王芳陳小婉徐百成劉曉雯朱一鳴陳興健郭玉芬

1甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730030）

2甘肅省蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730030）

·臨床研究·

2598例非綜合征型耳聾患者基因型與臨床表型的分析

王芳1陳小婉2徐百成1劉曉雯1朱一鳴1陳興健1郭玉芬1

1甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730030）

2甘肅省蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730030）

目的探討GJB2基因和線粒體DNAA1555G與臨床聽(tīng)力學(xué)、發(fā)病年齡的相關(guān)性。方法對(duì)收集的2598例非綜合征型耳聾患者進(jìn)行GJB2和線粒體DNAA1555G檢測(cè)，然后對(duì)GJB2純合與復(fù)合雜合突變患者的聽(tīng)力學(xué)表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對(duì)GJB2致病突變患者、線粒體DNAA1555G陽(yáng)性檢出者與患者的聽(tīng)力學(xué)表型及發(fā)病年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果①在GJB2純合突變樣本中，極重度、重度、中度、輕度的檢出率依次為74.65%、19.27%、5.63%、0%；復(fù)合雜合樣本中，極重度、重度、中度、輕度的檢出率依次是56.60%、37.74%、5.66%、0%。GJB2純合與復(fù)合雜合突變所致的聽(tīng)力損失程度之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.064，P=0.007）。②在GJB2致病突變患者中，聽(tīng)力損失程度構(gòu)成比：極重度10.43%、重度8.81%、中度8.03%、輕度0%，四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.32，P=0.04）。在線粒體DN?AA1555G陽(yáng)性患者中，聽(tīng)力損失程度構(gòu)成比之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.90，P=0.07）。③GJB2致病突變患者中語(yǔ)前聾發(fā)病率為11.96%，語(yǔ)后聾發(fā)病率為3.83%，二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.43，P=0.00）；GJB2致病突變患者中各年齡組之間的發(fā)病率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.36，P=0.00）。A1555G陽(yáng)性患者中語(yǔ)前聾與語(yǔ)后聾發(fā)病率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.089，P=0.766）；A1555G陽(yáng)性患者中各年齡組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.76，P= 0.59）。GJB2與A1555G基因突變患者在發(fā)病年齡構(gòu)成比上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.90，P=0.02）。結(jié)論GJB2純合突變患者的聽(tīng)力損失程度重于復(fù)合雜合突變患者；GJB2致病突變患者的聽(tīng)力損失程度以極重度為主，A1555G陽(yáng)性患者的聽(tīng)力損失程度相對(duì)較輕；GJB2致病突變患者多集中于語(yǔ)前聾，線粒體DNAA1555G陽(yáng)性患者在各年齡均可發(fā)病。

GJB2、線粒體DNAA1555G、聽(tīng)力損失、年齡

1 National Natural Science Foundation of China（81570926）；2 Gansu Provincial Youth Science and Technology Fund Projects（1606RJYA227）

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

目前，全世界范圍內(nèi)大概有3.6億耳聾患者，其在發(fā)達(dá)國(guó)家新生兒中的發(fā)病率大約是3‰[1]，在耳聾患者中，超過(guò)半數(shù)是由遺傳因素引起的，其中縫隙連接蛋白beta2（GJB2）和線粒體DNA（mtDNA）A1555G是目前較為常見(jiàn)的致聾基因，本研究將耳聾致病基因型與患者聽(tīng)力學(xué)表型、發(fā)病年齡相結(jié)合進(jìn)行分析，探討耳聾基因型與相關(guān)臨床表型的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2006年9月～2015年12月中國(guó)西北五省部分特殊教育學(xué)校的學(xué)生及五省散發(fā)病例共2598例非綜合征型耳聾患者，均為雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾。男：1508女：1090男：女=1.38檢測(cè)年齡0-70歲，平均：16.31±4.12。共13個(gè)民族：漢族：921維吾爾族：652回族：480東鄉(xiāng)族：267哈薩克族：77藏族：65柯?tīng)柨俗巫澹?5蒙古族：29保安族：20塔吉克族：19土族：17裕固族：10撒拉族：6，具有西北地區(qū)民族代表性。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查和電話家訪的方式進(jìn)行患者病史及家系資料的采集，排除具有中耳病變病史患者及綜合征型耳聾患者。對(duì)于3歲以上能夠配合者由專業(yè)人員進(jìn)行純音聽(tīng)閾測(cè)定，對(duì)于年齡較小及不能配合者行ABR及聲導(dǎo)抗檢測(cè)。按照2003年Mazzoci等歐洲工作組倡導(dǎo)的遺傳性聾的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]，將遺傳性聾的聽(tīng)力損失程度分為四級(jí)：輕度聾：26～40dB、中度聾：41～70dB、重度聾：71～95dB、極重度聾：＞95dB。雙耳聽(tīng)力損失不等時(shí)則以較輕耳為標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)簽署知情同意書(shū)后采取2598例患者的外周靜脈血（5～10ml）儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取及儲(chǔ)存

