王辛艷，申佩弘，華燕飛，李俊芳，張 敏，武 波

(1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004；3. 廣西民族師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣西崇左532200)

一株轉(zhuǎn)化反式茴香腦產(chǎn)茴香酸菌株的篩選鑒定

王辛艷1，2，申佩弘1，2，華燕飛1，2，李俊芳1，張 敏1，武 波2，3

(1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004；3. 廣西民族師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣西崇左532200)

經(jīng)過梯度馴化及富集篩選，從環(huán)境樣品中分離獲得348株能以反式茴香腦為唯一碳源的菌株。通過薄層層析法和反相高效液相法對(duì)轉(zhuǎn)化液中的殘余反式茴香腦和茴香酸進(jìn)行定量分析，最后得到一株對(duì)反式茴香腦耐受能力和茴香酸產(chǎn)量都較高菌株WGBF9。在含體積分?jǐn)?shù)為10%的反式茴香腦的種子培養(yǎng)基中，菌體的生物量為空白對(duì)照的37.42%，在含體積分?jǐn)?shù)為20%反式茴香腦時(shí)，生物量也能達(dá)到空白對(duì)照的26.57%，說明WGBF9對(duì)反式茴香腦具有很高的耐受能力。將該菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下發(fā)酵36 h，茴香酸的摩爾生成率為17.9%。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化等實(shí)驗(yàn)分析，初步鑒定WGBF9為惡臭假單胞菌A類變種(PseudomonasputidabiotypeA)中的一個(gè)亞種。

惡臭假單胞菌；反式茴香腦；茴香酸

茴香酸(Anisic acid)又名對(duì)甲氧基苯甲酸或4-甲氧基苯甲酸，廣泛用于食品、化妝品、制藥等多個(gè)行業(yè)中[1-3]，是很好的保鮮劑、保香劑、驅(qū)蟲劑和殺卵劑。在化妝品中茴香酸既可以作為抑菌劑[4]，也可以作為生物體中黑色素產(chǎn)生的關(guān)鍵酶酪氨酸酶的抑制劑[5]；它同時(shí)也是改善腦部功能和精神記憶疾病的茴拉西坦[6]、治療心律失常等心血管疾病的乙胺碘呋酮[7]、針對(duì)痛風(fēng)及并發(fā)癥疾病的苯溴馬隆[8]、預(yù)防早產(chǎn)的利托君[9]等藥物的中間物質(zhì)；有學(xué)者通過化學(xué)合成法將茴香酸和甲酸合成茴香酸甲酯，后者具有水果氣味和茴香的甜味，多用于調(diào)配各類香精[10]。

八角果實(shí)或枝葉蒸餾得到八角茴香油中反式茴香腦的體積比例達(dá)80%～90%。八角在中國的廣西、廣東、云南等亞熱帶氣候地區(qū)的種植量大，是重要出口產(chǎn)品，占全球市場85%的份額，對(duì)中國的林業(yè)發(fā)展具有重要意義[11]。但由于缺乏好的技術(shù)，八角的深加工研究和實(shí)際應(yīng)用并不多，其潛在的價(jià)值沒有得到充分發(fā)掘[11-12]。在茴香油中茴香酸的含量低，難以直接分離。早些年，茴香酸多數(shù)是通過化學(xué)工藝獲得[13]，近年來，基于對(duì)經(jīng)濟(jì)效益的追求，很多化學(xué)轉(zhuǎn)化和微生物轉(zhuǎn)化工藝不斷被探索和改進(jìn)[2，14-18]。微生物轉(zhuǎn)化一直被公認(rèn)為是一種環(huán)保、高效、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法，在反式茴香腦的深加工中有廣闊的運(yùn)用前景。但受限于微生物對(duì)反式茴香腦的低耐受性及低轉(zhuǎn)化率，分離的菌株，無論是擔(dān)子菌、節(jié)桿菌還是假單胞菌，均尚未應(yīng)用于茴香腦轉(zhuǎn)化成茴香酸的工業(yè)化生產(chǎn)[2， 19-20]。本研究擬利用來自廣西八角產(chǎn)區(qū)的樣品，篩選出能耐受較高濃度反式茴香腦同時(shí)高產(chǎn)茴香酸的菌株，為反式茴香腦的生物轉(zhuǎn)化提供微生物菌種資源。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

