測(cè)兩組耳蝸組織形態(tài)學(xué)差異，利用免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)AF9蛋白在耳蝸組織中的定位表達(dá)以及醛固酮作用前后AF9蛋白的差異表達(dá)模式。結(jié)果醛固酮作用后，ABR提示Ald組聽力閾值較對(duì)照組升高(P＜0.05)。HE證實(shí)Ald組豚鼠耳蝸存在內(nèi)淋巴積水，IHC顯示AF9蛋白在血管紋、前庭膜、螺旋緣、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及前庭階骨膜均有表達(dá)，并且Ald組耳蝸AF9蛋白在血管紋及前庭膜表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論耳蝸組織中存在與Na+代謝相關(guān)的AF9蛋白，醛固酮可能通過下調(diào)AF9蛋白表達(dá)來參與內(nèi)淋巴代謝，進(jìn)而影響內(nèi)耳功能。

醛固酮；AF9蛋白；內(nèi)淋巴積水；耳蝸功能

Fund projects:Chongqing Natural Science Foundation(cstc2013jcyjA10034);National Key Clinical Specialties Construction Program of China([2012]649)

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

梅尼埃病(Meniere’s disease,MD)為常見內(nèi)耳疾病，其典型癥狀為間歇發(fā)作性眩暈（每次持續(xù)數(shù)小時(shí)）、波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽覺損失、耳鳴及耳脹滿感。目前一致認(rèn)為耳蝸內(nèi)淋巴積水（Endolymphatic Hydrops,ELH）為該病的組織病理學(xué)改變，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。Na+、K+轉(zhuǎn)運(yùn)代謝失衡易導(dǎo)致內(nèi)淋巴液高鉀低鈉的環(huán)境改變，從而誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水的產(chǎn)生。醛固酮(Aldosterone)在人體中主要調(diào)控鈉鉀代謝及液體容量平衡，而醛固酮受體在耳蝸有分布，并且主要表達(dá)于血管紋、Corti器、螺旋韌帶等部位[2]。研究發(fā)現(xiàn)醛固酮可誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水形成，但作用機(jī)制仍不清[3,4]。

在腎臟疾病研究中證實(shí)，ENaC是Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道蛋白，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AF9在腎臟的腎小管和部分腎小球中有表達(dá)[5]，醛固酮可抑制AF9與Dot1a蛋白的相互作用，促進(jìn)上皮鈉通道ENaC的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腎臟Na+代謝障礙，進(jìn)而引起腎臟纖維化、高血壓等疾病[6]。但AF9蛋白在內(nèi)耳中有無表達(dá)尚不清楚，在內(nèi)耳中AF9蛋白與醛固酮一同參與內(nèi)耳內(nèi)淋巴調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制亦缺乏相應(yīng)的研究支持。

推測(cè)，醛固酮可能與AF9分子相互作用參與耳蝸內(nèi)淋巴代謝調(diào)節(jié)。為此，采用醛固酮構(gòu)建內(nèi)淋巴積水模型，研究AF9在耳蝸組織中的表達(dá)及醛固酮對(duì)AF9表達(dá)及耳蝸功能的調(diào)控作用機(jī)制，進(jìn)而探討內(nèi)淋巴積水形成的可能分子機(jī)制，為梅尼埃病的發(fā)病機(jī)理尋找新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康白化紅目豚鼠，雄性，體重200～250g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，聲反射靈敏。將動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(Ald組)與對(duì)照組，共28只（實(shí)驗(yàn)組14只，對(duì)照組14只）。

1.2 試劑

兔抗鼠AF9多克隆抗體（Abcam，英國(guó)），醛固酮（Aldosterone，sigma，美國(guó)），SABC免疫組化試劑盒（博士德，SA1022）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建豚鼠內(nèi)淋巴積水模型

