曾艷，孫陽，藍(lán)燕，崔越，董歷子，楊紅育

(長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春130062)

動態(tài)濁度法檢測凍干甲型肝炎減毒活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量的研究

曾艷，孫陽，藍(lán)燕，崔越，董歷子，楊紅育*

(長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春130062)

探討動態(tài)濁度法檢測凍干甲型肝炎減毒活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量的可行性。參照《中國藥典》2015年版通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法中動態(tài)濁度法，對甲肝疫苗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗、干擾初篩試驗、干擾驗證試驗及內(nèi)毒素含量的測定，同時與經(jīng)凝膠法檢定合格的同批疫苗進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗結(jié)果符合規(guī)定。干擾初篩試驗疫苗稀釋160、320及640倍，回收率在50%～200%之間，均無干擾，符合要求。干擾驗證試驗結(jié)果進(jìn)一步表明:疫苗稀釋160倍對試驗無干擾作用。采用動態(tài)濁度法檢測的10批甲肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于該疫苗的限值L=20 EU/mL，且與經(jīng)凝膠法檢定的同批疫苗結(jié)果一致。采用動態(tài)濁度法檢測甲肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量是可行的，值得推廣應(yīng)用。

動態(tài)濁度法;細(xì)菌內(nèi)毒素;凍干甲型肝炎減毒活疫苗

生物制品、藥品檢查熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素(內(nèi)毒素是熱原的一種，在GMP條件下控制內(nèi)毒素污染就是控制熱原污染)是保證制品質(zhì)量，使用安全的重要的檢驗項目之一。家兔熱原檢查法(Rabbitpyrogen test，RPT)是世界許多國家藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法［1-3］，曾對保證制品質(zhì)量、使用安全發(fā)揮了重要作用，但是，家兔熱原檢查法不能定量反應(yīng)熱原的含量，不易標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果重復(fù)性較差，不適于放射性藥物、腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物制劑，且受動物來源品種健康狀況、個體差異等影響較大［4-5］。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(bacterial endotoxins test，BET)因其簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，現(xiàn)已逐步代替?zhèn)鹘y(tǒng)的RPT檢查熱原［6-8］。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，后者包括動態(tài)濁度法。動態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測濁度增加速度的方法?，F(xiàn)已被廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)、藥品檢驗、臨床檢查、環(huán)境保護(hù)、食品工業(yè)甚至電子工業(yè)等的致熱物質(zhì)的檢查［9-10］，但在生物制品方面的應(yīng)用報道較少。為了探討動態(tài)濁度法檢測凍干甲型肝炎減毒活疫苗(簡稱甲肝疫苗)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的可行性，本研究采用動態(tài)濁度法對甲肝疫苗進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測，并與經(jīng)凝膠法檢定合格的同批疫苗進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甲肝疫苗長春生物制品研究所有限責(zé)任公司產(chǎn)品，均經(jīng)凝膠法檢定合格的成品。批號20140307、20140408、20140409、20140412、20140413、20140515、20140517、20140518、20140519、20140621、20140622、20140723、20140724、20140725、20140726、20140727。

1.1.2 試劑①動態(tài)濁度法鱟試劑:湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品，批號1106162，規(guī)格10～0.03 EU/mL;②細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(簡稱BET用水):湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品，批號1107230，內(nèi)毒素含量＜0.003 EU/mL;③細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品:中國食品藥品檢定研究院，批號150601-201072，規(guī)格120 EU/支。

1.1.3 儀器及設(shè)備ATi321-06型動態(tài)試管檢測儀，英國萊伯金耐特有限公司產(chǎn)品;試驗中所有接觸被檢品的用具均經(jīng)除熱原處理。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗①方法:取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，用BET水稀釋，使其最終濃度為2.00、0.25、0.031 25 EU/mL的稀釋系列溶液，各取0.1 mL，分別置于預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插到動態(tài)試管檢測儀上進(jìn)行檢測。同時以BET水做陰性對照，每個濃度平行做兩管，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動顯示出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、實測值。②結(jié)果判斷:《中國藥典》［3］要求，陰性對照的反應(yīng)時間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點的反應(yīng)時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值應(yīng)大于或等于0.980，廠家建議變異系數(shù)CV%小于10%，試驗方為有效。

