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        肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

        2016-02-14 06:33:20覃艷春黃干榮韋紅玉
        衛(wèi)生職業(yè)教育 2016年23期
        關(guān)鍵詞:孔法副傷寒微量

        覃艷春,曾 怡,黃干榮,韋紅玉,陸 鋼

        (1.右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000)

        肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

        覃艷春1,曾 怡1,黃干榮1,韋紅玉1,陸 鋼2*

        (1.右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000)

        目的 探討肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)方法,使學(xué)生操作起來更容易,減少試劑用量,縮短試驗(yàn)反應(yīng)時間。方法 用移液器加樣,微量孔代替試管,52℃水浴1 h。結(jié)果 微量孔法相對于試管法操作簡單快速,試劑用量少,反應(yīng)時間短。結(jié)論肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用的微量孔法可以代替試管法。

        肥達(dá)氏反應(yīng);實(shí)驗(yàn)方法;微量孔法

        肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的一個基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),是應(yīng)用血清學(xué)方法,根據(jù)已知的傷寒桿菌的“O”“H”抗原,甲型、乙型副傷寒的“H”抗原和病人感染傷寒或副傷寒后,約經(jīng)1~2周即可在血清中出現(xiàn)的抗體,在適當(dāng)電解質(zhì)參與下出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象,根據(jù)凝集現(xiàn)象判斷凝集效價,在臨床上用于輔助診斷傷寒及副傷寒病。

        針對肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)存在所用的傷寒診斷血清價格昂貴,傷寒血清制備費(fèi)時、費(fèi)力,反應(yīng)時間長(24 h)等缺點(diǎn),近年來有同行對此反應(yīng)進(jìn)行了改進(jìn),如丁金龍[1]的聚凝胺法,霍立新[2]的離心法加速了反應(yīng)時間等。雖然如此,但他們對肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)仍未解決上述全部問題,因此,我實(shí)驗(yàn)室對此實(shí)驗(yàn)再加以改進(jìn),用微量孔法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的試管法。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過幾年的實(shí)際運(yùn)用效果良好。改進(jìn)前后方法對比介紹如下。

        1改進(jìn)前的實(shí)驗(yàn)方法——試管法[3]

        1.1材料

        (1)傷寒待測血清[3]1∶20稀釋)。

        (2)試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原,來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

        1.2方法

        (1)取潔凈小試管24支,以4排6列擺放在試管架上,試管按順序編號并標(biāo)記抗原種類。

        (2)用5 ml吸管吸取生理鹽水,各管加入0.5 ml。

        (3)另取1 ml吸管吸取1∶20稀釋血清,分別加入每排的第1管內(nèi),每管0.5 ml,吸吹3次充分混合,將血清稀釋為1∶40。

        (4)依次類推血清對倍稀釋至各排第5管、從第5管中吸0.5 ml棄置消毒容器。此時第2、3、4、5管血清的濃度分別為1∶80,1∶160,1∶320,1∶640。

        (5)第6管不加血清,作為抗原對照管。

        (6)加入抗原:第1排各管加入傷寒血清“H”抗原3滴。第2排各管加入傷寒血清“O”抗原0.5 ml。第3排各管加入甲型副傷寒“A”抗原3滴。第4排各管加入乙型副傷寒“B”抗原0.5 ml。

        Y2 的模型回歸方程為:Y2=-228.229+43.9125x1+8.79167x2+3.32937x3-6.78333x12-0.389583x22-0.0132083x32+0.3125x1x2-0.0475x1x3-0.001875x2x3。

        (7)混勻,置于37℃電熱恒溫水浴箱18~24 h觀察結(jié)果。1.3結(jié)果

        (1)觀察對照管(第6管),管度有圓形沉淀物,搖動試管,液體均勻混濁。

        (2)從各排第1~5管順序觀察試驗(yàn)管,大部分細(xì)菌被凝集于管底,液體輕度混濁為++。

        (3)凝集效價的確定,以血清的最高稀釋度仍能出現(xiàn)明顯凝集(++)的,為被檢血清的凝集效價。

        2改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法——微量孔法

        2.1材料

        (1)傷寒待測血清[3]1∶20稀釋)。

        (2)試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原,來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