反式茴香腦(體積分?jǐn)?shù)為98%+，色譜純)、茴香酸(體積分?jǐn)?shù)為99%+，色譜純)、茴香醛(體積分?jǐn)?shù)為99%+，色譜純)均購于東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCI)；反式茴香腦(體積分?jǐn)?shù)為98%+，分析純)購于Adamas；乙腈和甲醇(色譜純)購于Thermo Fisher Scientific；乙酸乙酯(分析純)購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他化學(xué)試劑都為分析純或者化學(xué)純的國產(chǎn)試劑。

1.2 主要設(shè)備材料

GF254硅膠板(青島海洋化工分廠)、UV-100型手提紫外燈(北京愛著華美科技有限公司)、E2695型高效液相色譜儀(Waters公司)、SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)、HVA-110型全自動(dòng)滅菌鍋(株式會(huì)社平山制作所)、MF3全自動(dòng)菌落分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司)等。

1.3 菌種和載體

1.3.1 樣品來源

在廣西高峰林場界牌分廠八角樹樹下，以及廣西大學(xué)桂樹、玉蘭樹、棕櫚樹等樹下采集土樣，并采集八角落果、鮮果、樹皮、腐葉等，共47個(gè)樣品。每份樣品10～15 g，裝入樣品袋貼上標(biāo)簽并記錄采樣時(shí)間和地點(diǎn)，存于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱待用。

1.3.2 菌種載體

野生菌WGBP9(本實(shí)驗(yàn))，E.coliDH5α(購于TransGen Biotech)，pMDTM18-T(Ampr，購于Takara Bio)。

1.4 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基由蒸餾水配置，不含糖類的培養(yǎng)基采用121 ℃蒸汽滅菌20 min，含糖類的培養(yǎng)基采用115 ℃蒸汽滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加1.2～1.3 g/L瓊脂粉。

1.4.1 類M9培養(yǎng)基[21](下文簡稱為LM9)

Na2HPO4·12H2O 17.14 g/L、KH2PO43 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、CaCl20.02 g/L。

1.4.2 梯度篩選培養(yǎng)基

一級(jí)：LM9培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為0.2%反式茴香腦+5 g/L葡萄糖；二級(jí)：LM9培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為0.5%反式茴香腦+2 g/L葡萄糖；三級(jí)：LM9培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為0.7%反式茴香腦；四級(jí)：LM9培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為1%反式茴香腦。

1.4.3 初篩和復(fù)篩培養(yǎng)基

LM9培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為0.5%反式茴香腦。

1.4.4 種子培養(yǎng)基

葡萄糖15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物2.5 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、CaCl20.02 g/L。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 富集和分離

每份樣品稱取5 g，分別加入已滅菌的LM9培養(yǎng)基中，放入30 ℃搖床200 r/min震蕩培養(yǎng)0.5 h。將菌液稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7倍菌懸液，于一級(jí)梯度培養(yǎng)基平板涂布，以相同條件培養(yǎng)36～60 h。挑取形態(tài)不同的單菌落，經(jīng)過二、三級(jí)梯度培養(yǎng)基平板中劃線，利用三級(jí)梯度培養(yǎng)基進(jìn)行反復(fù)劃線分離，直到出現(xiàn)穩(wěn)定單菌落。將菌株接種于四級(jí)梯度培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用種子培養(yǎng)基平板保存長勢(shì)較好的菌株于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 薄層層析法初篩

用接種針挑取單菌落接種于初篩培養(yǎng)基中，放入30 ℃搖床，200 r/min培養(yǎng)36～48 h。充分震蕩菌液取一定體積菌液加入等體積的乙酸乙酯，放于200 r/min搖床混合40 min，1 000 r/min離心10 min，取上層有機(jī)相備用(下文簡稱為萃取液)。展層[22]：將10 μL萃取液點(diǎn)樣于活化后的GF254硅膠板上，展層液中展層20 min，利用手提紫外燈檢測(cè)，紀(jì)錄茴香酸斑點(diǎn)較大或反式茴香腦斑點(diǎn)較小的菌株，選出菌種保存于-80 ℃。

2.3 反相高效液相色譜法(RP-HPLC)復(fù)篩

2.3.1 確定測(cè)試條件

反式茴香腦、產(chǎn)物茴香酸和茴香醛都具有特征苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外光波段有特定吸收峰，可選擇有紫外波長范圍的PDA檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。以紫外分光光度儀在190～400 nm對(duì)3種物質(zhì)進(jìn)行掃描，確定3種物質(zhì)及混合時(shí)的特征吸收波長。利用Grace Smart RPC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)確定液相色譜的條件。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過精確度檢測(cè)和加標(biāo)回收率試驗(yàn)來確定色譜條件的可行性。