對(duì)照組豚鼠每天腹腔注射生理鹽水50μl，共5天，實(shí)驗(yàn)組豚鼠每天腹腔注射醛固酮0.1mg/kg/d，50μl,共5天。喂飼常規(guī)飲食，一個(gè)月后取材，行HE染色觀察內(nèi)淋巴積水形成。

1.3.2 行為學(xué)觀察

建模期間間隔3天觀察一次動(dòng)物日?；顒?dòng)，如耳廓反射靈敏度，有無眼球震顫、行走遲緩等現(xiàn)象。1.3.3 功能學(xué)檢測(cè)

造模前與造模一月取材前均行豚鼠雙耳ABR閾值測(cè)試。測(cè)試在電聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，儀器采用美國(guó)INTELLEGENT HEARING的誘發(fā)電位儀，測(cè)試的軟件為SMART EP，刺激聲為短聲，極性為交替波。1%戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，記錄電極置于顱頂，參考電極置于測(cè)試耳耳廓后，地極置于對(duì)側(cè)耳耳廓后，單頻單耳刺激給聲，檢測(cè)從80dB開始，每20dB為一階梯下降，觀察快接近閾值時(shí)再以10dB、5dB下降，引出ABR的反應(yīng)閾。

1.3.4 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

動(dòng)物腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，立即分別以生理鹽水及4%多聚甲醛行心臟灌流，待頭頸完全僵硬后快速斷頭游離顳骨。剪開聽泡，保留內(nèi)耳，蝸尖鉆孔，打開蝸窗及前庭窗，同時(shí)也取出腎臟。4%多聚甲醛中固定48 h，10%的乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraaceticacid，EDTA）溶液脫鈣1個(gè)月(兩天更換一次)，隨后梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，平行于蝸軸連續(xù)切片（片厚4ul），HE染色。前庭膜（Reissner’s膜）向前庭階膨隆為積水形成標(biāo)志。將內(nèi)淋巴積水程度分為輕度、中度及重度，膨隆部分面積占前庭階面積的0～1/3為輕度積水；1/3～2/3為中度積水；2/3以上為重度積水。

1.3.5 免疫組化

將耳蝸石蠟切片按照SABC法免疫組化試劑盒說明書操作，一抗為兔抗鼠AF9多克隆抗體（1：500），0.01M PBS代替一抗做為陰性空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性的腎臟做陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：顯微鏡下耳蝸細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)可見棕黃色顆粒者為AF9蛋白陽(yáng)性表達(dá)，無棕黃色顆粒者為陰性表達(dá)。用Im?age-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度（OD）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件處理全部數(shù)據(jù)，兩組豚鼠實(shí)驗(yàn)前后ABR閾值比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

觀察豚鼠耳廓反射靈敏，膽小易驚，未捕捉到眼球震顫、行走不穩(wěn)癥狀。

2.2 ABR檢測(cè)結(jié)果

如表1，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后比較，實(shí)驗(yàn)前ABR閾值為17.50±3.79，實(shí)驗(yàn)后ABR閾值為18.21±2.48，t=-0.69，P=0.50，ABR閾值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ald組實(shí)驗(yàn)前后比較，實(shí)驗(yàn)前ABR閾值為17.14±5.10，實(shí)驗(yàn)后 ABR閾值為 23.21±7.99，t=-2.88，P=0.01，ABR閾值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖1所示，Ald組實(shí)驗(yàn)后ABR閾值圖:左耳35dB，右耳15dB。

圖1 實(shí)驗(yàn)后ABR閾值：左耳35dB,右耳15dB。Fig.1 TheABR threshold after aldosterone treatment:Left ear 35dB,right ear 15dB.