1.2.2 干擾初篩試驗①甲肝疫苗限值的確定:按照長春生物制品研究所有限責(zé)任公司《凍干甲型肝炎減毒活疫苗檢定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》SOP 05-6-0-001的規(guī)定，甲型肝炎減毒活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=20 EU/mL。②甲肝疫苗最大有效稀釋倍數(shù)的確定:最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)(MVD)，按以下公式計算:MVD=CL/λ。式中C:供試品甲肝疫苗的濃度，當(dāng)L以EU/mL表示時，C等于1.0 mL/mL;L:甲肝疫苗的限值，L=20 EU/mL;λ:動態(tài)濁度法中標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點濃度(0.031 25 EU/ mL)，MVD=(20 EU/mL×1.0 mL/mL)/0.031 25 =640倍。③干擾初篩試驗方法:取甲肝疫苗3批(20140307、20140408、20140409)，用BET水分別稀釋至160、320、640倍作為樣品液，同時以同樣倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加了近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.25 EU/mL作為樣品回收液，以BET水配制的濃度為0.031 25、0.25及2.00 EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線液，另外以BET水作為陰性對照，分別取上述各液(每個濃度平行做兩管)0.1 mL，分別置于預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管中，混合均勻，插入到動態(tài)試管檢測儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)結(jié)束后儀器自動顯示回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、達(dá)限平均反應(yīng)時間、變異系數(shù)、實測值。④結(jié)果判斷:《中國藥典》［3］要求，除符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求外，回收率應(yīng)在50%～200%的范圍內(nèi)。在此試驗條件下，供試品溶液對試驗無干擾作用。

1.2.3 干擾驗證試驗干擾驗證試驗與干擾初篩試驗的方法、反應(yīng)項目及判斷標(biāo)準(zhǔn)相同，不同點在于干擾初篩試驗對幾個濃度進(jìn)行篩選，而干擾試驗只做一個濃度確認(rèn)。根據(jù)干擾初篩結(jié)果，本文確定甲肝疫苗干擾驗證試驗濃度為160倍。另取甲肝疫苗3批(20140412、20140413、20140415)，分別用BET水稀釋至160倍，按干擾初篩試驗方法進(jìn)行干擾驗證檢測和判斷。

1.2.4 動態(tài)濁度法定量檢測與凝膠法檢測結(jié)果對比選取10批(詳見表5)甲肝疫苗，分別用BET水稀釋160倍，按動態(tài)濁度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測。同時與經(jīng)凝膠法檢定合格的同批疫苗進(jìn)行比較。結(jié)果判斷:若疫苗實測濃度(以EU/mL表示)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(2.0～0.031 25 EU/ mL)范圍內(nèi)，則以實測值乘以稀釋倍數(shù)判定結(jié)果;若疫苗實測值濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以外，則以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點濃度(如0.031 25 EU/mL)乘以稀釋倍數(shù)判定結(jié)果。若檢測出的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于該疫苗的限制(L=20 EU/mL)判為合格，否則判為不合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗結(jié)果

用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成0.031 25、0.25、2.00 EU/mL，進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1、2。

由表1可見，陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素的最低點反應(yīng)時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值大于0.980，變異系數(shù)(CV%)小于10%，試驗有效。標(biāo)準(zhǔn)曲線符合《中國藥典》［3］規(guī)定，成立。由表2可見，陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素的最低點反應(yīng)時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)絕對值大于0.980，變異系數(shù)(CV%)小于10%，試驗有效。標(biāo)準(zhǔn)曲線符合《中國藥典》［3］規(guī)定，成立。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗結(jié)果Table 1Reliability test results of standard curve

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗結(jié)果Table 2Reliability test results of standard curve

2.2 干擾初篩試驗

取甲肝疫苗3批，用BET水分別稀釋至160、320及640倍。按上述干擾初篩試驗方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。

表3 樣品干擾初篩試驗結(jié)果Table 3Results of interference initial screening test

續(xù)表3

由表3可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合《中國藥典》［3］規(guī)定，試驗有效。3批樣品的回收率在73.88%～139.48%之間，在50%～200%之間，符合藥典的要求。結(jié)果表明甲肝疫苗在稀釋160、320及640倍的條件下均無干擾作用。因為凝膠法檢定細(xì)菌內(nèi)毒素采用160倍稀釋，所以本研究也選擇160倍稀釋液作為干擾驗證試驗濃度。

2.3 干擾驗證試驗

取3批甲肝疫苗，分別用BET水稀釋160倍，按干擾篩選試驗方法進(jìn)行檢測。結(jié)果見表4。

表4 樣品干擾驗證試驗結(jié)果Table 4Results of interference verification test

由表4可見，3批疫苗的回收率分別為80.40%、139.76%、132.8%，均在50%～200%之間，符合藥典的要求。回歸方程LgTg= 2.922 4－0.256 2 LgC，相關(guān)系數(shù)(r)－0.997 2，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合《中國藥典》［3］規(guī)定，試驗有效。試驗進(jìn)一步證明，甲肝疫苗160倍稀釋時確無干擾作用，試驗結(jié)果表明甲肝疫苗可用此法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