2.3.2 轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算

茴香酸摩爾生成率(%)=轉(zhuǎn)化液中生成的茴香酸的摩爾量/加入的反式茴香腦摩爾量×100%。

降解反式茴香腦產(chǎn)茴香酸效率(%)=生成的茴香酸摩爾量/(初始反式茴香腦摩爾量-殘余反式茴香腦摩爾量)×100%。

2.4 菌株對(duì)反式茴香腦耐受性

將培養(yǎng)12～16 h的菌液按1%接種量接種于LM9和種子培養(yǎng)基中，再分別加入不同濃度的反式茴香腦，于30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。將收集到的菌體真空干燥，分別測(cè)出相應(yīng)的生物量，分析菌株對(duì)反式茴香腦的耐受情況。

2.5 菌株的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)特征觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

通過掃描電子顯微鏡、平板菌落形態(tài)觀察等方式進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察，參照常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[23]和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[24]進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)研究。

2.5.2 Biolog鑒定

挑取新鮮菌種在BUG瓊脂糖培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)2～3次后，取平板中菌落制備濁度為90%～98%的菌懸液，接種于GEN III微孔板中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，利用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀讀取數(shù)據(jù)，根據(jù)菌株對(duì)95種碳源利用的情況與數(shù)據(jù)庫中菌種比對(duì)得出菌株的ID。

2.5.3 16S rRNA基因序列分析

提取目的菌株基因組總DNA，利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，將目的菌株送到華大基因和上海生工測(cè)序。利用Chromas、Vsector NTI、MAGE 5.0等軟件對(duì)序列進(jìn)行加工、序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹。

3 結(jié)果和討論

3.1 高效液相色譜條件確定

圖1 部分產(chǎn)茴香酸菌株轉(zhuǎn)化液薄層層析圖譜Fig.1 TLC result of strains of someproducing anisic acid

優(yōu)化后得到的色譜條件為：混合標(biāo)準(zhǔn)樣的檢測(cè)波長為259 nm，流動(dòng)相乙腈∶水=70∶30，流速為0.8 mL/min，加樣量5 μL，等度洗脫，6.5 min內(nèi)可以將混合樣品很好分離。進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)樣品和菌株轉(zhuǎn)化液中的反式茴香腦和茴香酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于0.97%，符合檢測(cè)要求。

3.2 菌株的篩選

3.2.1 富集、純化和初篩

經(jīng)過富集和分離純化從樣品中分離出348株以反式茴香腦為唯一碳源的菌株。其中在含有體積分?jǐn)?shù)為1%反式茴香腦的培養(yǎng)基中長勢(shì)較好菌株有94株。將純化后的菌株進(jìn)行初篩，通過樣品斑點(diǎn)的大小和顏色深淺與標(biāo)準(zhǔn)樣比對(duì)，獲得21株降解反式茴香腦且積累茴香酸的菌株，部分菌株轉(zhuǎn)化液薄層層析結(jié)果見圖1。

3.2.2 復(fù)篩

利用高效液相色譜法對(duì)產(chǎn)物定量，從而將初篩得到的21株菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果有6株的茴香酸摩爾生成率較高，分別為WGAT73、WGBT39、WGBP9、WGBL34、WGYT2和WGZG4。轉(zhuǎn)化液經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)該條件下菌株WGBP9的茴香酸積累最多，為17.9%，降解的反式茴香腦生成茴香酸的效率為21.98%，對(duì)反式茴香腦的降解率達(dá)到84.6%，具有較大的轉(zhuǎn)化潛力。

表1 高效液相色譜法篩選檢測(cè)結(jié)果

3.3 菌株對(duì)反式茴香腦的耐受性(說明利用種子培養(yǎng)基做耐受性的原因)

由于在篩選過程中利用了單一碳源為茴香腦的培養(yǎng)基及含葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并且在后期發(fā)酵過程中多利用的是含葡萄糖的培養(yǎng)基，因此將菌株WGBP9分別接種于添加了不同濃度的反式茴香腦的LM9培養(yǎng)基(無碳源)和種子培養(yǎng)基(含15 g/L葡萄糖)中培養(yǎng)，以便了解菌株對(duì)茴香腦的耐受性，可以為后期發(fā)酵條件優(yōu)化提供參考。培養(yǎng)24 h后，耐受情況分別如圖2和圖3所示。

