陳 雁，張耀中，張漸軒，羅莉川，胡鵬言，李蓓蕾，謝博文，紀云西，李柳梅

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310001；3.貴港市中醫(yī)院，廣西貴港537100）

脂肝方對非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂肪酸、血脂、肝功能及肝細胞病理形態(tài)學(xué)的影響

陳 雁1，張耀中1，張漸軒1，羅莉川1，胡鵬言1，李蓓蕾1，謝博文1，紀云西2，李柳梅3

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310001；3.貴港市中醫(yī)院，廣西貴港537100）

［目的］探討脂肝方（ZGF）對非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠脂肪酸、血脂、肝功能及肝細胞病理形態(tài)學(xué)的影響。［方法］SPF級健康SD大鼠（雌雄各半）160只隨機分為正常組40只、模型組40只（8 w模型組、12 w模型組各20只）、西藥對照組20只及脂肝方（ZGF）高、中、低劑量組各20只。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，余組予高脂飼料喂養(yǎng)制備NASH模型，8 w非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）模型成功后各組給予相應(yīng)藥物4 w，于第12周末采血，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）及游離脂肪酸（FFA）含量，并觀察肝組織病理變化。［結(jié)果］結(jié)果表明，與8 w正常組相比，8 w模型組肝細胞內(nèi)脂肪變性，脂滴沉積，12 w模型組較8 w模型組肝細胞間有較多的氣球樣變、大泡性脂變，有明顯肝細胞壞死及炎細胞浸潤。除ZGF低劑量組外，各用藥組肝細胞變性壞死及炎細胞浸潤均較12 w模型組明顯改善，以ZGF高劑量組最明顯。12 w模型組ALT、AST、FFA含量及TC、TG含量高于8 w模型組（P<0.05），與12 w模型組相比，西藥對照組和ZGF高、中劑量組的ALT、AST、FFA、TC及TG含量均降低（P<0.05），ZGF高劑量組各指標含量最低且低于8 w模型組（P<0.05）。［結(jié)論］脂肝方對非酒精性脂肪性肝（NAFLD）發(fā)展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝組織炎癥有一定的改善作用，機制可能與其降低ALT和AST、TG、TC及FFA水平有關(guān)。

非酒精性脂肪性肝炎；脂肝方；生化指標；病理形態(tài)學(xué)

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由多病因引起的代謝性肝臟疾病，而非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatosis hepatitis，NASH）屬于NAFLD的一種病理類型。隨著人們生活水平的增高，其患病率也逐年增高，在我國，NAFLD是僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾?。?］。NASH嚴重威脅著人類的健康，疾病后期可進展為肝硬化、肝癌，而肝硬化不可逆轉(zhuǎn)，嚴重影響人們的健康及生活質(zhì)量［2］。前期的研究表明脂肝方（ZGF）可以有效改善肝內(nèi)炎癥活動度，證實ZGF是治療NASH的有效方劑［3］。本研究通過復(fù)制NASH大鼠模型，觀察ZGF對從NAFLD到NASH大鼠肝組織相關(guān)生化指標及病理形態(tài)學(xué)的影響，從而探討ZGF抑制肝組織炎癥的作用機制，為臨床NASH的防治提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物SPF級健康SD大鼠（雌雄各半）160只，體質(zhì)量（200±20）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK桂2013-0002。在實驗過程中對動物的飼養(yǎng)及處理符合動物倫理學(xué)標準。分籠飼養(yǎng)于室溫22～26℃、相對濕度60%～80%、明暗各12 h的動物實驗室內(nèi)。

1.2 藥物脂肝方（處方由黨參25 g、白術(shù)20 g、山楂20 g、虎杖15 g、決明子20 g、姜黃10 g組成，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，水煎濃縮制成每毫升藥液含生藥1.1 g，4℃保存）。阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥，每片10 mg，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字：J20030047，批號：N93619）。

1.3 試劑及儀器谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）及總膽固醇（TC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Rat游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）ELISA試劑盒（武漢華美工程公司）；S500P型自動生化光譜分析儀（法國Gilson公司）；5417R型高速冷凍離心機（德國EPPENDORF公司）；RM2135 Leica切片機（無錫市華寶切片機制造總公司）；OLYMPUS BX51型正置顯微鏡（日本OLYMPUS）。