采用傳統(tǒng)酚氯仿法抽提白細(xì)胞中的基因組DNA，50ulTE溶解DNA，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)，-80°儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GJB2及mtDNAA1555G基因擴(kuò)增

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)GJB2第二外顯子及mtD?NAA1555G進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工合成，GJB2: Cx26-F:TGCTTACCCAGACTCGAGAA和Cx26-R: CGACTGAGCCT TGACAGCTGA，PCR產(chǎn)物片段大小為864bp。mtDNAA1555G：F：5′-TCAACCTCAC?CACCTCTT-3′和R：5′-TTTGTCGCCTCTACC?TA T-3′，PCR擴(kuò)增片段大小為767 bp。反應(yīng)體系：25ul。（表1）

將GJB2目的片段及使用A1w26I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后呈現(xiàn)陽(yáng)性的線粒體基因送生物公司測(cè)序。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析

將生物公司反饋的測(cè)序結(jié)果與野生型GJB2基因的標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank登錄號(hào)：M86849)和經(jīng)過(guò)校正的線粒體DNA劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank登錄號(hào)：NC_001807)進(jìn)行比對(duì)比，確定突變位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件，對(duì)GJB2致病突變患者中的純合與復(fù)合雜合突變患者的聽(tīng)力損失程度的差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，并分別對(duì)GJB2和mtDNAA1555G突變陽(yáng)性患者的聽(tīng)力損失程度、發(fā)病年齡構(gòu)成比進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（行列資料中當(dāng)理論頻數(shù)小于5的格子數(shù)的比例20%的情況下使用Fisher確切概率法，余使用卡方檢驗(yàn)）。

表1 GJB2及mtDNAA1555G基因擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 1 GJB2 and mtDNAA1555G gene amplification reaction system

2 結(jié)果

2.1 GJB2與mtDNAA1555G致病突變的陽(yáng)性檢出結(jié)果

2598例NSHL患者中，明確由GJB2致病突變（雙等位基因突變，排除常見(jiàn)的多肽及致聾機(jī)制不明確者）致聾的共有248例，突變率9.55%（248/2598），最常見(jiàn)的是235delC、299-300delAT、35delG，陽(yáng)性檢出率為74.60%（185/248）、31.05%（77/248）、15.32%（38/ 248）。176-191del16的陽(yáng)性檢出率為6.05%（15/ 248）。mtDNAA1555G陽(yáng)性共有146例，突變率5.62%（146/2598），其中具有氨基糖苷類藥物用藥史者79例，可疑用藥史者3例，用藥史不詳者31例，無(wú)用藥史者33例。

