張海暉,李長征,羅孝平,段玉清

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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亞臨界水萃取麥胚蛋白及其功能特性的研究

張海暉,李長征,羅孝平,段玉清*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

以小麥胚芽為原料,通過單因素和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對亞臨界水萃取麥胚蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對其功能特性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明,麥胚蛋白最佳提取條件為:萃取溫度130 ℃,萃取時(shí)間15 min,料水比1∶20 g/mL,pH為9.4。在此條件下,麥胚蛋白的提取得率達(dá)42.25%,乳化活性為113.63 m2/g,乳化穩(wěn)定性為82.16%,起泡性為71.45%,起泡穩(wěn)定性為36.05%,持水性為4.21%,持油性為4.49%,溶解度為60.93%。與傳統(tǒng)堿溶酸沉法相比,亞臨界水萃取麥胚蛋白在提取時(shí)間、提取率等方面均具有明顯優(yōu)勢。

小麥胚芽,蛋白,亞臨界水萃取

小麥胚芽是面粉加工過程中的副產(chǎn)物,約占整粒小麥重量的3%,常作為飼料出售,導(dǎo)致寶貴的小麥胚芽資源未能被合理、有效地利用[1-2]。小麥胚芽中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%,僅次于大豆[3-5]。而且,麥胚蛋白是一種完全蛋白,必需氨基酸組成也合理[6-10]。因此,小麥胚芽是重要的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源,研究麥胚蛋白提取工藝對小麥胚芽資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

對于麥胚蛋白的分離制備,國內(nèi)外常采用堿溶酸沉法進(jìn)行研究[5,11-17],但提取得率通常較低。1996年N.S. Hettiarachchy等[18]最先采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法從脫脂麥胚中提取麥胚蛋白,其得率僅為28%。其功能特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,麥胚蛋白的溶解性和泡沫穩(wěn)定性較差。而亞臨界水萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新型提取技術(shù),其使用純水作為溶劑,避免有機(jī)溶劑的應(yīng)用和污染,且具有提取時(shí)間短、萃取效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),是一種具有潛力的綠色提取技術(shù),在植物有效成分提取領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[19-27]。近年來本課題組先后將亞臨界水技術(shù)用于米糠、板栗、蓮子蛋白的提取,均取得明顯成效[20,28-29]?；诖?本文利用亞臨界水萃取技術(shù),研究麥胚蛋白的萃取參數(shù),確定最佳工藝,并對亞臨界水萃取的麥胚蛋白的功能特性進(jìn)行研究,以期解決堿溶酸沉法提蛋白溶出率低的技術(shù)問題,為小麥胚芽資源的綜合開發(fā)與利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥胚芽 江南面粉廠。

石油醚,乙醇,磷酸鈉,氯化鈉,濃硫酸,硫酸銅,氫氧化鈉,考馬斯亮藍(lán)G-250,鹽酸,硼酸,磷酸,磷酸氫二鈉,十二烷基磺酸鈉等均為分析純 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

亞臨界水反應(yīng)釜 鎮(zhèn)江丹徒環(huán)球機(jī)電配件廠;Sartorius BSl10S型電子精密分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DL-5C離心機(jī) 上海安亭有限公司;UV-1601紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;ALPHAI-4/2-4 型冷凍干燥機(jī) 德國 CHRIST公司;pHS-29A型酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-S4恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;DZF6000電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海東麓儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分的測定 粗蛋白含量的測定:采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2010);水分含量的測定:采用105 ℃恒重法(GB/T5009.3-2010);灰分的測定:采用灰化法(GB/T5009.4-2010);粗脂肪含量的測定:采用索氏抽提法(GB/T5512-2008);淀粉含量的測定:采用酸水解法(GB/T15683-2008)。

1.2.2 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[30]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,測定可溶性蛋白的含量,并以牛血清蛋白濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),其吸光度為縱坐標(biāo)(A595 nm),得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0059x+0.025(R2=0.9937)。麥胚蛋白的提取得率:Y(%)=CV/M×100

C為可溶性蛋白濃度(mg/mL);V為提取液的體積(mL);M為脫脂后麥胚蛋白質(zhì)干重(g)。

1.2.3 亞臨界水萃取 提取工藝為:小麥胚芽→石油醚脫脂→脫脂麥胚→加入一定量的蒸餾水(調(diào)成一定pH)→放入萃取釜(控制適當(dāng)溫度和時(shí)間)→冷卻→離心(4500 r/min,20 min)→取上清液,測定蛋白含量,計(jì)算蛋白的提取得率→等電點(diǎn)沉淀(pH4.0)→離心(4500 r/min,20 min)→收集沉淀→冷凍干燥→麥胚蛋白粉末

