宋冠華，沙 潔，王紹芬，葉翰江，曾令達(dá)*

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007；2.惠州市惠陽區(qū)水果辦，廣東惠州 516014）

淡水沙梨外植體培養(yǎng)技術(shù)研究

宋冠華1，沙 潔1，王紹芬1，葉翰江2，曾令達(dá)1*

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007；2.惠州市惠陽區(qū)水果辦，廣東惠州 516014）

為控制外植體褐化及促進(jìn)外植體的萌芽和愈傷組織的形成，以淡水沙梨新梢為材料，以MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加活性炭或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)頂芽、腋芽和節(jié)間莖段.結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加2 g/L活性炭的淡水沙梨褐化率為6.9%，而未添加活性炭的淡水沙梨褐化率為11.1%，新梢當(dāng)天接種褐化率為13.3%，第二天接種的褐化率為46.7%，第四天接種的褐化率為66.7%.新梢頂芽的出芽率為48.5%，愈傷組織形成率為9.0%，腋芽的出芽率為30.3%，愈傷組織形成率為51.5%，節(jié)間無芽莖段的出芽率為0，愈傷組織形成率為45.2%.培養(yǎng)基中添加活性炭能降低褐化率，離體時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的褐化有很大影響，新梢離體時(shí)間越長(zhǎng)，接種后褐化率越高，帶頂芽的外植體比帶腋芽的外植體出芽率更高.

淡水沙梨；外植體；莖段；褐化

1 前言

淡水沙梨，又名淡水紅梨，原產(chǎn)廣東惠州淡水、秋長(zhǎng)等地，是以產(chǎn)地命名的地方名優(yōu)水果.淡水沙梨果面紅褐色，耐高溫濕潤(rùn)氣候、耐貯運(yùn)，曾經(jīng)是秋季出口的傳統(tǒng)名果之一[1].淡水沙梨20世紀(jì)50年代主要栽培在葉挺將軍故鄉(xiāng)的惠陽區(qū)秋長(zhǎng)鎮(zhèn)，栽培面積約8 000多畝，年產(chǎn)量約20～30萬擔(dān)，苗木20萬株[2].由于80、90年代惠州房地產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，以及北方優(yōu)質(zhì)梨的低價(jià)沖擊等原因，大部分果農(nóng)因此砍伐梨樹而致淡水沙梨栽培面積和數(shù)量大幅下降.淡水沙梨現(xiàn)存不足500株，大都進(jìn)入衰老死亡期，且處于失管狀態(tài)瀕臨絕種邊緣.為快速繁殖種苗和保存地方優(yōu)質(zhì)水果品種資源，本實(shí)驗(yàn)采用淡水沙梨的新梢作為材料，研究活性炭及離體時(shí)間對(duì)淡水沙梨組織培養(yǎng)褐化的影響，以及不同新梢部位作為外植體培養(yǎng)對(duì)萌芽率和愈傷組織形成率的影響，以期為淡水沙梨的組織培養(yǎng)和種質(zhì)資源的離體保存提供參考.

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

本次試驗(yàn)材料為惠州市惠陽區(qū)淡水沙梨，于2016年3月下旬至4月下旬在淡水沙梨樹上取當(dāng)年生帶芽且生長(zhǎng)健壯無病蟲的幼嫩枝條.以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8～6.0.

2.2 外植體的處理

取淡水沙梨幼嫩枝條，剪去葉片，剪成4～5 cm的小段.在自來水緩流水中沖洗1 h，用洗滌劑稀釋液清洗3 min，再用流水沖洗干凈.用75%的乙醇溶液浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡11 min，期間需要不斷地?fù)u動(dòng)使莖段充分接觸溶液，然后用無菌水沖洗5次，每次3 min.滅菌沖洗過后，用濾紙吸干枝條小段上的水，將材料切成0.5～1.0 cm的莖段，以備接種.

3 結(jié)果與分析

3.1 活性炭對(duì)淡水沙梨褐化的影響

在采摘淡水沙梨枝條當(dāng)天進(jìn)行接種培養(yǎng)，在未添加活性炭的MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基中，接種2 h后即發(fā)現(xiàn)有部分外植體出現(xiàn)褐化，經(jīng)過48 h后統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率為11.1%，在添加2 g/L活性炭的培養(yǎng)基中，外植體的褐化率為6.9%.褐化率由對(duì)照組的11.1%下降至6.9%，下降4.2%.如表1所示.

3.2 外植體離體時(shí)間對(duì)淡水沙梨褐化的影響

將采摘的新梢用報(bào)紙包好，裝在密封袋中，4℃條件下貯藏.使用不同貯藏時(shí)間的離體新梢在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行接種培養(yǎng).如表2，將采摘的淡水沙梨幼嫩枝條第一天進(jìn)行接種培養(yǎng)，褐化率為13.3%，第二天接種的褐化率為46.7%，第四天接種的褐化率為66.7%.采摘后的接種材料，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，接種后褐化率越高.

表1 活性炭對(duì)淡水沙梨莖段褐化的影響

表2 不同離體時(shí)間對(duì)淡水沙梨褐化的影響

3.3 不同外植體類型對(duì)芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表3所示，將不同的外植體在采樣當(dāng)天接種到MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，節(jié)間的無芽莖段外植體項(xiàng)端切口處形成愈傷組織（見圖1），愈傷率達(dá)到45.2%，但是不能直接出芽，出芽率為0.利用有芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)，10個(gè)有芽莖段在頂端的切口處形成愈傷組織（見圖2），愈傷率為32.3%.13個(gè)有芽莖段則芽萌發(fā)（見圖3），其頂端形成的愈傷組織結(jié)塊變薄，顏色變褐色，形成栓皮.有芽莖段出芽率為38.7%.不同類型的外植體愈傷組織均為乳白色大塊近圓錐形覆蓋在切口的項(xiàng)端，節(jié)間的無芽莖段比帶節(jié)的有芽莖段的愈傷組織形成率要高.

