趙黎黎，包秋華，趙國芬

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

細菌VBNC態(tài)檢測技術(shù)的研究進展

趙黎黎1，包秋華2*，趙國芬1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

細菌在一些不良壓力條件下會進入“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(viable but non-culturable，VBNC)，其仍具有活力但不能采用常規(guī)的平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，VBNC態(tài)細菌一旦培養(yǎng)條件適宜仍能繼續(xù)生長繁殖，有些致病菌依舊具有毒力。如果檢測方法不當，會造成假陽性或假陰性的結(jié)果，需要采取適合的檢測方法進行檢測。文章概述了幾種檢測VBNC態(tài)細菌的方法，如活菌直接計數(shù)法、核酸染料檢測法、呼吸檢測法、分子生物學法、免疫學法、流式細胞儀檢測法等，并對檢測方法的應用現(xiàn)狀進行了評述。

細菌;活的非可培養(yǎng)態(tài)VBNC;檢測方法

徐懷恕等［1］在研究霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)和大腸埃希菌(Escherichia coli)的存活規(guī)律時首次發(fā)現(xiàn)了細菌的一種特殊存活形式——活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable state，VBNC)。VBNC態(tài)不是細菌在瀕臨死亡時的狀態(tài)，而是為了適應環(huán)境變化而表現(xiàn)出來的生存策略［2］。細菌VBNC態(tài)指細菌在不良的環(huán)境條件下，用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法使菌落生長繁殖，但細菌仍具有生物活性，VBNC態(tài)細菌一旦處于適宜培養(yǎng)條件，仍能繼續(xù)生長繁殖，有些致病菌依舊具有毒力。如果檢測方法不當，會造成假陽性或假陰性的結(jié)果。目前已有34個屬的68種細菌被報道能進入VBNC態(tài)［3］，這對微生物學、水質(zhì)量檢測、流行病學研究及食品安全方面都具有重要意義。因此，尋找適合有效的檢測VBNC態(tài)細菌的方法勢在必行。本文著重介紹了一些VBNC態(tài)細菌的檢測方法，如活菌直接計數(shù)法、核酸染料檢測法、呼吸檢測法、分子生物學法、免疫學法、流式細胞儀檢測等方法和應用現(xiàn)狀，為今后VBNC態(tài)細菌的檢測提供參考。

1 活菌直接計數(shù)法(direct viable counting，DVC)

活菌直接計數(shù)法首次被Kogure等［4］使用，該方法是在細菌培養(yǎng)物中加入營養(yǎng)物質(zhì)和萘啶酮酸(DNA合成抑制劑，使細菌只生長不分裂［5］)，混合培養(yǎng)6～24 h后用福爾馬林固定，吖啶橙染色，用熒光顯微鏡觀察細菌形態(tài)變化，從而測定VBNC態(tài)的細菌數(shù)。后來，人們用環(huán)丙沙星(DNA合成抑制劑)等物質(zhì)來代替萘啶酮酸，并將酵母膏換成10%的大豆蛋白胨起到良好效果。姚斐等［6］運用不同濃度的環(huán)丙沙星分別對北京棒狀桿菌、枯草芽胞桿菌、霍亂弧菌和大腸埃希菌O157H7進行處理，發(fā)現(xiàn)用萘啶銅酸DVC計數(shù)和環(huán)丙沙星DVC計數(shù)結(jié)果相似，均高于平板菌落計數(shù)。Besnard等［7］采用環(huán)丙沙星來代替萘啶酮酸，有效區(qū)分了李氏桿菌的死活菌，并且檢測出VBNC態(tài)下的李氏桿菌。Mishra等［8］也利用環(huán)丙沙星代替萘啶酮酸，用改進的免疫熒光法結(jié)合直接計數(shù)法(fluorescent antibody-direct viable count，DFA-DVC)檢測了霍亂弧菌的VBNC態(tài)。

2 核酸染料檢測法

目前核酸染料檢測法包括吖啶橙直接計數(shù)法(acridine orange direct count，AODC)、4，6-二脒基-二苯基吲哚染色法(4，6-diamino-2 phenylindole，DAPI)和5-氰基-2，3-二甲苯氯化四氮唑(5-cyano-2，3-ditolyltetrazoliumchloride，CTC)等?；罴毦?jīng)過染色后呈現(xiàn)橙黃色熒光，當細菌處于穩(wěn)定期、饑餓狀態(tài)或VBNC態(tài)時呈現(xiàn)綠色熒光。Baffone等［9］對溶藻弧菌、副溶血性弧菌的VBNC態(tài)進行了檢測，統(tǒng)計了總菌數(shù)和活菌數(shù)。Cappelier等［10］利用DVC法和CTC-DAPI雙染色的方法相結(jié)合，檢測了VBNC態(tài)的4種單核細胞增生李斯特氏菌。Baffone等［11］也利用CTC-DAPI法檢測了VBNC態(tài)的空腸彎曲菌。

