劉樂環(huán)，茅玉煒，黎翊君，戴俊東，黃瑞雪，余家齊，王漸鴻

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 100102）

姜黃素炎癥靶向自微乳的制備及質量評價＊

劉樂環(huán)，茅玉煒，黎翊君，戴俊東＊＊，黃瑞雪，余家齊，王漸鴻

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 100102）

目的：制備負電荷的姜黃素炎癥靶向自微乳給藥系統(tǒng)（NC-CUR-SMEDDS），并對其進行質量評價。方法：在前期姜黃素自微乳（CUR-SMEDDS）的研究基礎上，以乳劑的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量為評價指標，通過單因素試驗篩選電荷調節(jié)劑的最佳用量，制備NC-CUR-SMEDDS。通過觀察微乳外觀和微觀形態(tài)并測定其粒徑、Zeta電位、包封率及載藥量對其進行質量評價。結果：當加入處方量4%的丁二酸二辛酯磺酸鈉時，所形成的微乳Zeta電位可以達到-43.43±0.29 mV，外觀澄清、透明，粒徑分布均勻，平均粒徑為14.08±0.082 nm，姜黃素載藥量為26.48 mg·g-1，包封率為94.12%。結論：NC-CUR-SMEDDS包封率高，帶負電，粒徑分布均勻，符合結腸炎癥靶向要求。

姜黃素 負電荷 炎癥靶向 自微乳給藥系統(tǒng) 質量評價

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種病因不明的腸道非特異性炎癥，易復發(fā)，患者生存質量差，可能導致嚴重并發(fā)癥，甚至存在癌變可能，目前尚無有效的根治措施[1，2]。當前，臨床治療UC的藥物普遍存在靶向性差的問題，導致炎癥部位藥物濃度偏低，治療效果不佳；糖皮質激素類藥物給藥后經吸收入血藥量偏高，全身毒副作用較大[3]。所以，如何將藥物特異性靶向作用于結腸炎癥部位，實現(xiàn)UC的炎癥靶向治療，已成為國內外的研究熱點。

分子生物學的研究表明，結腸炎癥部位的轉鐵蛋白（Transferrin，TF）[4]、殺菌/通透性增強蛋白（Bactericidal/permeability-increasing Protein，BPI）[5]、嗜酸細胞陽離子蛋白（Eosinophilcationic Proteins，ECP）[6]等陽離子蛋白表達異常增高，因此使得結腸炎癥部位帶正電荷。根據此特點制備的炎癥靶向水凝膠[7]、荷負電脂質體[8]等，均表現(xiàn)出良好的炎癥靶向性。

本課題組前期制備的姜黃素-胡椒堿復方自微乳（CUR-PIP-SMEDDS）[9]，可以顯著提高姜黃素的溶解度、穩(wěn)定性和對急性潰瘍性結腸炎的治療作用。本研究擬在前期試驗的基礎上，通過加入可使自微乳帶負電的輔料，制備姜黃素炎癥靶向自微乳（Negatively Charged Curcumin Self-microemulsifying Drug Delivery System，NC-CUR-SMEDDS）。利用自微乳乳化后表面負電荷與結腸炎癥部位的靜電吸附作用和納米粒子的高度分散作用使藥物靶向作用于結腸炎癥部位[10]，為炎癥性腸病的治療藥物，特別是全身毒副作用較大的糖皮質激素和免疫抑制劑等藥物的制劑研發(fā)提供新思路、新方法。

1 材料

1.1 儀器

SPD-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Purospher STAR LP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，德國默克公司）；BSA223S-CW型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；NANO-ZS型動態(tài)光散射粒徑儀（英國馬爾文公司）；Sigma 1-6P小型臺式低速離心機（德國賽多利斯科學儀器有限公司）； JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本 JEOL 公司)；RT10 Power IKA?-WERKE多點加熱磁力攪拌器（上海大邁儀器有限公司）。

1.2 試劑

CUR對照品（純度≥98%，上海詩丹德生物技術有限公司，批號：1784）；CUR原料藥（純度=95%，上海源葉生物科技有限公司，批號：R03D6S6966）；丁二酸二辛酯磺酸鈉（純度=96%，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10050237）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40，北京鳳禮精求商貿有限責任公司，批號：87712168E0）；二乙二醇單乙基醚（Transcutol HP，法國Gattefossé公司，批號：143339）；丙二醇單辛酸酯（Capryol 90，法國Gattefossé公司，批號：141329）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 處方優(yōu)化與制備

