蔣樟麗,韓福霞,金澤霖,張 翼,高紅亮,常忠義,賈彩鳳

(上海市華東師范大學(xué)生命科學(xué)院,上海 200241)

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糞產(chǎn)堿桿菌AF01產(chǎn)可溶性胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

蔣樟麗,韓福霞,金澤霖,張 翼,高紅亮,常忠義,賈彩鳳*

(上海市華東師范大學(xué)生命科學(xué)院,上海 200241)

糞產(chǎn)堿桿菌(AlcaligenesFaecalis)AF 01產(chǎn)可溶性胞外多糖(EPS),本文采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖50 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏0.5 g/L,CaCO315 g/L;最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵時間4 d,初始pH7.0,接種量為2.5%,轉(zhuǎn)速200 r/min,溫度30 ℃。在此條件下,該菌株可溶性胞外多糖的產(chǎn)量有了極大的提高,達(dá)到10.8 g/L,為該胞外多糖的規(guī)模化生產(chǎn)提供了重要的參考。

糞產(chǎn)堿桿菌,可溶性胞外多糖,發(fā)酵優(yōu)化

胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的長鏈、高分子聚合物[1]。因其產(chǎn)糖周期短、自然因素干擾小、產(chǎn)品容易分離的生產(chǎn)優(yōu)勢,胞外多糖在工業(yè)上受到日益重視,已作為穩(wěn)定劑、膠凝劑、成膜劑、乳化劑等被廣泛應(yīng)用于食品、石油、制藥、化妝品等領(lǐng)域,具有廣闊的應(yīng)用前景。

早在1965年,科學(xué)家從糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵液中得到一種新的酸性可溶性多糖-琥珀酰多糖[2],該多糖是由D-葡萄糖和D-半乳糖組成的八糖重復(fù)單位,其中含有丙酮酸、乙酸及丁二酸取代基,分子量在6×106～1.5×107u之間[3]。隨后該多糖相繼被報導(dǎo)從黃桿菌屬[4]、放射性土壤桿菌[5-6]和其他糞產(chǎn)堿桿菌中[7]產(chǎn)生。由于該多糖具有酸性、且可溶于水的特性,已經(jīng)應(yīng)用于化妝保健[8]、醫(yī)藥[9-10]等領(lǐng)域。但目前國內(nèi)關(guān)于糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的可溶性胞外多糖生產(chǎn)方面的研究尚未有報導(dǎo),因此這種胞外多糖還具有巨大的探究空間。本文對糞產(chǎn)堿桿菌AF 01產(chǎn)可溶性的胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期對該多糖的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞產(chǎn)堿桿菌AF 01 由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保存。

斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,酵母膏5,CaCO310,瓊脂20,pH7.0。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母膏10,CaCO33,pH7.0[11]?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,NH4Cl 1.5,酵母膏1,CaCO35,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO41.71,KH2PO42.72,pH7.0[11]。所用試劑均為AR級 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電子天平,精密度為0.1 mg,梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;CR21N型立式離心機(jī) 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;DHG-9246A型烘箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DK-S24型恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 將兩環(huán)斜面種子接入30 mL種子培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,作為種子液。培養(yǎng)好的液體種子以5%接種量接入250 mL錐形瓶裝液30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵液的取樣處理 取發(fā)酵液,90 ℃水浴加熱3 min使蛋白變性凝結(jié),冷卻后,室溫 9000 r/min離心10 min,分離上清和沉淀備用。

1.2.3 胞外可溶性多糖產(chǎn)量的測定 取發(fā)酵液上清0.5 mL,通過苯酚-硫酸法[11]在OD490條件下進(jìn)行檢測。

1.2.4 菌體干重的測定 取發(fā)酵液沉淀,加入蒸餾水重懸,1000 r/min離心5 min,棄去沉淀CaCO3,菌體懸液9000 r/min離心5 min,用蒸餾水洗滌菌體沉淀,重復(fù)2次,將沉淀在80 ℃烘箱中烘干過夜至恒重[12]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先利用單因素實(shí)驗(yàn)篩選對糞產(chǎn)堿桿菌EPS產(chǎn)量影響顯著的因素,選擇影響顯著的因子進(jìn)行3水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 最佳碳源的選擇 分別以40 g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉和甘油替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,其它培養(yǎng)基成份不變,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)糞產(chǎn)堿桿菌AF 01 4d,用以考察碳源對可溶性EPS產(chǎn)量的影響。