圖2 菌株WGBP9在LM9培養(yǎng)基中對(duì)反式茴香腦耐受情況Fig.2 trans-Anethole tolerance of strain WGBP9 in LM9 medium

結(jié)果顯示，不論在LM9培養(yǎng)基還是種子培養(yǎng)基中，菌株WGBP9的生物量都隨著反式茴香腦濃度的增加不斷減少，說明反式茴香腦對(duì)WGBP9生長有一定抑制作用。LM9培養(yǎng)基中沒有碳源，因此以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的反式茴香腦添加量作為對(duì)照，在含體積分?jǐn)?shù)為2.2%反式茴香腦的LM9培養(yǎng)基中生物量為對(duì)照的28.8%。而在種子培養(yǎng)基中，以不添加反式茴香腦的培養(yǎng)基作對(duì)照，在含體積分?jǐn)?shù)為10%反式茴香腦的種子培養(yǎng)基中生物量為對(duì)照的37.42%，試著利用含體積分?jǐn)?shù)為20%反式茴香腦的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)生物量為對(duì)照的26.57%。這說明WGBP9對(duì)反式茴香腦的毒性具有很高的耐受能力。

圖3 菌株WGBP9在種子培養(yǎng)基中對(duì)反式茴香腦耐受情況Fig.3 trans-Anethole tolerance of strain WGBP9 in seed medium

3.4 菌株的鑒定

3.4.1 形態(tài)觀察

挑取菌落在種子培養(yǎng)基平板中劃線培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)見圖4。WGBP9菌落直徑為1.8～2.6 mm，乳白色略顯黃色，圓形半透明，透鏡狀凸起，表面光滑平整邊緣整齊，濕潤粘稠，質(zhì)地均勻。菌株WGBP9的革蘭氏染色為紫紅色，為革蘭氏陰性菌。經(jīng)過電鏡掃描儀觀察，菌體長度為0.4～2 μm，長短不均勻，短桿狀，未見芽孢、鞭毛和莢膜。

3.4.2 生理生化鑒定

參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)CCLS的藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[25]，利用紙片法測(cè)定菌株的抗生素敏感試驗(yàn)，結(jié)果為菌株對(duì)氨芐青霉素、壯觀霉素、利福平、羧芐青霉素、氯霉素、萬古霉素、頭孢噻吩具有耐藥性，其中：對(duì)氨芐青霉素、羧芐青霉素、萬古霉素、頭孢噻吩為高耐藥性，對(duì)萘啶酮酸、慶大霉素、卡那霉素敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素為中介狀態(tài)。

菌株WGBP9的生理生化特征鑒定結(jié)果見表2。與常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)和伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中的菌株進(jìn)行比對(duì)檢索，發(fā)現(xiàn)WGBP9與假單胞菌屬細(xì)菌特性最接近。

3.4.3 16S rRNA基因鑒定

經(jīng)過華大基因和上海生工對(duì)菌株WGBP9的16S rRNA基因測(cè)序，序列與GenBank(NCBI網(wǎng)站)中有一定關(guān)聯(lián)性的菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹(MAGE5.0中的最大似然法(Maximum Likelihood))，結(jié)果見圖5。

序列比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹構(gòu)建顯示：菌株WGBP9與多個(gè)假單胞菌屬Pseudomonassp.細(xì)菌一致性都達(dá)到99%，其中親緣性非常接近的包括登錄號(hào)為NR113651的惡臭假單胞菌Pseuomonasputida、登錄號(hào)為NR024662的變性假單胞菌Pseudomonasplecoglossicida和登錄號(hào)為NR114224的蒙氏假單胞菌Pseuomonasmonteilii等假單胞菌屬的細(xì)菌，可以確定WGBP9為假單胞菌屬細(xì)菌。

3.4.4 BIOLOG鑒定

根據(jù)BIOLOG微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)鑒定結(jié)果的評(píng)估，培養(yǎng)4～6 h時(shí)，SIM≥0.75，DIS≤0.5；培養(yǎng)16～24 h時(shí)，SIM≥0.5，DIS≤0.5。鑒定系統(tǒng)所給出的菌株名稱即為該菌的種名，否則鑒定結(jié)果只能判定為該細(xì)菌的屬名，甚至鑒定系統(tǒng)不能給出匹配的菌種ID。菌株WGBP9培養(yǎng)16～24 h后，通過BIOLOG微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)檢測(cè)WGBP9并比對(duì)數(shù)據(jù)庫，顯示W(wǎng)GBP9與惡臭假單胞菌A類變種PseudomonasputidabiotypeA一致性最高，PROB=0.909，SIM=0.631，DIS=0.382，因此可確定WGBP9為惡臭假單胞菌PseudomonasputidabiotypeA。