2 方法

2.1 動物分組及模型的制備將160只SD大鼠隨機分為正常組40只、模型組40只（8 w模型組、12 w模型組各20只）、西藥對照組20只、ZGF高劑量組20只、ZGF中劑量組20只、ZGF低劑量組20只。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，其他組參照文獻［4］的造模方法予高脂飼料喂養(yǎng)（2%膽固醇+10%豬油+ 88%標準飼料），飼養(yǎng)8 w病理確認非酒精性脂肪性肝病造模成功后，除正常組外，余組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時正常組和模型組給予相當(dāng)于成人等效劑量蒸餾水，ZGF高、中、低劑量組大鼠給予脂肝方水煎劑（分別相當(dāng)于成人等效劑量的15、10、5倍）灌胃給藥，西藥對照組給予阿托伐他汀鈣片1 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)4 w。

2.2 標本采集實驗于第8 w末從正常組、模型組中各隨機取出20只大鼠麻醉后采血液標本，處死并采集肝臟標本；肝組織進行HE染色，其血清檢測ALT和AST、TG和TC及FFA水平；其余的正常組、模型組、ZGF高劑量組、ZGF中劑量組、ZGF低劑量組和西藥對照組于12 w末，全部大鼠經(jīng)隔夜禁食12 h，飲水不限，稱大鼠體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，靜置2 h后離心，分離血清，分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。采血后作腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟，在肝臟右葉中部，距肝臟邊緣0.5 cm處取約0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的肝組織10%甲醛固定，常規(guī)制備成石蠟塊。

2.3 觀察指標

2.3.1 肝組織病理染色取距離肝邊緣0.5 cm處相同部位肝右葉組織小塊，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，經(jīng)體積分數(shù)為10%中性甲醛溶液固定標本，常規(guī)脫水、石蠟包埋，作3 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變。NAFLD活動度積分（NAS）組織學(xué)評分判斷標準［5］見表1，滿分為8分。

表1 NAFLD活動度積分組織學(xué)評分判斷標準

2.3.2 血清中ALT、AST、TG和TC含量檢測取大鼠血清用S500P型自動生化光譜分析儀（法國Gilson公司）檢測血清ALT、AST、TG和TC的含量。

2.3.3 血清FFA含量檢測取大鼠血清按Rat FFA ELISA試劑盒（武漢華美工程公司）說明書進行操作，于450 nm波長處測吸光度。以Curve Expert曲線擬合軟件計算標準曲線的回歸方程，分別計算樣品濃度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗；多個樣本間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脫落或終止情況各組大鼠在喂養(yǎng)及NASH模型復(fù)制過程中，均未見死亡。但在灌藥過程中，可能因灌胃操作不當(dāng)，導(dǎo)致ZGF低劑量組大鼠死亡2只，ZGF中劑量組和高劑量組大鼠死亡各1只。

3.2 8w正常組與8w模型組肝細胞病理光鏡觀察見圖1。

圖1 8w大鼠肝細胞病理結(jié)果（×200）

如圖示，8 w正常組大鼠肝細胞形態(tài)正常，肝小葉內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊有序，肝細胞未見變性、壞死或炎性細胞浸潤。8 w模型組大鼠肝組織中可見少量肝細胞脂肪變性，氣球樣變，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等量圓形脂滴。兩圖對比，說明NAFLD大鼠造模成功。

3.3 各組大鼠12 w肝組織病理學(xué)改變情況

3.3.1 各組大鼠12 w肝細胞HE染色光鏡圖見圖2。HE染色顯示，12 w模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索放射狀排列不明顯，大部分細胞腫脹，并大小不均，細胞輪廓模糊，胞核消失或被脂肪空泡擠向一側(cè)。脂肪泡以氣球樣變?yōu)橹?，匯管區(qū)及小葉內(nèi)炎癥細胞浸潤和散在的點狀壞死增多。經(jīng)各藥物組干預(yù)后，ZGF低劑量組除外，各用藥組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整清晰，肝索放射狀排列明顯，部分肝細胞體積增大，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂肪空泡，以氣球樣變?yōu)橹?，在中央靜脈及匯管區(qū)周邊脂變程度較輕。匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤，偶見肝細胞壞死灶。其中以ZGF高劑量組脂肪滴及炎癥浸潤減少最明顯，見圖2。

圖2 12w各組大鼠肝組織病理學(xué)改變情況（×200）

3.3.2 各組肝組織NAFLD活動度積分（NAS）比較見表2。8 w模型組NAS<3分，可排除NASH；12 w模型組NAS>4分，可診斷為NASH。與12 w模型組相比，西藥對照組、ZGF高劑量組、ZGF中劑量組的NAS降低（P<0.05）。