然后基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60 g/L的蔗糖,培養(yǎng)4d后,檢測碳源濃度對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.2 最佳無機(jī)氮源的選擇 以優(yōu)選后的蔗糖為碳源,分別以1.5 g/L NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4H2PO4、KNO3、NH4NO3、草酸銨替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無機(jī)氮源,培養(yǎng)糞產(chǎn)堿桿菌4 d,考察無機(jī)氮源對EPS產(chǎn)量的影響。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 g/L的KNO3,培養(yǎng)4 d后,考察無機(jī)氮源濃度對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.3 酵母膏濃度對可溶性EPS產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別添加質(zhì)量濃度為0.5、1、3、5、7 g/L的酵母膏,發(fā)酵結(jié)束后,檢測酵母膏濃度對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.4 CaCO3添加量對可溶性EPS產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別添加質(zhì)量濃度為1、5、10、15、20 g/L的CaCO3,發(fā)酵結(jié)束后,檢測CaCO3添加量對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.5 pH、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速及發(fā)酵時間的優(yōu)化 選用優(yōu)化后的產(chǎn)糖培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。在接種量5%、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 的條件下培養(yǎng)4 d,測定發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH(5、6、7、8、9)對EPS 產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)基初始pH為7、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 的條件下培養(yǎng)4 d,測定接種量(1%、2.5%、5%、7.5%、10%)對EPS 產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)基初始pH7、接種量5%、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下培養(yǎng)4 d,測定發(fā)酵溫度(25、28、30、33、37 ℃)對EPS 產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)基初始pH為7、接種量5%、溫度30 ℃的條件下培養(yǎng)4 d,測定轉(zhuǎn)速(160、180、200、220 r/min)對EPS產(chǎn)量的影響。在pH7、接種量5%、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 的條件下培養(yǎng),測定發(fā)酵時長(1、2、3、4、5、6 d)對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)EPS的培養(yǎng)條件 通過以上一系列單因素實(shí)驗(yàn)探究,選擇對菌體產(chǎn)胞外多糖較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發(fā)酵溫度作為實(shí)驗(yàn)因子,分別以四個因素的最佳條件為參考各設(shè)置3個水平,進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)
Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal design

水平因素A蔗糖濃度(g/L)B酵母膏濃度(g/L)C接種量(%)D發(fā)酵溫度(℃)13005152524012530350153535

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)做3個平行,利用Excel和SPSS對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成份對可溶性EPS產(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源種類和濃度對EPS產(chǎn)量的影響 碳源作為細(xì)胞生長最重要的能量與營養(yǎng)來源,對EPS產(chǎn)生具有重要作用。所選擇的不同碳源對可溶性EPS產(chǎn)量的影響如圖1A所示,而蔗糖為碳源時EPS產(chǎn)量顯著高于其他碳源(p<0.05),達(dá)到5.90 g/L,因此我們選擇蔗糖為碳源做進(jìn)一步的研究。

圖1 碳源種類及濃度對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source type and concentration on soluble EPS yield

圖1B可知,隨著蔗糖濃度升高,菌體干重逐漸增加,EPS產(chǎn)量不斷提高,當(dāng)蔗糖濃度為40 g/L時,胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值,為6.57 g/L。隨著蔗糖濃度的進(jìn)一步升高,EPS產(chǎn)量稍有下降。其原因是蔗糖含量過低時,由于碳源被過早消耗,所以影響了胞外多糖的產(chǎn)生;蔗糖含量過高,會抑制菌體的生長和胞外多糖的合成產(chǎn)生,影響EPS的產(chǎn)量,這與王爽[13]等報道的結(jié)果一致,因此選用蔗糖濃度為40 g/L做進(jìn)一步的研究。

