孫艷艷，吳希雯，陳 蕾，嚴(yán) 生

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009）

含靶向性雙膦酸基團(tuán)的乙二胺衍生物的合成及細(xì)胞毒活性

孫艷艷*，吳希雯，陳 蕾，嚴(yán) 生

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009）

設(shè)計(jì)并合成一類含靶向性雙膦酸基團(tuán)的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，通過(guò)元素分析、核磁氫譜、碳譜、磷譜、高分辨質(zhì)譜對(duì)所有化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并利用CCK-8試劑盒檢測(cè)化合物對(duì)卵巢癌SKOV3及骨肉瘤MG-63細(xì)胞系72h的體外抑制活性，并通過(guò)SPSS軟件計(jì)算IC50值，尋找潛在抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

雙膦酸；乙二胺；合成；細(xì)胞毒活性

雙磷酸鹽（Bisphosphonates，BPs）是一種人工合成的焦磷酸類似物，BPs結(jié)構(gòu)中的P—C—P鍵代替焦磷酸中的P—O—P，在生物體內(nèi)有一定的穩(wěn)定性，能抑制生物體內(nèi)焦磷酸酯酶的降解作用，且與骨組織羥基磷灰石表現(xiàn)特殊親合力，具有骨靶向性[1]。雙磷酸鹽在抑制骨吸收方面效果顯著，用于治療許多骨相關(guān)疾病，包括高血鈣癥、骨髓瘤、變形性骨炎和骨質(zhì)疏松等[2]。此外，據(jù)報(bào)道BPs還有直接或間接的抗腫瘤活性，對(duì)乳腺癌、肺癌和骨肉瘤等有較高的抑制活性[3]。雙膦酸類藥物迄今已經(jīng)歷三代的發(fā)展，包括第一代的氯屈膦酸和依替膦酸（不含氮），第二代的帕米膦酸和阿侖膦酸（含氨烷基），和第三代的唑來(lái)膦酸和米諾膦酸（含氮雜環(huán)），其中唑來(lái)膦酸是治療效果最好的雙膦酸類藥物，具有高度的骨親合力及抑制骨吸收活性[4-5]。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)雙膦酸類藥物的結(jié)構(gòu)修飾和篩選取得很大進(jìn)展，尤其是針對(duì)含氨基雙膦酸類藥物的研究[6-7]。本文設(shè)計(jì)并合成一類含靶向性雙膦酸取代基的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，通過(guò)核磁、元素分析及高分辨質(zhì)譜等對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，并研究其對(duì)卵巢癌及骨肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性，這種N，N’-二雙膦酸取代的衍生物目前尚未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。細(xì)胞株培養(yǎng)基均用RPMI-1640。CCK-8試劑盒購(gòu)于碧云天。核磁共振儀（Bruker Avance III HD 400 MHz），元素分析儀Vario EL（Elementar），液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 6230 Accurate-Mass TOF LC/ MS）。

1.2 化合物的制備

化合物的合成路線如圖1所示。M1的制備參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]。0.25mol的M1溶解在1.5mol的85%亞磷酸和120mL氯苯中，加熱至100℃，逐滴滴加1mol三氯化磷，攪拌40min，反應(yīng)劇烈并產(chǎn)生大量黃色固體，繼續(xù)反應(yīng)3h，棄掉上清液氯苯，殘留液減壓蒸餾蒸去溶劑，再加入250mL水，加熱回流20 min，再加入少量活性炭回流攪拌15min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，冷卻析出得到粗產(chǎn)物，過(guò)濾干燥，用水-丙酮重結(jié)晶得到淺黃色固體，即化合物1?；衔?-3的合成路線參考化合物1。數(shù)據(jù)如下：

化合物1：淺黃色固體（產(chǎn)率35%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.90～0.98（t，6H，CH3），1.44～1.52（m，4H，CH2），2.60～2.84（m，6H，NCH and NCH2），6.10～6.18（m，2H，NH），6.60（s，2H，COH），11.90（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（10.3，22.8，37.5，54.2，99.5）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.20×10-6；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C10H27N2O14P4：523.041 27，found：523.041 78；Anal.calcd for C10H28N2O14P4：C 22.91，H 5.38，N 5.34，found：C 22.96，H 5.32，N 5.38。

化合物2：淺黃色固體（產(chǎn)率42%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.92～1.01（t，6H，CH3），1.48～1.60（m，8H，CH2），2.58～2.85（m，6H，NCH and NCH2），6.15～6.24（m，2H，NH），6.55（s，2H，COH），11.85（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（10.5，14.0，23.8，40.2，56.6，98.5）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.22×10-6；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C12H31N2O14P4：551.072 57，found：551.072 79；Anal.calcd for C12H32N2O14P4：C 26.10，H 5.84，N 5.07，found：C 26.05，H 5.88，N 5.01。