表3 不同外植體類型對(duì)芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3.4 不同取材部位對(duì)芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將頂芽和腋芽莖段均接種在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用頂芽進(jìn)行培養(yǎng)，頂芽可萌發(fā)（見圖4），出芽率能達(dá)到48.5%，愈傷率為9.0%，利用腋芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)，出芽率為30.3%，愈傷率為51.5%，利用頂芽進(jìn)行培養(yǎng)的愈傷率會(huì)比腋芽低，頂芽的出芽率比腋芽高，說明采用頂芽進(jìn)行培養(yǎng)比腋芽更傾向于直接出芽.如表4所示.

表4 不同取材部位對(duì)芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

4 結(jié)論與討論

木本植物組織培養(yǎng)中，褐化是影響成活的主要因素之一[3].有研究認(rèn)為組織的褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)所致[4].在本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中添加活性炭能降低淡水沙梨外植體的褐化率，在2 g/L活性炭條件下，淡水沙梨培養(yǎng)的褐化率為6.9%，比對(duì)照組下降了4.2%.劉杰等[5]用2 g/L活性炭對(duì)鴨梨組培過程進(jìn)行防褐化，褐化率由對(duì)照組的78%下降到68%，下降了10%.本次試驗(yàn)與劉杰等人研究結(jié)果相一致.活性炭的多孔結(jié)構(gòu)能夠吸附外植體產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而減輕對(duì)外植體的傷害[4]，淡水沙梨的褐化率下降可能跟活性炭吸收了褐化有毒物質(zhì)有關(guān).材料貯存時(shí)間越久，越容易褐化，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淡水沙梨外植體離體時(shí)間對(duì)褐化有影響，離體時(shí)間越短，接種后褐化率越小，離采新梢時(shí)間越長(zhǎng)，接種后褐化率越高.新梢第一天接種時(shí)，褐化率為13.3%，第四天接種時(shí)，則褐化率為66.7%.原因可能是新梢存貯時(shí)間越長(zhǎng)，氧化物質(zhì)會(huì)越多，會(huì)產(chǎn)生更多的有害物質(zhì)對(duì)植物組織形成傷害.

淡水沙梨無芽莖段和有芽莖段有不同的離體培養(yǎng)表現(xiàn)，無芽莖段沒有直接出芽，但能形成愈傷組織，愈傷率為45.2%；有芽莖段既能直接出芽，也能形成愈傷組織，出芽率和愈傷率分別為38.7%和32.3%.何志祥等[6]以翠冠梨為材料研究表明，有芽莖段更傾向于直接出芽，出芽率為93.75%，愈傷率為6.25%，無芽莖段則不能直接出芽，愈傷率為25%.田宏現(xiàn)等[7]以米良1號(hào)獼猴桃為試材，研究發(fā)現(xiàn)，有芽莖段出芽易，無芽莖段出芽難.本次試驗(yàn)與何志祥、田宏現(xiàn)等人的研究結(jié)果相一致.有芽莖段中，采用頂芽與腋芽作為外植體培養(yǎng)的結(jié)果有所不同，頂芽的出芽率比腋芽高，而腋芽的愈傷組織形成率比頂芽高.平秀敏等[8]用紅星鳳梨為試材，在組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，頂芽比腋芽的再生率更高，徐凌飛[9]以八月紅梨為試材，發(fā)現(xiàn)頂芽的增殖系數(shù)比腋芽高.說明在離體培養(yǎng)中，選用頂芽和腋芽的培養(yǎng)效果是不同的，頂芽比腋芽更容易直接出芽.

圖1 淡水沙梨無芽莖段培養(yǎng)

圖2 淡水沙梨腋芽莖段培養(yǎng)

圖3 淡水沙梨腋芽莖段培養(yǎng)

圖4 淡水沙梨頂芽莖段培養(yǎng)

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A Study of Explant Culture Techniques of Danshui Pear

SONG Guan-hua1,SHA Jie1,WANG Shao-fen1,YE Han-jiang2,ZENG Ling-da1*
（1.College of Life Science，Huizhou University，Huizhou,Guangdong,516007; 2.Fruit Production Office,Huiyang District,Huizhou,Guangdong,516014）

In order to control browning,promote sprouting and the formation of callus of explant,selecting Danshui pear as material,and taking MS（Murashige and Skoog）as the basic medium,activated carbon and plant growth regulators have been added to cultivate terminal buds,axillary buds and internodal stems without buds.It has been revealed that the browning rate of fresh material is 7.2%after adding 2 g/L activated carbon to the medium.The browning rate is 13.3%when the picked branches have been inoculated at the same day as they were picked.And the browning rate is 46.7%and 66.7%.There is a marked difference of browning among that very day,the second day and the fourth day.The germination rate for terminal buds is 48.5%while formation rate for callus is 9.0%.The germination rate for axillary buds is 30.3%while formation rate for callus is 51.5%.And formation rate for callus of internodal stems without buds is 45.2%.That is to say,germination rate of terminal buds is higher than that of axillary buds.The browning rate for explant is closely related to inoculative time.Low degree of browning would be achieved while inoculated at that very day to culture in vitro.

Danshui pear;explant;stems;browning

S 661.2

：A

：1007-6883（2016）06-0045-04

責(zé)任編輯 朱本華 周春娟

2016-08-31

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013B020304010）；惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013B040009001）.

宋冠華（1969-），男，廣東紫金人，惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師；曾令達(dá)為通訊作者.