研究中通常使用吖啶橙染色、活菌直接計數(shù)和平板計數(shù)三者結(jié)合來確定細菌是否進入VBNC態(tài)。用吖啶橙染色法可得出總菌數(shù)或活菌數(shù)［12］，用活菌直接計數(shù)法可檢出具有代謝活性的活菌數(shù)，用平板計數(shù)法可得出可培養(yǎng)的活菌數(shù)。因而，當平板計數(shù)為零時，可以加大接種量，繼續(xù)培養(yǎng)連續(xù)測定3 d，若可培養(yǎng)數(shù)仍為零則說明細菌進入VBNC態(tài)。

一種方便快速的死/活細菌檢測試劑盒(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits)被廣泛應用于VBNC態(tài)的檢測，是基于細胞完整性來檢測死活菌的數(shù)量。包括2種核酸染料，SYTO-9和PI(propidium iodide，碘化丙啶)。SYTO-9能穿透完整的細胞膜滲入胞內(nèi)，染色核酸使之呈現(xiàn)綠色熒光;PI只能滲到細胞膜破損的菌體內(nèi)，染色核酸呈現(xiàn)紅色熒光。因此可以區(qū)分死活菌。Adams等［13］利用平板計數(shù)和死活菌試劑盒檢測了水樣中幽門螺桿菌的可培養(yǎng)性和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌失去了可培養(yǎng)性，但依舊具有活力，因此斷定其進入VBNC態(tài)。Li等［14］利用選擇平板計數(shù)聯(lián)合死活菌檢測試劑盒檢測在寒冷和二氧化碳的誘導下，單核細胞增生李斯特氏菌能否進入VBNC態(tài)。PI還常用于細胞凋亡或細胞壞死的檢測［15］。

3 呼吸檢測

呼吸檢測就是在培養(yǎng)物中加入電子受體CTC和對碘硝基四唑紫(p-iodonitrotetrazolium violet，INT)等物質(zhì)，這些物質(zhì)在細菌新陳代謝過程中參與反應。由于氧化態(tài)的CTC和INT等物質(zhì)為無色，而經(jīng)過氧化還原反應被還原為紫色和紅色的物質(zhì)，因而便于檢測。只要細菌有活躍的電子傳遞鏈即可發(fā)生此反應。且隨著VBNC態(tài)細菌的產(chǎn)生，細菌會發(fā)生變化，INT沉淀不易被觀察出來，會造成檢測錯誤。Oliver等［16］用DVC法和電子傳遞能力監(jiān)測創(chuàng)傷弧菌的可培養(yǎng)性和活力，發(fā)現(xiàn)細菌進入VBNC態(tài)，從而得到明顯的觀察效果。Rahman等［17］利用INT-DVC法成功檢測出了1型痢疾志賀氏菌的VBNC態(tài)。

4 分子生物學方法

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR)、疊氮溴化丙錠聯(lián)合實時熒光定量PCR法(PMA-qPCR法)、核酸探針、熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片等生物學技術(shù)被用于VBNC態(tài)的檢測。