1.2.4 堿溶酸沉法參考文獻(xiàn)方法 提取工藝為[5]:小麥胚芽→石油醚脫脂→脫脂麥胚→按料水比 1∶15 g/mL加入pH9.5的蒸餾水→45 ℃下□提1 h→離心(4500 r/min,20 min)→取上清液,測定蛋白含量,計(jì)算蛋白的提取得率→等電點(diǎn)沉淀(pH4.0)→離心(4500 r/min,20 min)→收集沉淀→冷凍干燥→麥胚蛋白粉末

1.2.5 亞臨界水萃取麥胚蛋白的單因素實(shí)驗(yàn) 時(shí)間:在料水比為1∶20,pH為10,溫度為140 ℃的條件下,考察不同時(shí)間(5、10、15、20、25 min)對蛋白提取得率的影響。

溫度:在提取時(shí)間為15 min,料水比為1∶20,pH為10的條件下,考察不同萃取溫度(100、110、115、120、130、140、150、160、170、180 ℃)對蛋白提取得率的影響。

pH:在提取溫度為120 ℃,時(shí)間為15 min,料水比為1∶20的條件下,考察不同pH(7、8、9、10、11)對蛋白提取得率的影響。

料水比:在pH為9,時(shí)間為15 min,提取溫度為120 ℃的條件下,考察不同的料水比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對蛋白提取得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以麥胚蛋白的提取率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken中心組合原理,選擇萃取時(shí)間、萃取溫度、pH和料水比為主要因素,選取3個中心點(diǎn)進(jìn)行29個實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表
Table 1 Table of factors and levels

水平因素X1萃取時(shí)間(min)X2溫度(℃)X3pHX4料水比(g/mL)-11010081∶1501512091∶20+120140101∶25

1.2.7 麥胚蛋白功能性質(zhì)的測定 將兩種提取方法得到的麥胚蛋白粉末,參照文獻(xiàn)方法[20],分別對其溶解度、持水(油)性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行功能性質(zhì)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂麥胚基本成分分析

表2所示為脫脂麥胚的成分測定。從中可以看出,脫脂麥胚中的淀粉含量最高,占56.46%,其次是蛋白質(zhì),占28.21%。

表2 脫脂麥胚各組分含量
Table 2 Componential contents of defatted wheat germ

成分粗蛋白質(zhì)淀粉脂肪水灰分含量(%)28215646109865559

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 時(shí)間對蛋白提取得率的影響 結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對蛋白得率的影響Fig.1 Influence of extracting time on the yield of protein

從圖1可以看出,隨著時(shí)間的延長,提取得率逐漸增大,在15 min時(shí)達(dá)到最大值,從15 min以后提取得率略微下降,可能是由于萃取時(shí)間過長,在高溫條件下使部分蛋白發(fā)生變性,或淀粉發(fā)生糊化,阻礙蛋白的溶出,導(dǎo)致蛋白含量降低。因此,選取時(shí)間為15 min為宜。

2.2.2 溫度對蛋白提取得率的影響 結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對蛋白得率的影響Fig.2 Influence of extracting temperature on the yield of protein

從圖2可以看出,當(dāng)溫度低于120 ℃,溫度越高,越有利于蛋白質(zhì)的溶出,但當(dāng)溫度高于120 ℃,蛋白提取得率開始下降,可能是因?yàn)辂溑叻壑械鞍踪|(zhì)變性和淀粉糊化所引起。蛋白質(zhì)變性會導(dǎo)致溶解度的降低,淀粉的糊化使原來的懸浮液變成了黏性很強(qiáng)的淀粉糊,阻礙了蛋白質(zhì)的溶出,從而降低了麥胚蛋白的提取得率。因此,選取提取溫度為120 ℃。

2.2.3 pH對蛋白提取得率的影響 結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對蛋白得率的影響Fig.3 Influence of pH on the yield of protein

從圖3可以看出,隨著pH的增大,麥胚蛋白的提取得率先增加后減少,在pH為9時(shí)蛋白提取得率最大,堿性過強(qiáng)會引起蛋白脫氨、脫酸、肽鍵斷裂等不良化學(xué)反應(yīng),使部分蛋白發(fā)生變性,導(dǎo)致蛋白得率下降。因此綜合考慮選擇提取的pH為9.0。

2.2.4 料水比對蛋白提取得率的影響 結(jié)果如圖4所示。

圖4 料水比對蛋白得率的影響Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on the yield of protein