2.2 GJB2純合突變與復(fù)合雜合突變患者聽(tīng)力損失程度的對(duì)比分析

在248例GJB2致病突變患者中，GJB2純合突變樣本共142例，復(fù)合雜合突變樣本共106例，純合樣本在極重度中的檢出率最高，為74.65%（106/142），其次是重度與中度，分別為19.27%（28/142）、5.63%（8/142）。復(fù)合雜合樣本同樣在極重度檢出率最高，為56.60%（60/106），重度、中度依次是37.74%（40/ 106）、5.66%（6/106）。純合與復(fù)合雜合突變所致的聽(tīng)力損失程度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.064 P=0.007）。對(duì)235delC、299-300delAT、35delG純合與復(fù)合雜合突變的聽(tīng)力損失程度分別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)結(jié)果示235delC、299-300delAT純合與復(fù)合雜合突變所致的聽(tīng)力損失程度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 14.038 P=0.001、χ2=6.152 P=0.04）。35delG純合與復(fù)合雜合突變所致的聽(tīng)力損失程度之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.133 P=0.408）。（表2-1、2-2）

2.3 不同聽(tīng)力學(xué)表型人群的GJB2與mtDNAA1555G突變的陽(yáng)性檢出率

將耳聾患者的聽(tīng)力損失程度分為四度：輕度、中度、重度、極重度，在GJB2致病突變的患者中，極重度的比例最高，為10.43%（162/1553），其次依次為重度（8.81%，75/851）、中度（8.03%，11/137），輕度（0%）。四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.32 P= 0.04）。在mtDNAA1555G陽(yáng)性患者中，重度聽(tīng)力損失比例最高，為6.11%（52/851），其次是極重度（5.86%，91/1553）、輕度（1.75%，1/57）、中度（1.46%，2/137），四組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.901 P= 0.068）。（表3）

2.4 不同發(fā)病年齡人群的GJB2與mtDNAA1555G突變的陽(yáng)性檢出率

本研究將發(fā)病年齡（y）分為成人組（y≥18）、嬰兒組(y≤1)、幼兒組（1＜y≤3）、學(xué)齡前組（3＜y≤6）及學(xué)齡組（6＜y＜18）。將y≤3歸為語(yǔ)前聾，y＞3歸為語(yǔ)后聾[3]，GJB2致病突變患者中語(yǔ)前聾發(fā)病率為11.96%（236/2018），語(yǔ)后聾發(fā)病率為3.83%（9/235），二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.434 P= 0.000）。不同發(fā)病年齡組之間的GJB2致病突變陽(yáng)性檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.360 P=0.001）。A1555G陽(yáng)性患者中語(yǔ)前聾發(fā)病率為5.90%（119/ 2018），語(yǔ)后聾發(fā)病率為6.38%（15/235），二者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.089 P=0.766），不同發(fā)病年齡組之間的A1555G陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.755 P=0.59）。GJB2與A1555G基因突變患者在發(fā)病年齡構(gòu)成比上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.901 P=0.019）。（表4）

表2-1 GJB2純合與復(fù)合雜合突變患者聽(tīng)力損失程度構(gòu)成比Table2 -1 Proportion of hearing loss in patients with GJB2 homozygous and compound heterozygous mutations

表2-2 GJB2不同基因型與聽(tīng)力損失程度構(gòu)成比Table 2 -2 GJB2 different genotypes and the degree of hearing loss ratio

3 討論

在2598例NSHL患者中，GJB2致病突變率為9.55%，低于全國(guó)GJB2總體致病突變率12.88%[4]，這可能與地域、民族之間的差異以及樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。mtDNAA1555G陽(yáng)性檢出率5.62%，高于國(guó)內(nèi)整體檢出水平，但與朱慶文[5]對(duì)西北樣本A1555G的檢出率相近，說(shuō)明西北地區(qū)的線粒體遺傳背景有別于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)，具體原因仍需更進(jìn)一步細(xì)致的分析。

GJB2致病突變引起的聽(tīng)力損失程度與基因突變類型和位點(diǎn)有關(guān)，多為重度和極重度聽(tīng)力損失[6]。本研究中，對(duì)248例GJB2致病突變的陽(yáng)性患者進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)純合突變與復(fù)合雜合突變引起的聽(tīng)力損失程度都以極重度為主，純合突變引起的聽(tīng)力損失程度要重于復(fù)合雜合突變引起的聽(tīng)力損失程度，他們之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，235delC和299-300delAT純合型突變患者聽(tīng)力損失程度要重于復(fù)合雜合型，而35delG純合型與復(fù)合雜合型突變患者的聽(tīng)力損失程度無(wú)明顯差異。但在Denoyelle等[7]的研究中表明35delG純合型突變患者的聽(tīng)力損失要明顯重于復(fù)合雜合型突變患者，這與本研究的結(jié)果不同，可能與地域不同、研究對(duì)象的種族不同等有關(guān)。