當細菌處于VBNC態(tài)時仍有一些基因被表達，而mRNA與細菌的活性直接相關(guān)，一些研究者應用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RTPCR)技術(shù)對VBNC態(tài)細菌進行檢測。李影等［18］通過mRNA差異顯示技術(shù)得到了僅在VBNC態(tài)時高量表達的沙門氏菌的特異性基因，依據(jù)這2個基因設計引物，再運用RT-PCR技術(shù)檢測了沙門氏菌的VBNC態(tài)。Lahtinen等［19］運用RT-PCR技術(shù)聯(lián)合流式細胞儀檢測雙歧桿菌的VBNC態(tài)。Eiler等［20］將弧菌特異的16S rRNA引物運用到qPCR中，再用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)對弧菌的VBNC態(tài)進行計數(shù)。Machado等［21］也用相同的方法檢測了霍亂弧菌的VBNC態(tài)，這對水中霍亂弧菌的檢測提供了新思路。近年來疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)被用于細菌死活細胞的PCR選擇性擴增中。PMA染料是一種DNA分子核酸染料，其滲入受損細胞膜與DNA結(jié)合，而無法結(jié)合完整細胞膜內(nèi)的DNA。一般使用PMA處理提取樣品的基因，使樣品中死細胞的DNA分子與PMA發(fā)生共價交聯(lián)，使其DNA分子的PCR擴增被抑制從而達到區(qū)分死、活菌檢測的目的。在活性乳酸菌的研究中，Cayuela等［22］用DVC法和PMA-qPCR法對4℃保存的發(fā)酵乳制品中的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌進行活性檢測，發(fā)現(xiàn)兩者檢測結(jié)果無統(tǒng)計學顯著差異，這為乳酸菌VBNC態(tài)的研究奠定了基礎。在Villarreal等的研究中，發(fā)現(xiàn)平板計數(shù)法區(qū)分相似細菌時的特異性差，而PMA-qPCR法卻有很強的特異性［23］。因而從平板計數(shù)法和PMA-qPCR法的計數(shù)結(jié)果得知，傳統(tǒng)平板計數(shù)法計數(shù)結(jié)果偏高［24］，而對VBNC態(tài)細菌計數(shù)結(jié)果卻偏低。但對于PMA-qPCR法檢測細菌的結(jié)果準確性都很高，且用時也短。Dinu等［25］對生菜和菠菜表面的大腸埃希菌在低溫下進行VBNC態(tài)誘導，用PMA-qPCR技術(shù)和免疫學方法結(jié)合來確定細菌的VBNC態(tài)數(shù)量。Karina等［26］采用PMA-qPCR技術(shù)檢測出VBNC態(tài)的糞腸球菌，因而用此方法來評估表層水的質(zhì)量。

核酸探針指帶有標記的已知序列的核酸片段可與其互補的核酸序列雜交，從而檢出樣品中特定基因順序。Coutard等［27］采用核酸探針和RTPCR相結(jié)合的方法對進入VBNC態(tài)的副溶血性弧菌Vp5菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)4種群特異基因和2種毒力基因。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH技術(shù))的原理是利用核酸分子單鏈間存在可以互補的堿基序列，將外源核酸與待測DNA或RNA進行互補而形成雜交分子，檢測后使待測DNA或RNA顯現(xiàn)出來。Juhna等［28］使熒光原位雜交技術(shù)和DVC、DAPI法相結(jié)合成功地檢測了大腸埃希菌的VBNC態(tài)。Moreno等［29］利用FISH技術(shù)和DVC法結(jié)合來檢測普通水中的VBNC態(tài)幽門螺桿菌。近年來，隨著基因芯片技術(shù)飛速發(fā)展，基因芯片也被用于VBNC態(tài)細胞快速檢測中。Liu等［30］用一種改良的基因芯片法與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，并利用探針技術(shù)檢測到經(jīng)RT-PCR后排布在芯片上處于VBNC態(tài)的大腸埃希菌基因，從而發(fā)現(xiàn)這種方法靈敏度高，假陽性概率小。Vora等［31］用PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)快速、準確地檢測了VBNC態(tài)的弧菌。

5 免疫學方法

免疫學方法是基于抗原抗體特異性進行檢測的。具有完整細胞壁結(jié)構(gòu)的細菌才可進行免疫反應。徐懷恕等［32］用電鏡觀察VBNC態(tài)V.cholerae細胞，發(fā)現(xiàn)進入VBNC態(tài)的細菌保持和正常細菌一樣的表面抗原。因此這是利用免疫技術(shù)對VBNC態(tài)細菌進行檢測的依據(jù)。熒光抗體染色法和間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)被廣泛使用。熒光抗體染色法可檢出總菌數(shù)和活菌數(shù)，ELISA法可檢出VBNC態(tài)的菌數(shù)以及總菌數(shù)。姚斐等［33］利用間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測出了VBNC態(tài)的大腸埃希菌O157H7。姚斐等［34］還利用活菌間接免疫熒光抗體技術(shù)(direct viable counting-indirect fluorescent antibody technique，DVC-IFAT)來檢測VBNC態(tài)的副溶血弧菌，得到良好的效果。僅使用間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測時，VBNC態(tài)的死活菌都能被檢出，而使用DVC-IFAT法時，檢測出沒有變化的是死菌。因而DVC-IFAT法更優(yōu)于間接免疫熒光抗體技術(shù)。Liu等［35］建立了一種免疫瓷珠捕獲PCR技術(shù)(immunomagnetic capture-fluorescent PCR，IMC-FPCR)，快速敏銳地檢測出了空腸彎曲菌的VBNC態(tài)。

6 流式細胞儀檢測法(flow cytometry，F(xiàn)CM)