化合物3：淺黃色固體（產(chǎn)率45%）。1H NMR（d6-DMSO）：δ 0.95～1.04（t，6H，CH3），1.41～1.53（m，12H，CH2），2.53～2.80（m，6H，NCH and NCH2），6.12～6.20（m，2H，NH），6.58（s，2H，COH），11.92（s，8H，POH）×10-6；13C NMR（d6-DMSO）：δ（9.2，10.8，23.0，25.7，42.0，57.5，97.9）×10-6；31P NMR（d6-DMSO）：17.24 ppm；HRMS：m/z[M-H]-calcd.for C14H35N2O14P4：579.103 87，found：579.103 25；Anal.calcd for C14H36N2O14P4：C 28.97，H 6.25，N 4.83，found：C 28.93，H 6.29，N 4.80。

圖1 化合物1-3的合成

1.3 生物活性測(cè)試

以唑來(lái)膦酸為陽(yáng)性對(duì)照，利用CCK-8法檢測(cè)化合物對(duì)卵巢癌和骨肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性，實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[9]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基稀釋后接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μL細(xì)胞液，濃度約為3×104個(gè)/mL。過(guò)夜培養(yǎng)（5%CO2，37℃），待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行給藥，分別設(shè)給藥組，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。待測(cè)化合物用超純水溶解，臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成7個(gè)濃度梯度。加藥后培養(yǎng)72h，加10 μL的CCK-8溶液（5 mg/mL），37℃孵育4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔OD值，并計(jì)算抑制率，通過(guò)SPSS軟件計(jì)算IC50值（半數(shù)抑制濃度）。

2 結(jié)果與討論

以N，N’-二乙基乙二胺與氯乙酸為原料，氫氧化鋁為縛酸劑制備中間體M1，再與亞磷酸和三氯化磷進(jìn)行磷酸化反應(yīng)得到化合物1，其他化合物的制備參考化合物1的制備方法，如圖1所示。所有化合物均通過(guò)核磁共振氫譜、碳譜、磷譜、元素分析及高分辨質(zhì)譜進(jìn)行表征，結(jié)構(gòu)與譜圖數(shù)據(jù)一致。

通過(guò)CCK-8細(xì)胞毒活性測(cè)試試劑盒，檢測(cè)化合物1-3與陽(yáng)性對(duì)照唑來(lái)膦酸對(duì)卵巢癌SKOV3及骨肉瘤MG-63細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒活性，結(jié)果如表1所示。從表1數(shù)據(jù)可知，化合物1-3對(duì)SKOV3的IC50值大于100μM，唑來(lái)膦酸的IC50值為28.3μM，表明化合物1-3對(duì)SKOV3的細(xì)胞毒活性低于陽(yáng)性對(duì)照唑來(lái)膦酸；化合物1和2對(duì)MG-63的IC50值分別為48.7 μM和53.5μM，唑來(lái)膦酸的IC50值為17.5μM，說(shuō)明1和2對(duì)MG-63的細(xì)胞毒活性高于化合物3，但低于陽(yáng)性對(duì)照唑來(lái)膦酸。整體而言，化合物1和2對(duì)MG-63的細(xì)胞毒活性比SKOV3較高，但均低于陽(yáng)性對(duì)照。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并合成了一類含雙膦酸基團(tuán)的N，N’-二乙基乙二胺衍生物，并研究其對(duì)卵巢癌及骨肉瘤細(xì)胞系的體外抑制活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，化合物1-2對(duì)骨肉瘤MG-63的細(xì)胞毒活性比卵巢癌SKOV3較高，但低于陽(yáng)性對(duì)照唑來(lái)膦酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)雙膦酸化合物的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。

Synthesis and Cytotoxicity of Ethylenediamine Derivatives with Bone-targeting Bisphosphonate Groups

Sun Yan-yan，Wu Xi-wen，Chen Lei，Yan Sheng

A novel series of N，N’-diethylethylenediamine derivatives containing N，N’-dibisphosphonate substituents have been synthesized and characterized by elemental analysis，1H NMR，13C NMR，31P NMR and HRMS spectra.The in vitro cytotoxicities of all compounds were tested with CCK-8 by WST-8 assay against SKOV3 and MG-63 cell lines after 72 h incubation and the IC50 values were obtained by SPSS software.

bisphosphonate；ethylenediamine；synthesis；cytotoxicity

R914

B

1003–6490（2016）10–0101–02

2016–09–15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（21401137），蘇州市“高等院校、科研院所緊缺高層次人才”引進(jìn)資助項(xiàng)目，江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510332057X）。

孫艷艷（1985—），女，河南武陟人，講師，主要研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)。