2.4 濁度法定量檢測與凝膠法檢測結(jié)果對比

按濁度法檢測的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，與經(jīng)凝膠法檢定的同批疫苗含量的對比，結(jié)果見表5。由表5可見濁度法檢測的10批疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于該疫苗的限值L=20 EU/mL，判定為合格，經(jīng)凝膠法檢出的細(xì)菌內(nèi)毒素含量也均小于該疫苗的限值L=20 EU/mL，判為合格。兩種方法檢測結(jié)果一致。

表5 動態(tài)濁度法定量檢測與凝膠法檢測比較Table 5Comparison of the detection results of the turbidity method and the gel method

續(xù)表5

3 討論

本研究采用英國ATi321-06型動態(tài)試管檢測儀，按照《中國藥典》［3］中動態(tài)濁度法對甲肝疫苗進(jìn)行了干擾初篩試驗。在疫苗稀釋160、320及640倍的情況下，均無干擾作用，符合規(guī)定要求。干擾驗證試驗進(jìn)一步證明，疫苗稀釋160倍無干擾，可做日常檢查的濃度，用于細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測。

《中國藥典》［3］規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度法，后者包括動態(tài)濁度法，供試品檢測時可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗，當(dāng)結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外以凝膠法為準(zhǔn)。本研究采用動態(tài)濁度法對10批甲肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測的結(jié)果，與凝膠法檢定的同批疫苗結(jié)果一致。結(jié)果顯示，動態(tài)濁度法用于甲肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測是可行的。細(xì)菌內(nèi)毒素試驗?zāi)z定性法與動態(tài)濁度定量法都是藥典規(guī)定的方法，凝膠法檢測結(jié)果只能判斷產(chǎn)品的內(nèi)毒素是否超標(biāo)，無法給出準(zhǔn)確的含量，但不需要專門儀器;動態(tài)濁度法需要專用設(shè)備，但動態(tài)濁度法具有操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高、檢測范圍廣等優(yōu)點，能快速、準(zhǔn)確獲知樣品中的內(nèi)毒素含量，且配有自動儀器檢測和進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，還克服了凝膠法主觀判斷結(jié)果等因素影響，結(jié)果能保存，有利于制品質(zhì)量控制［11-14］。在甲肝疫苗生產(chǎn)的中間控制環(huán)節(jié)推廣使用動態(tài)濁度法進(jìn)行定量檢測，能夠更加精確地反映疫苗生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)制品的內(nèi)毒素水平。動態(tài)濁度法以其高靈敏度、更低的檢測下限、準(zhǔn)確的定量而成為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的發(fā)展方向。推廣應(yīng)用動態(tài)濁度法對保證甲肝疫苗質(zhì)量和使用安全具有重要意義。

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Detection of Bacterial Endotoxin Content in Freeze-Dried Attenuated Hepatitis A Live Vaccine by Dynamic Turbidity Method

ZENG Yan，SUN Yang，LAN Yan，CUI Yue，DONG Li-zi，YANG Hong-yu
(Changchun Inst.of Bio-Products Co Ltd.，Changchun 130062)

The feasibility of dynamic turbidity method to detect bacterial endotoxin content in freeze dried attenuated hepatitis A live vaccine was investigated.According to Incoterms 1143 on Bacterial Endotoxin Detection Method in Chinese Pharmacopoeia Ver.2015，and the freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine for standard curve reliability test，interference initial screening test，interference verification test and the endotoxin content was determined，and compared with the results by gel method for verification of the same batch of vaccine.The reliability test results of standard curves accord with the regulations.Interference of early screening test，160 times and 320 times as well as 640 times dilution of the vaccine，the recovery rate was between 50%and 200%，all without interference，and accord with the requirement.Interference verification test has further proved that vaccine dilution 160 times had no interference effect on the test，the kinetic turbidimetric assay of 10 batches of hepatitis A vaccine bacterial endotoxin content were all less than the vaccine limits value of L=20 EU/mL，and verification by gel method for the same batch of vaccine results are consistent with.Therefore，it is feasible to detect the content of bacterial endotoxin in freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine by dynamic turbidity method，and it is worth the popularization and application.

kinetis-turbidimetric assay;bacteical endotoxin;freeze-dried attenuated hepatitis A live vaccine

Q939.93

A

1005－7021(2016)04－0062－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.011

曾艷女，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師。主要從事生物制品質(zhì)量檢定工作。Tel:0431-87917255，E-mail:yuxiaonan1989@126.com

*通訊作者。男，副研究員。主要從事生物制品質(zhì)量管理工作。Tel:0431-87917255，E-mail:YHY196606@163.com

2016-05-27;

2016-07-27