流式細胞儀是一種采用激光束激發(fā)單行流動的細胞，對它攜帶的熒光進行探測，從而完成細胞分析和分選的技術(shù)。運用流式細胞儀可識別進入VBNC態(tài)細胞的形態(tài)變化，當其與熒光染料結(jié)合使用可檢出死活菌數(shù)量、兩者的比例關(guān)系及死活菌總數(shù)。Khan等［36］先用熒光染料SYTO 9、SYTO 13、SYTO 17、SYTO 40和PI分別對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、沙門氏菌進行染色，再用流式細胞儀對活的和VBNC態(tài)的細菌進行計數(shù)。Berney等［37］將FCM和死活菌檢測試劑盒聯(lián)用，檢測了福氏志賀菌等細菌。Wang等［38］利用流式細胞儀和熒光染色相結(jié)合的方法來檢測氯水消毒的效果并查看了大腸埃希菌和軍團菌VBNC態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。劉靜宇等［39］利用流式細胞儀對陳化海水中4℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌計數(shù)，發(fā)現(xiàn)在第69天時細菌都不生長，但細菌總數(shù)不變，說明其進入VBNC態(tài)。同時他們利用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR對VBNC態(tài)副溶血性弧菌的管家基因pvuA、鑒定基因toxR和毒力基因tdh2進行檢測和毒力研究，發(fā)現(xiàn)此方法特異性強、靈敏、檢測速度快，客觀地評價了VBNC態(tài)細菌的潛在危害。鄧陽等［40］在耐酸乳桿菌VBNC態(tài)誘導復蘇實驗中發(fā)現(xiàn)AODC法計數(shù)的總菌數(shù)保持穩(wěn)定，死活菌染色試劑盒和流式細胞儀計數(shù)結(jié)果相似，活菌數(shù)降低1～2個數(shù)量級，表明其逐漸進入VBNC態(tài)。綜上研究VBNC態(tài)細菌中采用的檢測方法匯總見表1。

表1 研究VBNC態(tài)細菌中采用的檢測方法匯總Table 1The Test methods of the VBNC state of Bacteria

續(xù)表1

7 展望

通過對VBNC態(tài)細菌檢測方法的概述，發(fā)現(xiàn)研究者往往用一種方法無法完全確定細菌是否處于VBNC態(tài)，因而常常聯(lián)合使用多種方法來確定細菌的狀態(tài)，因為不同細菌的VBNC態(tài)也不盡相同，用一個統(tǒng)一的方法來檢測VBNC態(tài)細菌幾乎是不可行的。在眾多檢測方法中，死活菌檢測試劑盒和分子生物學法檢測VBNC態(tài)細菌已成為主要趨勢，人們應加大這方面的研究力度。死活菌試劑盒操作簡便，死活細菌可簡單地通過顏色來區(qū)分，且染料不會影響細菌的形態(tài)變化。對于分子生物學檢測方法而言，應該加大力度找出VBNC基因，而不僅僅比較細菌VBNC態(tài)和正常狀態(tài)時基因的差異，只有這樣，分子生物學法才能真正應用到VBNC態(tài)細菌的檢測中。

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Advances in Test Techniques of Viable But Non-Culturable State of Bacteria

ZHAO Li-li1，BAO Qiu-hua2，ZHAO Guo-fen1
(1.Coll.of Life Sci.，2.Key Lab.of Dairy Biotech.＆Engin.Minist.of Educ.Inner Mongolia Agric.Uni.，Huhhot 010018)

Under harmful stress conditions，many species of bacteria will enter into starvation mode of a viable but non-culturable(VBNC)state.When the bacteria went into VBNC state，they cannot grow using conventional culture media，although they continue to retain their viability and express their virulence.Hence，for checking the level of microbial contamination，it is very important to use appropriate techniques for the detection of VBNC bacteria and establishing their viability.Various detection methods of VBNC bacteria were summarized in this article.For instance，direct viable counting，nucleic acid dyes detection method，respiration detection method，molecular biological method，immunological method，flow cytometry method，and appraised these methods and their application status through comments.

bacteria;viable but non-culturable(VBNC);test and determination methods

Q935

A

1005－7021(2016)04－0096－06

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.017

國家自然科學基金青年科學基金項目(31301516);內(nèi)蒙古博士科研啟動基金項目(BJ2013D-18)

趙黎黎女，碩士研究生。主要從事微生物方面的研究。E-mail:1819095448@qq.com

*通訊作者。女，博士，助理研究員。研究方向為乳品微生物。E-mail:nmgbqh@126.com

2015-09-02;

2015-12-01