3.4 各組血清ALT、AST、TG、TC及FFA水平比較見表3。

表2 各組肝組織NAFLD活動度積分（NAS）比較（分，s）

表2 各組肝組織NAFLD活動度積分（NAS）比較（分，s）

注：與8 w模型組比較，①P<0.05；與12 w模型組比較，②P<0.05

組別n肝脂肪變小葉內(nèi)炎癥肝細胞氣球樣變NAS 8 w正常組200.00±0.00②0.00±0.00②0.00±0.00②0.00±0.00①②8 w模型組201.35±0.050.81±0.050.74±0.062.90±0.16 12 w正常組200.00±0.00②0.00±0.00②0.00±0.00②0.00±0.00②12 w模型組201.98±0.02①1.97±0.01①1.58±0.12①5.53±0.15①西藥對照組201.37±0.13②1.13±0.06②1.20±0.09②3.70±0.28②ZGF高劑量組191.23±0.08①②0.81±0.04①②0.75±0.01①②2.79±0.13①②ZGF中劑量組191.35±0.12②1.14±0.11②1.19±0.07②3.68±0.30②ZGF低劑量組181.96±0.101.88±0.061.47±0.055.31±0.21①

表3 各組血清ALT、AST、TG、TC及FFA水平比較（±s）

表3 各組血清ALT、AST、TG、TC及FFA水平比較（±s）

注：與8 w模型組比較，①P<0.05；與12 w模型組比較，②P<0.05；與西藥對照組比較，③P<0.05

組別nALT（U/L）AST（U/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）FFA（μmol/L）8 w正常組2050.35±7.68①②③91.20±15.28①②③0.49±0.08①②③2.09±0.42①②③344.33±53.99①②③8 w模型組2067.60±8.83③138.35±10.20③0.73±0.13③3.31±0.42③475.81±54.72③12 w正常組2051.05±6.70①②③90.70±11.45①②③0.50±0.07①②③2.31±0.45①②③345.12±56.02①②③12 w模型組2093.61±10.46①③166.22±13.11①③1.11±0.08①③4.42±0.51①③605.83±60.32①③西藥對照組2074.88±7.23②117.35±13.18②0.92±0.08②3.94±0.44②504.87±62.13②ZGF高劑量組1957.11±9.29①②③110.68±16.18①②③0.59±0.08①②③2.61±0.42①②③409.22±57.80①②③ZGF中劑量組1975.16±8.38②118.01±16.81②0.91±0.11②3.95±0.47②505.45±60.11②ZGF低劑量組1893.02±10.36③167.01±16.97③1.10±0.08③4.41±0.48③606.13±65.52③

4 討論

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是常見的慢性肝臟疾病，主要為血中游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的增高，肝細胞脂肪變性，細胞凋亡增加［6］，并伴隨有血清轉(zhuǎn)氨酶的升高等表現(xiàn)。脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的肝內(nèi)脂質(zhì)異常沉積是NASH發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。肝臟中聚集的脂質(zhì)包括甘油三酯、膽固醇和FFA等［7］。NASH患者體內(nèi)的FFA升高水平與疾病的嚴重程度有關(guān)［8］，研究表明，甘油三酯對細胞的損傷程度較小，F(xiàn)FA是具有高度細胞毒性的分子，作用于肝細胞可致線粒體腫脹和通透性增加，肝細胞變性、壞死和炎性浸潤，從而導(dǎo)致細胞功能失調(diào)和凋亡［9］。在正常情況下肝臟攝取血中的FFA，合成TG及少量膽固醇和磷脂，同時將TG與載體蛋白或脂蛋白釋放到血液中，當(dāng)肝臟攝入的脂肪量超過肝臟的脂質(zhì)和氧化能力，或者肝臟合成低密度脂蛋白障礙時，肝臟合成的內(nèi)源性TG就不能以脂蛋白的形式進出肝臟，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細胞內(nèi)外堆積而形成脂肪肝。ALT、AST是評價肝功能的重要指標，是診斷非酒精性脂肪肝炎的可靠評價標準［10］。ALT主要存在于肝細胞胞漿內(nèi)，輕微的肝細胞損傷即可引起ALT的升高，20%AST位于胞漿，80%位于線粒體內(nèi)，當(dāng)血清AST顯著升高并排除心臟病變后，應(yīng)首先考慮肝細胞線粒體大量破壞、壞死。NASH發(fā)生時往往伴隨著線粒體功能的損害，導(dǎo)致ALT及AST水平升高。中醫(yī)認為，NASH者多素體脾虛，嗜食肥甘厚膩，飲食失節(jié)，脾失健運，水濕內(nèi)停，濕熱內(nèi)蘊，痰濁凝滯，瘀血內(nèi)結(jié)，終致濕濁痰瘀互結(jié)于肝，阻滯肝脈而最終形成NASH。在治法上，肝病當(dāng)先實脾。東垣有曰：“其治肝有余不足，或瀉或補，惟脾胃之藥之切?！薄督饏T要略》云：“實脾則肝自愈，此治肝補脾之要妙也”。脂肝方具有健脾益氣、宣暢氣化、化痰祛瘀之功效，可以有效控制脂肪肝向脂肪性肝炎發(fā)展。本研究通過復(fù)制NASH大鼠模型，觀察ZGF對NAFLD、NASH大鼠肝組織生化指標的影響，通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8 w后，模型組大鼠光鏡下見肝組織中幾乎所有細胞脂肪變性，未見肝小葉，肝細胞損傷嚴重，胞質(zhì)內(nèi)可見大量圓形脂滴，細胞核被擠向邊緣。12 w后，模型組大鼠肝組織存在廣泛而嚴重的大泡及小泡混合型的肝細胞脂肪沉積及部分壞死，中央靜脈周圍炎癥細胞浸潤，炎性細胞浸潤以大量單個核細胞為主，細胞核被脂滴擠壓到細胞邊緣，也可見少量纖維組織增生等，與文獻報道［11-12］改變一致；模型組血清ALT、AST水平較對照組明顯升高，這與組織學(xué)上炎癥壞死程度相一致，表明造模12 w后脂肪肝大鼠發(fā)展為脂肪性肝炎，采用ZGF對NASH大鼠模型進行干預(yù)后，肝組織病理學(xué)結(jié)果顯示肝臟損傷明顯好轉(zhuǎn)，肝細胞呈輕度水樣變，脂肪變性減少，僅見少數(shù)肝細胞呈脂肪變，個別呈氣球樣變，末見明顯的肝細胞壞死及炎細胞浸潤，偶見輕度纖維組織增生，匯管區(qū)擴大不明顯，血清ALT、AST水平明顯降低，其中脂肝方高劑量組對肝細胞損傷程度改善明顯，提示ZGF對從脂肪肝到NASH大鼠的肝組織炎癥有一定的改善作用且有一定的量效關(guān)系，機制可能與其降低ALT、AST、TG、TC及FFA含量有關(guān)。