        (3)生理鹽水、U型微孔反應(yīng)板、50 μl移液器(來自上海求精生化試劑儀器有限公司)、吸頭、52℃電熱恒溫水浴箱(來自國營創(chuàng)新醫(yī)療器械廠,型號S648)。

        2.2方法

        (1)準(zhǔn)備4排微量U型小孔,每排6孔,標(biāo)明記號。

        (2)每孔加入生理鹽水50 μl。

        (3)每排第一孔加入待測血清50 μl,混勻,將血清稀釋為1∶40。

        (4)進(jìn)行對倍稀釋,即吸取第1孔50 μl血清放置第2孔,再從第2孔吸取血清50 μl放置第3孔,以此類推連續(xù)稀釋第5孔為止,從第5孔中吸50 μl棄置消毒容器。此時第2、3、4、5孔血清的濃度分別為1∶80,1∶160,1∶320,1∶640。

        (5)第6孔不加血清作陰性對照孔。(6)每排加入對應(yīng)的傷寒菌液50 μl。(7)混勻,置于52℃電熱恒溫水浴箱觀察結(jié)果。

        2.3結(jié)果

        (1)觀察對照孔,無凝集反應(yīng),再觀察各孔的凝集情況。

        (2)上清液澄清度大約50%,約50%細(xì)菌集成塊沉于孔底記++。

        (3)以呈現(xiàn)++凝集現(xiàn)象的血清的最高稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。

        3結(jié)論

        同一份傷寒血清標(biāo)本,改進(jìn)后的微量孔法跟傳統(tǒng)的試管法結(jié)果(效價)相同。試管法與微量孔法試劑用量和實(shí)驗(yàn)時間見表1。

        表1 兩種方法使用試劑與時間的比較

        4討論

        從上述實(shí)驗(yàn)操作過程和結(jié)論來看,改進(jìn)后的微量孔法相對傳統(tǒng)的試管法有操作更簡便、試劑用量少、實(shí)驗(yàn)時間短的特點(diǎn)。任何一門課程、學(xué)科的發(fā)展都會經(jīng)歷不斷探索、不斷完善的過程[4],任何實(shí)驗(yàn)技術(shù)也要精益求精,在此思想指引下我們對該實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是我校各專業(yè)本科學(xué)生醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一,每學(xué)年要做這個實(shí)驗(yàn)的學(xué)生達(dá)1 200人,在試劑用量上,按照兩個學(xué)生一組來計(jì)算,肥達(dá)氏反應(yīng)用微量孔法代替試管法可以節(jié)省270 000 μl傷寒血清試劑,“O”、“H”、甲型、乙型傷寒診斷血清各節(jié)省了1 350 000 μl,在節(jié)約教學(xué)經(jīng)費(fèi)的同時,也更加低碳環(huán)保。在操作上,微量孔法用的是移液器加樣相對試管法用吸管加樣對學(xué)生來說操作更簡單,也更準(zhǔn)確。在實(shí)驗(yàn)時間上,52℃水浴1 h比37℃水浴24 h看結(jié)果節(jié)省了23 h。綜上所述,肥達(dá)氏反應(yīng)微量孔法有諸多優(yōu)點(diǎn),可以替代試管法推廣使用。

        [1]丁金龍,屠文娟.聚凝胺法在肥達(dá)反應(yīng)中的應(yīng)用與評價[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2006,24(4):381.

        [2]霍立新.肥達(dá)反應(yīng)試驗(yàn)的快速法[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,4(5):431. [3]柳忠輝.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.

        [4]吳冰,馬煜峰,凌冠華,等.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課程內(nèi)容改革的探索[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育,2013,15(7):704-705.

        (*通訊作者:陸鋼)

        G424.31

        B

        1671-1246(2016)23-0110-02

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