從圖4可以看出,隨著料水比的增加,蛋白提取率逐漸增大,當(dāng)料水比為1∶20 g/mL時(shí),達(dá)到最大值,之后隨著料水比的增加,提取得率基本不變?？紤]到料水比過大,會降低固形物的含量,不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。因此,選取料水比為1∶20 g/mL。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析

2.3.1 回歸方程的模型建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表3通過Design-Expert 7.1.3統(tǒng)計(jì)分析軟件對所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,建立響應(yīng)面的回歸模型,進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)值的因素水平。從表4中可以得出X1X4和X3X4不顯著,其它項(xiàng)均顯著。去除非顯著項(xiàng),確定回歸模型方程為:Y(%)=41.66+2.03X1+2.98X2+1.48X3-1.36X4-1.36X1X2-1.43X1X3+0.7X1X4+1.05X2X3-1.50X2X4-0.85X3X4-3.54X12-4.30X22-2.87X32-2.41X42。從表4中可以看出模型的p值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01,這說明Quadratic模型是高度顯著的,同時(shí)軟件還計(jì)算出,失擬誤差不顯著,回歸方程的決定系R2為0.9747,這說明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有良好的擬合性。從表4中可知,模型的一次項(xiàng)X1、X2、X3和X4,二次項(xiàng)X12、X22、X32及X42,交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3和X2X4均顯著。這說明響應(yīng)值的變化十分復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,而是呈二次關(guān)系。各因素對麥胚蛋白提取得率大小的影響依次為萃取溫度(X2)>萃取時(shí)間(X1)>pH(X3)>料水比(X4)。

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果
Table 3 The plan and results for response surface methodology

實(shí)驗(yàn)號X1X2X3X4提取得率(%)1-100-136552001136073-1-100269940-10-1319750000419760-1-1032367101038018-11003708900004101101-100329511-10013193120-101320313001-13975141001369515-10-1029261601-1035221700004108180-11032331900004127200000429521010-1404922100-138792301103941241100375925-101035562600-1-134682710-10374328010134572900-113439

表4 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)
Table 4 Significance test of each regression coefficient

方差來源平方和自由度均方F值p值顯著性X14941149415921<00001??X21063911063912749<00001??X32637126373160<00001??X4221112211265000001??X1X2743174389000099??X1X3818181898000074??X1X4193119323201504X2X3445144553400367?X2X48941894107100056??X3X4287128734400847X128129181299741<00001??X221200811200814390<00001??X325334153346392<00001??X423752137524496<00001??

注:*顯著性水平5%;**顯著性水平1%。

表5 回歸模型方差分析
Table 5 Analysis of variance for the fitted regression model

變異來源平方和自由度均方F值p值模型432.421430.8937.01<0.0001殘差11.68140.83失擬項(xiàng)9.01100.91.350.4147純誤差2.6740.67總和444.1028復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9737

2.3.2 響應(yīng)面曲面和等高線分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對應(yīng)于實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖[31]。響應(yīng)面圖形可以直觀地反映各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。

圖5(a)顯示溫度和時(shí)間的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)時(shí)間固定不變時(shí),隨著溫度的增加蛋白提取得率先增加后減少,可能是由于溫度的升高,物料內(nèi)部分子的動能增加,蛋白質(zhì)分子與水分子間的氫鍵形成更多的緣故,有利于蛋白質(zhì)的溶出。當(dāng)溫度過高時(shí),使物料體系中淀粉開始部分糊化,增加了料液的粘度,不利于蛋白的溶出,從而使蛋白得率下降。當(dāng)溫度不變時(shí),隨著時(shí)間的增加蛋白的提取得率先增加后趨于穩(wěn)定。

圖5(b)顯示pH和萃取時(shí)間的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)時(shí)間固定不變時(shí),隨著pH的增加蛋白提取得率逐漸升高并可達(dá)到最大值,當(dāng)pH繼續(xù)增加時(shí)蛋白的率稍微下降,由此得出,在一定pH和時(shí)間條件下,可使蛋白提取得率達(dá)到最大。當(dāng)pH固定不變時(shí),隨著時(shí)間的增加蛋白提取得率逐漸增加然后趨于穩(wěn)定。

圖5(c)顯示料水比和萃取時(shí)間的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)料水比固定不變時(shí),隨著時(shí)間的增加蛋白提取得率先增加后稍微降低。當(dāng)時(shí)間固定不變時(shí),隨著料水比的增加,蛋白提取得率逐漸增大。