2.3 形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果（HE染色）

觀察正常豚鼠切片發(fā)現(xiàn)耳蝸前庭階面積與蝸管的面積比值隨頂轉(zhuǎn)到底轉(zhuǎn)逐漸變大，前庭階、蝸管、鼓階的結(jié)構(gòu)正常，且前庭膜未向前庭階膨隆。按Re?issner’s膜向前庭階膨隆程度可分為輕、中、重度積水，造模一月后對(duì)照組豚鼠耳蝸未見明顯積水形成，Ald組取14只耳蝸，發(fā)現(xiàn)有10只出現(xiàn)輕度積水，底轉(zhuǎn)尤為明顯，余4只耳蝸未見明顯積水，造模成功率71%。見圖2(a、b)。

圖2 對(duì)照組(a)與Ald(b)組豚鼠耳蝸內(nèi)淋巴積水情況（HE× 100）。豚鼠耳蝸病理組織學(xué)切片（a:對(duì)照組：耳蝸結(jié)構(gòu)正常b:Ald組：內(nèi)淋巴積水）Fig.2 The endolymphatic hydrops condition of guinea pigs cochlear(a:control group,b:Ald group)（HE×100）.The histopathological section of guinea pig cochlea(a:control group:normal in cochlea b:endolymphatic hydrops in cochlea)

2.4 對(duì)照組與Ald組豚鼠AF9表達(dá)部位及OD值比較對(duì)照組與Ald組豚鼠耳蝸組織均有AF9蛋白表達(dá)，主要表達(dá)于血管紋、前庭膜、螺旋緣、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及前庭階骨膜的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及部分細(xì)胞核處，呈棕黃色顆粒狀，且在血管紋、前庭膜及螺旋緣處表達(dá)尤為明顯（圖3）。用腎臟作為陽(yáng)性對(duì)照，AF9蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖4）。

圖3 耳蝸免疫組化顯示AF9蛋白在耳蝸中的表達(dá)分布(× 100)，對(duì)照組(a)、Ald組(b)均表達(dá)于血管紋、前庭膜、螺旋緣、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及前庭階骨膜。（×100）Fig.3 The immunohistochemistry staining pattern for AF9 protein in guinea pig cochlea(×100).Both control group and Ald group showed AF9 protein in the stria vascularis,Reissner’s membrane,spiral limbus,organ of Corti,spiral ganglions and periosteum of scala vestibule.(×100)

圖4 腎臟免疫組化顯示AF9蛋白在腎臟中的表達(dá)分布（× 100）。Fig.4 The immunohistochemistry staining pattern for AF9 protein in guinea pigs kidney(×100).

可見Ald組耳蝸中陽(yáng)性表達(dá)部位處的顏色較對(duì)照組明顯變淺。其中對(duì)照組與Ald組前庭膜AF9表達(dá)的平均OD值分別為0.18±0.02和0.11±0.01，t= 5.55，P=0.01；血管紋表達(dá)的平均OD值分別為0.43± 0.04和0.28±0.04，t=3.12，P=0.03，Ald組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

目前，梅尼埃病的病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床也主要通過癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和排它法來診斷梅尼埃病。目前認(rèn)為梅尼埃病最主要的組織病理學(xué)改變?yōu)閮?nèi)淋巴積水。受論理道德局限，無法獲取大量人體顳骨樣本以及活體無法進(jìn)行內(nèi)淋巴積水組織病理學(xué)研究，因此選擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)淋巴積水動(dòng)物模型對(duì)于研究梅尼埃病發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。醛固酮（Aldo?sterone）是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的作用最強(qiáng)的一種鹽皮質(zhì)激素，主要用于維持體內(nèi)水容量平衡及鈉鉀代謝。1997年，Dunnebier等人利用兩相法通過手術(shù)破壞單耳內(nèi)淋巴囊及內(nèi)淋巴管后3周，給予醛固酮建立內(nèi)淋巴積水模型后，手術(shù)耳出現(xiàn)中、重度內(nèi)淋巴積水，對(duì)側(cè)耳出現(xiàn)輕度內(nèi)淋巴積水，推測(cè)醛固酮影響內(nèi)耳中Na+,K+-ATP酶活性，Na+/K+代謝紊亂所致[3]。隨后國(guó)內(nèi)有學(xué)者進(jìn)行了單一的醛固酮建模，并對(duì)手術(shù)單耳建模、手術(shù)雙耳建模、注射醛固酮組以及注射血管加壓素組建模方法進(jìn)行了對(duì)比研究，認(rèn)為醛固酮建模適于研究膜迷路積水的可能內(nèi)分泌代謝機(jī)制[4,7]。