表2 菌株WGBP9生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性，“+”表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性。

括號(hào)內(nèi)為對(duì)應(yīng)菌株16S rRNA基因序列的登錄號(hào)。圖5 菌株WGBP9的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of strains WGBP9

綜合BIOLOG鑒定的結(jié)果和菌株的形態(tài)觀察、生理生化鑒定及16S rRNA基因鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株WGBP9為PseudomonasputidabiotypeA中的一株亞種。

4 小結(jié)

隨著社會(huì)的進(jìn)步和人們生活水平的提高，人們對(duì)食品、日用化妝品中天然添加劑的需求越來越高，生物轉(zhuǎn)化法合成茴香酸的研究也逐漸成為熱點(diǎn)。反式茴香腦對(duì)微生物有一定的抑制性或毒性，因此利用微生物轉(zhuǎn)化反式茴香腦技術(shù)的關(guān)鍵在篩選耐受高濃度反式茴香腦及衍生物的菌株。

本研究從環(huán)境樣品中分離了348株能以反式茴香腦為唯一碳源的菌株。通過薄層層析法和反相高效液相法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物定量分析進(jìn)行復(fù)篩，最后得到一株對(duì)反式茴香腦耐受能力和茴香酸產(chǎn)量都較高菌株WGBP9。在含體積分?jǐn)?shù)為0.5%反式茴香腦的LM9培養(yǎng)基中，30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下培養(yǎng)WGBP9 36 h，茴香酸的摩爾生成率為17.9%。WGBF9在種子培養(yǎng)基中能耐受體積分?jǐn)?shù)為20%反式茴香腦，菌體生物量達(dá)到空白對(duì)照的26.57%，顯示該菌株有良好的應(yīng)用前景。

菌株WGBP9與培養(yǎng)條件優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化反式茴香腦生成茴香酸的菌株BT-13[20]和WGB30[2]相比，茴香酸摩爾生成率有一定差距，但初始條件下WGBP9有較高的茴香酸摩爾生成率(17.9%)，且耐受反式茴香腦的能力更高。因此可以通過發(fā)酵條件優(yōu)化等方法提高WGBP9的茴香酸生成量，或者通過基因改造獲取工程菌提高反式茴香腦轉(zhuǎn)化效率。

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(責(zé)任編輯 馬殷華)

Isolation and Identification of a Strain Capable of Transformingtrans-Anethole to Anisic Acid

WANG Xinyan1，2， SHEN Peihong1，2， HUA Yanfei1，2， LI Junfang1， ZHANG Min1， WU Bo2，3

(1.College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning Guangxi 530003， China; 2.State Key Laboratory=for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning Guangxi 530005， China; 3.College of Biology=and Food Engineering, Guangxi Normal University for Nationalities， Chongzuo Guangxi 532200， China)

After the gradient acclimation and enrichment screening， 348 strains were isolated from environmental samples usingtrans-anethole as the sole carbon source. Through quantitative detection oftrans-anethole and anisic acid with the methods of TLC and RP-HPLC， a strain named WGBF9 with the highest tolerance totrans-anethole and maximum yield of anisic acid was obtained. Biomass of strain WGBF9 was 37.42% of the blank control when the seed culture medium contained 10% (v/v)trans-anethole， and the biomass reached 26.57% in the medium with 20% (v/v)trans-anethole， showing that the strain had a high tolerance to thetrans-anethole. Anisic acid molar generation rate is 17.9%， when the strain was cultured in the screening secondary medium， with rotate speed of 200 r/min， after 36 h fermentation under 30 ℃. WGBF9 was identified as a subspecies ofPseudomonasputidabiotypeA based on the analysis of physiological and biochemical experiments.

Pseudomonasputida;trans-anethole; anisic acid

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.04.018

2016-04-19

2016年度廣西高等教育創(chuàng)優(yōu)計(jì)劃教學(xué)相關(guān)項(xiàng)目——優(yōu)勢(shì)特色專業(yè)項(xiàng)目(優(yōu)質(zhì)本科專業(yè))；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2010CB126502)

武波(1962—)，男，廣西武宣人，廣西民族師范學(xué)院教授。E-mail： wubogx@gxu.edu.cn

Q93

A

1001-6600(2016)03-0121-08