圖5(d)顯示pH和溫度的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)pH固定不變時(shí),隨著溫度的增加蛋白的提取得率先增加后減少。當(dāng)溫度固定不變時(shí),隨著pH的增加蛋白提取得率先增加后稍微降低。

圖5(e)顯示料水比和溫度的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)料水比固定不變時(shí),隨著溫度的增加,蛋白提取得率逐漸增大,達(dá)到最大后趨于穩(wěn)定。當(dāng)溫度固定不變時(shí),隨著料水比的增加,蛋白提取得率先增加后減少。

圖5(f)顯示料水比和pH的交互作用對蛋白提取得率的影響。當(dāng)pH固定不變時(shí),隨著料水比的逐漸增加,蛋白提取得率逐漸增加然后稍微降低。當(dāng)料水比固定不變時(shí),隨著pH的增加,蛋白提取得率逐漸增大。

圖5 各兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction between the two factors

2.3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 為表明模型的合適性和有效性,進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。通過響應(yīng)面分析得出最佳提取條件為:萃取溫度為129.40 ℃,萃取時(shí)間為14.35 min,料水液比為1∶20 g/mL,pH9.40。考慮到實(shí)際操作,將麥胚蛋白的提取條件修正為萃取溫度為130 ℃,萃取時(shí)間為15 min,料水比為1∶20 g/mL,pH9.4。在最佳條件下,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,麥胚蛋白提取得率實(shí)際值為42.25%±0.51%,接近模型預(yù)測值43.05%。而傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取得率僅為28.13%。因此,采用RSA法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有一定的實(shí)用價(jià)值,與傳統(tǒng)方法相比,在得率和時(shí)間上具有明顯優(yōu)勢。

2.4 麥胚蛋白的功能性質(zhì)

蛋白質(zhì)制品在食品工業(yè)的應(yīng)用性能取決于其功能特性,本實(shí)驗(yàn)對麥胚蛋白的溶解性、起泡性、乳化性、持水性、持油性進(jìn)行了研究,測定結(jié)果見表6,從表中可以看出,亞臨界水萃取得到的蛋白的功能特性優(yōu)于傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取的蛋白的功能特性。

表6 麥胚蛋白功能性質(zhì)
Table 6 Function characteristics of protein from Wheat germ

參數(shù)提取方法傳統(tǒng)堿溶酸沉亞臨界水萃取乳化活性(m2/g)1015111363乳化穩(wěn)定性(%)82278216起泡性(%)70027145泡沫穩(wěn)定性(%)35013605持水性(%)392421持油性(%)425449溶解度(%)56416093

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出亞臨界水萃取麥胚蛋白的最佳工藝條件為:萃取溫度為130 ℃,萃取時(shí)間為15 min,料水液比為1∶20 g/mL,pH為9.4。在最佳條件下,麥胚蛋白的萃取得率達(dá)42.25%,其蛋白的功能性質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取的蛋白。

亞臨界水萃取麥胚蛋白同堿溶酸沉法相比具有提取時(shí)間短、萃取效率高、易于操作等優(yōu)勢,是一種具有潛力的綠色提取技術(shù),具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the extraction of wheat germ protein by subcritical water and its functional properties

ZHANG Hai-hui,LI Chang-zheng,LUO Xiao-ping,DUAN Yu-qing*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

The extraction condition of wheat germ protein by subcritical water was optimized using single factor and response surface methodology and the functional characteristics of wheat germ protein were studied. The results showed that under the optimum extraction parameters obtained from response surface analysis,the yield of protein in the extracts was 42.25% at pH9.4,130 ℃for 15 min with the solid-liquid ratio of 1∶20 g/mL. In addition,the emulsion activity index of wheat germ protein extracted by subcritical water was 113.63 m2/g,and the emulsion stability indicator was 82.16%;the foamability and the foam stability were 71.45% and 36.05%,respectively;the water/oil absorption and the solubility were respectively 4.21%,4.49% and 60.93%. Compared with traditional alkaline-soluble acid precipitation method,subcritical water extracting wheat germ protein has obvious advantages in saving time,extraction yield.

wheat germ;protein;subcritical water extraction

2016-05-12

張海暉(1975-),男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:農(nóng)副產(chǎn)品活性因子提取分離,E-mail:zhanghh@mail.js.edu.cn。

*通訊作者:段玉清(1973-)，女，博士，教授，研究方向：藥食同源物有效成分、生物活性及其分子機(jī)制研究，E-mail:dyq101@mail.ujs.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31371734);江蘇大學(xué)人才基金(05JDG013,128300289)。

TS210.9

B

1002-0306(2016)23-0193-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.028