在248例GJB2致病突變的陽(yáng)性患者中，極重度聽(tīng)力損失的比例最高，為10.43%，重度（8.81%）與中度（8.03%）相近，未檢測(cè)到輕度聽(tīng)力損失患者，四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與代志瑤[8]研究結(jié)果相近。A1555G突變患者的聽(tīng)力損失程度較GJB2輕，但差異較大，以重度（8.70%）為主，其次是極重度（4.44%）、輕度（1.75%）、中度（1.46%），四組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與mtDNA的拷貝數(shù)、線粒體單倍型、外界環(huán)境因素及核修飾基因有關(guān)[9-11]。線粒體突變異質(zhì)性對(duì)耳聾的發(fā)生與發(fā)展也有重要影響[12-13]，與野生型mtDNA相比，突變型mtDNA具有復(fù)制優(yōu)勢(shì)，突變型mtDNA所占的比例越高，耳聾程度越嚴(yán)重[14]。另有研究證實(shí)氨基糖苷類藥物對(duì)A1555G突變耳聾患者的臨床表型具有誘發(fā)或加重作用[15]，因A1555G位于氨酰tRNA核糖體小亞基的受體位點(diǎn)（A點(diǎn)位），這是一高度保守的區(qū)域，該突變使得線粒體12SrRNA上的第1494和1555兩個(gè)位點(diǎn)形成新的堿基對(duì)（C1494-1555G），形成與氨基糖苷類藥物結(jié)合的位點(diǎn)，從而影響線粒體蛋白質(zhì)的合成而導(dǎo)致藥物性耳聾[16]。2002年，Morales等[17]對(duì) 6個(gè)攜帶12SrRNA A1555G突變且無(wú)血緣關(guān)系的家系中的55位患者進(jìn)行研究表明，未使用氨基糖苷類藥物的耳聾患者聽(tīng)力損失多是遲發(fā)性的輕度至中度感音神經(jīng)性耳聾，在17例使用氨基糖苷類藥物的患者中多出現(xiàn)重度聽(tīng)力損失。本研究中，79例明確有氨基糖苷類用藥史者，極重度聾占62.03%（49/79），重度占35.44%（28/79），中度占2.53%（2/79），在33例明確無(wú)氨基糖苷類用藥史者，極重度占39.39%（13/33），重度占60.61%（20/33），可見(jiàn)氨基糖苷類藥物可加重患者的聽(tīng)力損失程度，且應(yīng)用藥物的劑量越大、年齡越小，聽(tīng)力損失程度越重[18]。

表3 GJB2與mtDNAA1555G突變陽(yáng)性者的聽(tīng)力損失程度構(gòu)成比Table 3 The degree of hearing loss in GJB2 and mtDNAA1555G mutation positive patients

表4 GJB2與mtDNAA1555G突變陽(yáng)性者的年齡構(gòu)成比Table4 Age composition ratio of GJB2 and mtDNAA1555G mutation positive persons

GJB2致病突變的陽(yáng)性患者的發(fā)病年齡主要集中在語(yǔ)前聾中，特別是y≤1的嬰兒最常見(jiàn)，與語(yǔ)后聾之間具有顯著的差異，因此臨床醫(yī)師在對(duì)耳聾患者基因篩查中，要特別重視語(yǔ)前聾患者，尤其是嬰兒患者的GJB2篩查。A1555G突變陽(yáng)性患者發(fā)病年齡分散，在語(yǔ)前聾與語(yǔ)后聾均可發(fā)病，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要與氨基糖苷類藥物的使用時(shí)間相關(guān)，患者可在使用藥物后3天到3個(gè)月左右發(fā)病，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)“一針致聾”現(xiàn)象[19]。A1555G突變多見(jiàn)于母系遺傳，因此在篩查中要對(duì)母系患者所有成員進(jìn)行易感基因的篩查，檢測(cè)出一例突變攜帶者，即可根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律發(fā)現(xiàn)攜帶有突變但未耳聾的多名母系成員，對(duì)其進(jìn)行用藥指導(dǎo)，可以有效地避免藥物性耳聾的發(fā)生。