表1 兩組豚鼠實(shí)驗(yàn)前后ABR閾值比較（dB SPL,±s）Table 1 TheABR thresholds of all animals before and after aldosterone treatment（dB SPL,±s）

表1 兩組豚鼠實(shí)驗(yàn)前后ABR閾值比較（dB SPL,±s）Table 1 TheABR thresholds of all animals before and after aldosterone treatment（dB SPL,±s）

注：與實(shí)驗(yàn)前ABR閾值比較，*P＜0.05。

Group n t valu p value The Control group TheAld group 14 14 ABR threshold Before 17.50±3.79 17.14±5.10 After 18.21±2.48 23.21±7.99*-0.69 -2.88 0.50 0.01

上皮鈉通道(Epithelial Sodium Channel，ENaC)是體內(nèi)調(diào)節(jié)水、Na+代謝的重要分子。我們的前期研究證實(shí)內(nèi)耳組織中有ENaC的表達(dá)[8,9]。運(yùn)用小鼠敲除Pendrin基因和豚鼠腹腔注射醋酸去氨加壓素構(gòu)建內(nèi)淋巴積水模型的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，ENaC參與內(nèi)淋巴積水形成[10,11]。腎臟相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮可下調(diào)AF9與DOT1a分子的表達(dá)來促進(jìn)ENaC的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腎臟鈉離子代謝障礙[5,6]。而在內(nèi)耳中是否也存在這種調(diào)節(jié)機(jī)制，參與內(nèi)淋巴代謝尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過豚鼠腹腔注射醛固酮構(gòu)建內(nèi)淋巴積水，對(duì)豚鼠內(nèi)耳的癥狀學(xué)、功能學(xué)及形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)行研究，初步探索了AF9蛋白在內(nèi)耳中的表達(dá)模式及與內(nèi)淋巴代謝的可能關(guān)系。

在造模過程中，本實(shí)驗(yàn)未能捕捉到豚鼠出現(xiàn)眼球震顫、行動(dòng)遲緩等典型梅尼埃病癥狀。最近有學(xué)者通過對(duì)確診為梅尼埃?。o臨床癥狀）的人體顳骨標(biāo)本進(jìn)行病例研究，認(rèn)為膜迷路積水的病理改變與MD的臨床特征不一定相一致[1]，而動(dòng)物的主觀癥狀本身較難獲取。

Ald組造模后豚鼠平均聽閾提高約5dB，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從臨床角度考慮，聽力損害較輕，這可能與種屬個(gè)體差異、藥物劑量、有效濃度維持時(shí)間、聽力損害程度及聽力損害已向痊愈方向轉(zhuǎn)歸等因素有關(guān)。但臨床上也存在血漿醛固酮水平低（聽力在正常值范圍）的老年人，較醛固酮水平高（正常高值）的聽力更差[12]；且文獻(xiàn)[13]在對(duì)自身免疫性聽力損失的小鼠模型研究中，鹽皮質(zhì)激素（包括醛固酮）與糖皮質(zhì)激素對(duì)聽力恢復(fù)療效相當(dāng)，甚至優(yōu)于糖皮質(zhì)激素。因此，本文推測(cè)醛固酮在安全用量范圍對(duì)聽力具有一定的保護(hù)作用，當(dāng)超過了安全劑量，可能觸發(fā)機(jī)體某些損傷作用機(jī)制，對(duì)聽力造成損害。