2.1.1 色譜條件

采用Purospher STAR LP C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；以乙腈-4%冰醋酸溶液（55:45）為流動相；流速1 mL·min-1；檢測波長428 nm；柱溫30 ℃，進樣量5 μL。理論塔板數按姜黃素峰計算應不低于4 000[11]。

2.1.2 藥物的包封率與載藥量

按文獻方法[11]，精密稱取NC-CUR-SMEDDS 0.050 g（W0），加甲醇超聲溶解，依法檢測藥物含量（W1）。另取NC-CUR-SMEDDS 0.1 g，精密稱定，加37℃的純化水溶解，依法檢測藥物含量（W2）。主要計算公式如下：

2.1.3 電荷調節(jié)劑用量篩選

自微乳乳化后表面的電性直接影響制劑的靶向性，根據預實驗結果，選擇調節(jié)電荷能力較強的丁二酸二辛酯磺酸鈉作為電荷調節(jié)劑，按處方量[9]（Cremophor RH40: Transcutol HP : Capryol 90=6:3:1）的2%、4%、6%、8%和10%加入，置于50 mL燒杯中，70℃，100 r·min-1磁力攪拌10 min，制備空白SMEDDS。取空白SMEDDS 1.0 g，加入過量CUR原料藥，磁力攪拌混勻后超聲助溶30 min，室溫放置12 h，使藥物達到溶解平衡，即得NC-CURSMEDDS。以粒徑、Zeta電位、載藥量和包封率作為評價指標，采用單因素實驗篩選丁二酸二辛酯磺酸鈉的加入量，實驗結果見表1。

實驗結果表明，隨輔料加入量的增加，其電位的絕對值呈逐漸升高趨勢，但其載藥量和包封率呈下降趨勢。綜合考慮，選擇4%作為丁二酸二辛酯磺酸鈉的最佳加入量。

表1 丁二酸二辛酯磺酸鈉 單因素實驗篩選結果（n=3）

2.1.4 處方藥物加入量的確定

取含4%的丁二酸二辛酯磺酸鈉的空白自微乳1.0 g，分別加入CUR 60.0、50.0、40.0、30.0、20.0 mg，攪拌混合均勻，超聲助溶。然后，分別用37℃純化水稀釋100倍，在15 min內60.0 mg和50.0 mg組均有藥物析出，說明載藥量過大，體系不穩(wěn)定。因此，選擇40.0 mg、30.0 mg和20.0 mg組分別測定0 h和放置8 h后的粒徑、載藥量和包封率，實驗結果見表2。

由表2和圖1的結果可知，40 mg組放置8 h后，有明顯的藥物析出，取上清液測定粒徑，粒徑明顯增大，包封率和載藥量也明顯下降，說明8 h內穩(wěn)定性較差；30 mg組在8 h內有少許藥物析出，粒徑基本保持在14 nm左右，包封率和載藥量8 h內降低較少，基本保持穩(wěn)定；20 mg組在8 h內無藥物析出，粒徑、包封率和載藥量均未發(fā)生變化，穩(wěn)定性最好，但載藥量較低，僅為17.84 mg 左右。綜合考慮，選擇處方藥物加入量為30 mg。

2.1.5 NC-CUR-SMEDDS的制備

取Cremophor RH40 6.0 g，Transcutol HP 3.0 g，Capryol 90 1.0 g，丁二酸二辛酯磺酸鈉0.4 g，置于50 mL燒杯中，70℃，100 r·min-1磁力攪拌10 min，得空白SMEDDS；稱取空白SMEDDS 1.0 g，加入CUR原料藥30.0 mg，37℃，50 r·min-1磁力攪拌15 min使之完全溶解，得NC-CUR-SMEDDS。

2.2 NC-CUR-SMEDDS的質量評價

2.2.1 外觀

NC-CUR-SMEDDS在4℃時為黏稠、不透明的深紅色液體；25℃時為澄清、流動性相對較好、透明的深紅色溶液。分別用純化水、PBS緩沖液稀釋100倍后，所得微乳為澄清、流動性好、透明的橙黃色溶液。

2.2.2 微觀形態(tài)