［1］鄒必英.非酒精性脂肪肝病因病機淺析［J］.山東中醫(yī)雜志，2013，32（5）：301-302.

［2］Forbes S，Taylor-Robinson S D，Patel N，et al.Increased prevalence of non alcoholic fatty liver disease in European women with a history of gestational diabetes［J］.Diabetologia，2011，54（3）:641-647.

［3］劉佳.脂肝方對非酒精性脂肪肝大鼠中脂聯(lián)素抵抗素影響研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

［4］范健高，錢燕，鄭曉英，等.已酮可可堿對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟核因子-κB信號通路及胰島素抵抗的干預(yù)作用［J］.中華肝膽雜志，2006，14（10）：762-766.

［5］中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-166.

［6］Feldstein A E，Gores G J.Apoptosis in alcoholic and nonalcoholic steatohepatitis［J］.Frontiers in Bioscience，2005（10）:3093-3099.

［7］Mc Cullough A J.The clinical features，diagnosis and natural history of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Clinics in liver disease，2004（8）:521-533.

［8］Musso G，Gambino R，Cassader M.Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）［J］.Progress in lipid research，2009（48）: 1-26.

［9］Unger R H.Lipid overload and overflow:metabolic trauma and the metabolic syndrome［J］.Trends in endocrinology and metabolism tem，2003（14）:398-403.

［10］Giannini E G，Testa R，Savarino V.Liver enzyme alteration:a guide for clinicians［J］.CMAJ，2005（172）:367-379.

［11］George J，Pera N，Phung N，et al.Lipid peroxidation，stellate cell activation and hepatic fibrogenesis in a rat model of chronic steatohepatitis［J］.J Hepatol，2003，39（5）:756-764.

［12］Leclercq I A，F(xiàn)arrell G C，F(xiàn)ield J，et al.CYP2E1 and CYP4A as microsomal catalysts of lipidperoxides in murine nonalcoholic steatohepatitis［J］.J Clin Invest，2000，105（8）:1067-1075.

（編輯 熊 瑜）

R256.43

A

2095-4441（2016）04－0009－04

2016－11－01

國家自然科學(xué)基金項目（編號：80120531、80140715）；廣西高等學(xué)校重點資助科研項目（編號：201102ZD023）

陳雁（1990-），女，廣西玉林人，研究方向：脾胃、肝膽疾病的臨床與實驗研究

紀云西，教授，研究方向：脾胃、肝膽疾病的臨床與實驗研究；E-mail：ji-yunxi@163.com