GJB2與A1555G在西北地區(qū)有著較高的突變率，通過(guò)本研究，我們可以根據(jù)患者的聽(tīng)力損失程度及發(fā)病年齡優(yōu)先選擇不同的耳聾基因檢測(cè)，嬰幼兒患者、聽(tīng)力損失重者可優(yōu)先篩查GJB2基因；發(fā)病年齡較晚、聽(tīng)力損失較輕者、有氨基糖苷類用藥史者、懷疑母系遺傳者可以優(yōu)先選擇A1555G基因篩查，做到早期干預(yù)。

本研究的一些不足之處：在部分偏遠(yuǎn)的西北地區(qū)，由于經(jīng)濟(jì)條件落后、文化水平低、患者本人及家屬重視程度不足等會(huì)造成輕度聽(tīng)力損失患者不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)自己的病情，因此會(huì)造成研究中輕度聽(tīng)力損失患者數(shù)據(jù)納入的差異。另外，本研究的對(duì)象多來(lái)自西北五省特殊教育學(xué)校的未成年人，在年齡上未能全面覆蓋西北耳聾人群樣本，但本研究的結(jié)果仍可作為西北地區(qū)耳聾基因型與相關(guān)臨床表型分析的一個(gè)參照。

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Analysis of Genotypes and Clinical Phenotypes in 2,598 Patients with Non-Syndromic Deafness

WANG Fang1,CHEN Xiaowan2,XU Baicheng1,LIU Xiaowen1,ZHU Yiming1,CHEN Xingjian1,GUO Yufen1
1 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,the Second Hospital of Lanzhou University(Lanzhou,730030)
2 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,the First Hospital of Lanzhou University(Lanzhou,730030)

ObjectiveTo investigate the correlation between GJB2 gene and mitochondrial DNAA1555G mutation and clinical audiology and age of onset in non-syndromic deafness.MethodsGJB2 and mitochondrial DNAA1555G mutations were tested in 2,598 patients with non-syndrome deafness and the results analyzed.ResultsHearing loss caused by GJB2 homozygous mutations was different from that caused by GJB2 compound heterozygous mutations(χ2=10.064,P= 0.007).The rate of GJB2 pathogenic mutations was highest in patients with profound hearing loss(10.43%),followed by patients with severe(8.81%)and moderate hearing(8.03%)(χ2=8.32,P=0.04).No GJB2 pathogenic mutation was found in patients with mild hearing loss.The mtDNAA1555G detection rate showed no significant difference among patients with different degrees of hearing loss(χ2=6.901,P=0.068).The prevalence of GJB2 pathogenic mutations was higher in patients with pre-lingual deafness(11.96%)than those with post-lingual deafness(3.83%)(χ2=13.434,P=0.000),while the prevalence of mtDNAA1555G mutation showed no significant difference(χ2=0.089,P=0.766).The age of deafness onset was dif-ferent in patients with GJB2 mutations than those with mtDNAA1555G mutation(χ2=9.901,P=0.019).ConclusionsOur study shows that hearing loss in patients with GJB2 homozygous mutations is more severe than those with compound mutations,and is in the profound loss category in most cases.Hearing loss in patients with mtDNAA1555G mutation is relatively mild.GJB2 mutations tend to cause pre-lingual onset deafness,while mtDNAA1555G mutation seems to affect patient of various ages.

GJB2、mitochondrial DNAA1555G、hearing loss、age

R764.43

A

1672-2922（2016）06-747-6

2016-09-03審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.010

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81570926)、甘肅省省青年科技基金計(jì)劃（編號(hào)：1606RJYA227）

王芳，碩士研究生，研究方向：耳聾基因型與相關(guān)臨床表型

郭玉芬，Email：gyflhmm@163.com