取NC-CUR-SMEDDS適量，37℃純化水稀釋500倍后用2%磷鎢酸染色，透射電鏡下觀察，結果見圖2。NC-CUR-SMEDDS經純化水稀釋后呈圓球型，形態(tài)規(guī)則，大小較均勻，乳滴之間無粘連，粒徑大小在10-50 nm。

2.2.3 粒徑分布與Zeta電位

取自微乳適量，37℃純化水稀釋50倍，制備Zeta電位測定用微乳溶液；PBS緩沖液稀釋100倍，制備粒徑測定用微乳溶液。采用馬爾文動態(tài)光散射粒徑儀分別檢測空白乳、CUR-SMEDDS和NCCUR-SMEDDS的Zeta電位和平均粒徑，結果見表3。

2.3.4 藥物的包封率與載藥量

NC-CUR-SMEDDS中CUR的包封率和載藥量測定方法同2.1.2。實驗結果得CUR的包封率為94.12%，載藥量為26.48 mg·g-1。

表2 NC-CUR-SMEDDS加藥量的確定（n=3）

圖1 0 h和8 h不同加藥量自微乳純化水稀釋100倍的微乳外觀形態(tài)

圖2 NC-CUR-SMEDDS乳化后透射電鏡圖（×80 000倍）

3 討論

結腸黏蛋白是柱狀上皮細胞和杯狀細胞分泌的糖蛋白，主要功能是保護腸壁黏膜細胞和潤滑腸腔。聚糖中大量的神經氨酸與硫酸殘基上帶有負電荷，使得結腸組織表面帶負電。文獻報道[12]，在自微乳處方中加入1%油胺，制備得到羥基喜樹堿正電荷自微乳，與負電荷自微乳相比能顯著提高藥物的口服吸收。作者推測其原因主要與正電荷自微乳在體內乳化形成的正電荷微乳乳滴與帶負電荷的小腸上皮細胞膜之間產生的靜電吸附作用有關。

有研究表明，在UC的活動期，黏蛋白的硫酸化程度降低[13]。同時，在炎癥部位，一些陽離子蛋白[4-6]表達異常增高，使得結腸組織表面的電性由帶負電變?yōu)閹д?。根據結腸表面帶正電的特點，JubehT[8]等制備了不同Zeta電位（-28 mV，-66 mV）的負電荷脂質體，通過UC大鼠體外粘附試驗表明負電荷脂質體在炎癥組織部位的吸附強度是正電荷和電中性脂質體的2倍。在正常組織部位，正電荷和電中性脂質體的吸附強度是負電荷脂質體的3倍。其黏附程度與脂質體所帶電荷多少直接相關。Zhang S[7]等分別采用DSS和T-bet-/-Rag2-/-（TRUC）制備BALB/c小鼠UC模型，通過小動物在體熒光檢測技術進行體外（In vitro），間接體內（ex vivo）和體內（in vivo）黏附實驗，證實負電水凝膠（Zeta電位在-40 mV左右）在UC動物模型結腸炎癥部位體現(xiàn)出良好的炎癥靶向作用，與正常動物對照組相比有顯著性差異（P＜0.000 1，P=0.012 0，P=0.044 0）。Tirosh B[4]等利用炎癥部位轉鐵蛋白表達增高使結腸組織帶正電的原理，制備了負電荷脂質體（Zeta電位為-35 mV），亦達到了較好的炎癥靶向效果。綜合考慮上述研究成果，本研究將Zeta電位小于-30 mV作為輔料篩選的指標。

通過檢索文獻，本實驗選擇了具有乳化作用的?；敲撗跄懰徕c、?；悄懰徕c、脫氧膽酸鈉、油酸、油酸鈉、抗壞血酸棕櫚酸酯和丁二酸二辛酯磺酸鈉作為自微乳的電荷調節(jié)劑。在不改變油相，助表面活性劑，表面活性劑的前提下，加入不同用量的輔料，測定Zeta電位，比較不同輔料之間使自微乳帶負電的能力大小。試驗結果表明?；敲撗跄懰徕c、?；悄懰徕c和油酸鈉在空白自微乳中溶解性較差，在最大溶解度范圍內，Zeta電位難以達到-30 mV以下；油酸和抗壞血酸棕櫚酸酯調節(jié)電荷的能力較弱；脫氧膽酸鈉和丁二酸二辛酯磺酸鈉溶解度相對較好，在加入相同量的脫氧膽酸鈉和丁二酸二辛酯磺酸鈉時，丁二酸二辛酯磺酸鈉調節(jié)電荷的能力較強，加入2%時電位即可小于-30 mV，可以達到炎癥靶向需要的電位要求，因此選擇丁二酸二辛酯磺酸鈉作為最佳電荷調節(jié)劑。