如圖2所示，由于動(dòng)物對(duì)藥物的反應(yīng)有差異，個(gè)別耳蝸積水形成較不明顯，但是耳蝸內(nèi)淋巴積水率仍達(dá)到71%。醛固酮造模方法相對(duì)于手術(shù)法[3]、免疫法等造模方法安全性高，穩(wěn)定性好。本文耳蝸積水主要存在于底轉(zhuǎn)，隨著積水程度加重，可能誘發(fā)高頻聽力下降。

看似無關(guān)聯(lián)的腎臟和內(nèi)耳卻都存在ENaC、非選擇性陽(yáng)離子通道、Na+，H+-交換體（NHE3）、Na+，K+-ATP酶、Na+，K+，Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC1）等[14]Na+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通道及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)腎臟和內(nèi)耳中的這些通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生障礙時(shí)，腎臟和內(nèi)耳都會(huì)出現(xiàn)代謝失調(diào)[14,15]?？梢娔I臟和內(nèi)耳擁有相似的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。ENaC屬高選擇性Na+通道，在多種具有Na+重吸收的組織（如腎臟、肺臟等）中有表達(dá)，擁有高K+低Na+特性的內(nèi)淋巴液的耳蝸組織中同樣有ENaC的定位表達(dá)，它能調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液容積，維持內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)[8,9]。在腎臟研究中證實(shí)，醛固酮對(duì)腎臟集合管上皮鈉通道（ENaC）基因及上皮Na+吸收起到重要調(diào)控作用。過表達(dá)AF9基因可導(dǎo)致內(nèi)源性αENaC啟動(dòng)子的組蛋白H3Lys79超甲基化，從而抑制mRNA水平上的αENaC，并與Dot1a協(xié)同干擾αENaC啟動(dòng)子熒光素酶合成；干擾敲除AF9基因的實(shí)驗(yàn)得出相反的結(jié)果，因此認(rèn)為醛固酮能在mRNA及蛋白質(zhì)水平下調(diào)AF9的表達(dá)[16]。因此，推測(cè)內(nèi)耳中也可能同樣存在醛固酮通過Dot1a-AF9途徑作用于ENaC的表觀遺傳學(xué)通路。

雖然有研究顯示AF9在腎臟的腎小管和部分腎小球中有表達(dá)，且參與醛固酮對(duì)ENaC的調(diào)節(jié)[6]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳中存在AF9表達(dá)。本文中實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)內(nèi)耳中有AF9分子的表達(dá)，并且在螺旋緣、血管紋及前庭膜的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，前庭階骨膜、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)處的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，與ENaC的三個(gè)不同亞基在內(nèi)耳中的表達(dá)部位相似[8]，皆是參與Na+代謝的重要部位。因此，AF9分子在內(nèi)耳中可能也參與對(duì)ENaC的調(diào)節(jié)，共同維持內(nèi)耳Na+穩(wěn)態(tài)。