表3 NC-CUR-SMEDDS處方粒徑和Zeta電位（n=3）

Zeta電位是表征離子表面電荷情況的一個重要指標，Zeta 電位大于60 mV（或小于-60 mV）時，荷電粒子相當穩(wěn)定；Zeta電位在30-60 mV時（或在-30--60 mV），荷電粒子比較穩(wěn)定；在Zeta電位小于30 mV（或大于-30 mV）時，荷電粒子不穩(wěn)定，容易聚集[14]。本研究制備的自微乳Zeta電位為-43.43 mV，性質穩(wěn)定。

與前述文獻中具有炎癥靶向作用的荷負電脂質體和水凝膠相比，本研究制備的負電荷自微乳制備工藝簡單、性質穩(wěn)定，更易于工業(yè)化生產。可直接填充于軟膠囊，或經由微粉硅膠等固體吸附劑吸附后制備固體制劑[15]。然后根據結腸組織的生理結構特點進一步制備pH依賴型、時間依賴型、壓力控制型、酶依賴型、pH-時間依賴型、pH-酶依賴型以及pH-時間-酶依賴型等口服結腸定位給藥制劑（Oral Colon-targeted Drug Delivery System，OCDDS）[16]，避免藥物在體內上消化道的損失，從而實現(xiàn)制劑的結腸靶向作用。到達結腸后，本研究制備的自微乳可自發(fā)形成粒徑小于20 nm O/W型微乳，通過靜電吸附作用實現(xiàn)結腸炎癥部位的靶向給藥，顯著提高難溶性藥物的溶解性、穩(wěn)定性和臨床治療效果。

本研究主要是解決自微乳到達結腸部位后在炎癥部位的靶向性問題。后續(xù)工作將進一步研究結腸靶向制劑及自微乳中表面活性劑長期使用可能造成的胃腸道黏膜刺激、黏膜滲透性改變和對全身的慢性毒性等問題[17]。

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Preparation and Quality Evaluation of Negatively Charged Self-Microemulsifying Drug Delivery System of Curcumin

Liu Lehuan, Mao Yuwei, Li Yijun, Dai Jundong, Huang Ruixue, Yu Jiaqi, Wang Jianhong
(School of Chinese MateriaMedica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

The aim of the study was to prepare and evaluate the quality of negatively charged selfmicroemulsifying drug delivery system of curcumin (NC-CUR-SMEDDS). Based on the CUR-SMEDDS, the optimum amount of excipients was confirmed by the single-factor design experiment taking mean particle size, Zeta potential, drug entrapment efficiency and the drug loadings of curcumin as the evaluation indices for the preparation of NC-CUR-SMEDDS. The quality of NC-CUR-SMEDDS was evaluated by observing its appearance status, transmission electron microscope micrographs and determining particle diameter, Zeta electric potential, drug entrapment efficiency and drug loading. As a result, it was found that the Zeta potential reached -43.43±0.29 mV when 4% docusate sodium was added. The appearance of NC-CUR-SMEDDS remained clarified and transparent, and the microemulsion droplets appeared spherical without aggregation with uniform particle size distribution. The mean particle size was 14.08±0.082 nm, the drug loading of curcumin was 26.48 mg·g-1and the drug entrapment efficiency was 94.12%. It was concluded that NC-CUR-SMEDDS with high entrapment efficiency and uniform particle size distribution met the requirement of inflammatory target binding in the colon.

Curcumin, negatively charged, inflammatory target binding, self-microemulsifying drug delivery system, quality evaluation

10.11842/wst.2016.12.022

R943

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-01

修回日期：2016-12-11

＊ 北京中醫(yī)藥大學自主選題項目（2016-JYB-XS072）：姜黃素炎癥靶向自微乳治療潰瘍性結腸炎研究，負責人：劉樂環(huán)。

＊＊ 通訊作者：戴俊東，副教授，碩士生導師，主要研究方向：分子藥劑學與新型給藥系統(tǒng)研究。