Corti器感受聲音刺激，螺旋神經(jīng)則可能參與聽覺傳導(dǎo)，目前尚未證實(shí)ENaC是負(fù)責(zé)哺乳類聽覺的機(jī)械感覺通道[17]。如圖3所示，本實(shí)驗(yàn)中AF9蛋白在Corti器、螺旋神經(jīng)處表達(dá)很弱，因此推測(cè)該部位不是Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場(chǎng)所。而AF9蛋白在血管紋、前庭膜及螺旋緣處表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖3(a)）。內(nèi)耳中血管紋邊緣細(xì)胞中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)分泌出K+進(jìn)入中階，然后主要依靠Corti器的機(jī)械敏感細(xì)胞被動(dòng)排出K+以維持內(nèi)淋巴液成分及蝸管內(nèi)靜息電位的穩(wěn)定[18]。ENaC對(duì)Na+的吸收受前庭膜、球囊斑上皮、半規(guī)管上皮、內(nèi)淋巴囊[19]及血管紋邊緣細(xì)胞的管腔膜[20]控制。前庭膜主要通過阿米洛利選擇性通道主動(dòng)從內(nèi)淋巴液中吸收Na+，維持內(nèi)淋巴液低鈉內(nèi)環(huán)境，且不參與轉(zhuǎn)運(yùn)K+及內(nèi)淋巴K+穩(wěn)態(tài)的維持[21]。如圖3（b）所示，Ald組醛固酮作用后的內(nèi)淋巴處于高Na+環(huán)境，內(nèi)耳中的血管紋及前庭膜處的AF9蛋白表達(dá)量較正常組明顯降低，增強(qiáng)了ENaC蛋白的轉(zhuǎn)錄。推測(cè)前期血管紋及前庭膜代償性將內(nèi)淋巴中Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至外淋巴，同時(shí)血管紋的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將K+轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)淋巴；后期內(nèi)耳處于失代償階段時(shí)，內(nèi)淋巴逐漸處于異常低鉀高鈉內(nèi)環(huán)境。前庭膜滲透性的被動(dòng)吸收，從而導(dǎo)致內(nèi)淋巴積水的產(chǎn)生。

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，本研究得出如下基本結(jié)論：(1)醛固酮對(duì)內(nèi)淋巴積水的形成起著重要作用，并導(dǎo)致內(nèi)耳形態(tài)學(xué)及功能學(xué)均發(fā)生變化；（2）首次證實(shí)了AF9蛋白在內(nèi)耳血管紋、前庭膜、螺旋緣等Na+代謝的重要部位有表達(dá)；（3）醛固酮作用后，AF9蛋白在血管紋及前庭膜處表達(dá)明顯減弱，提示血管紋及前庭膜部位可能存在醛固酮通過Dot1a-AF9途徑作用于ENaC的表觀遺傳學(xué)通路。而在mRNA和蛋白水平上AF9與醛固酮在內(nèi)耳中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，并且醛固酮受體、醛固酮受體拮抗劑、DOT1a與AF9及ENaC在內(nèi)耳中又以何種關(guān)系存在有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Regulation ofAF9 protein expression and cochlearfunction by aldosterone in guinea pigs

QIN Li,ZHANG Biyun,ZHONG Shixun
Department of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

ObjectiveTo study the effect of aldosterone on AF9 protein expression and cochlear function in guinea pigs and to investigate possible roles of aldosterone and AF9 protein in the pathogenesis of endolymphatic hydrops.Methods Twenty-eight guinea pigs were randomly divided into a control and an aldosterone treatment group(Ald group).The Ald group received daily aldosterone at 0.1mg/kg/d intraperitoneally for 5 days,while the control group received equivalent normal saline treatment.After one month,cochlear function was tested by auditory brainstem response(ABR),morphology of cochlea was examined by Hematoxylin and Eosin staining,and expression of AF9 protein was evaluated by immunohistochemistry.RusultsCompared to the control group,the Ald group showed higher ABR thresholds(P＜0.05).Seventy-one percent of animals in the Ald group had endolymphatic hydrops.The AF9 protein was found in the stria vascularis,Reissner’s membrane,spiral limbus,organ of Corti,spiral ganglions and periosteum of scala vestibule.The expression of AF9 protein in stria vascularis and Reissner’s membrane in the Ald group was lower than that in the control group(P＜0.05). Conclusion AF9 protein involved in Na+regulation is present in the cochlea.Aldosterone participates in endolymph metabolism and influence the function of inner ear by regulating the expression ofAF9 protein.

Aldosterone；AF9 protein；Endolymphatic hydrops；Cochlear function

R764.35

A

1672-2922（2016）06-788-5

2016-07-14審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.017

1.重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（cstc2013jcy?jA10034）2.國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào)

秦麗，碩士，研究方向:內(nèi)耳病理生理學(xué)

鐘時(shí)勛，Email:zhongsx@sohu.com