2.1.2 無機(jī)氮源種類和濃度對可溶性EPS產(chǎn)量的影響 由圖2A可知,糞產(chǎn)堿桿菌可以利用不同的無機(jī)氮源產(chǎn)生EPS,采用KNO3作為無機(jī)氮源時,EPS產(chǎn)量最高,達(dá)到6.04 g/L。因此選擇KNO3為最佳的無機(jī)氮源,進(jìn)行下一步的研究。

如圖2B所示,隨著無機(jī)氮源KNO3濃度的增加,菌體干重增多,但當(dāng)KNO3濃度超過1.5 g/L后,菌體干重?zé)o顯著性增加,說明過高的無機(jī)氮源限制了菌體的生長。當(dāng)KNO3質(zhì)量濃度較低時,隨著KNO3質(zhì)量濃度的增大,無機(jī)氮源供應(yīng)增多,EPS產(chǎn)量增加,當(dāng)KNO3質(zhì)量濃度為1.1 g/L時,EPS產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)。KNO3質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,產(chǎn)生的大量菌體要消耗更多的碳源來維持自身的生長和代謝,導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量相對下降。因此,1.1 g/L為KNO3最佳質(zhì)量濃度。

2.1.3 酵母膏濃度對EPS產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)基中加入少量酵母膏可以促進(jìn)菌體生長,其中的生長因子對發(fā)酵后期產(chǎn)物的合成也有一定的促進(jìn)作用[14]?；A(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的酵母膏對EPS產(chǎn)量的影響如圖3所示。

圖3 酵母膏濃度對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of yeast extract concentration on soluble EPS yield

由圖可知,酵母膏濃度為1 g/L時,菌體胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高,之后隨著酵母膏質(zhì)量濃度的增加,菌體干重繼續(xù)增多,但胞外多糖的產(chǎn)量逐漸降低,故酵母膏最佳質(zhì)量濃度為1 g/L。

2.1.4 最佳CaCO3添加量的確定 糞產(chǎn)堿桿菌在生長過程會使培養(yǎng)基pH降低,為了維持培養(yǎng)液的pH范圍,更利于菌體的生長,在培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量的CaCO3,結(jié)果如圖4所示。

圖4 CaCO3添加量對可溶性EPS產(chǎn)量的影響 Fig.4 Effect of CaCO3 concentration on soluble EPS yield

隨著CaCO3濃度的增高,菌體干重不斷增加,EPS產(chǎn)量逐漸上升。原因可能是菌體代謝產(chǎn)生了酸性環(huán)境,而CaCO3的添加抑制了酸性環(huán)境對菌體生長的影響。當(dāng)CaCO3的添加量為15 g/L時,菌體胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值,隨著CaCO3添加量繼續(xù)增加,胞外多糖產(chǎn)量會略有下降,故CaCO3的最佳添加量應(yīng)該為15 g/L。

2.2 培養(yǎng)條件對EPS產(chǎn)量的影響

2.2.1 發(fā)酵時長對EPS產(chǎn)量的影響 以蔗糖作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,其余培養(yǎng)基成份不變,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),探究發(fā)酵時長對EPS產(chǎn)量影響的結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時間對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of culture time on soluble EPS yield

隨著培養(yǎng)時間的延長,EPS的產(chǎn)量緩慢上升,到第4 d達(dá)到最高值5.44 g/L,之后逐漸下降。這是由于培養(yǎng)前期隨著菌體的生長,菌體代謝所產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加,而第4 d后,培養(yǎng)基中碳源不足,菌體轉(zhuǎn)而利用自身所產(chǎn)多糖作為碳源維持自身代謝及繁殖[15]。因此發(fā)酵時長4 d為最佳培養(yǎng)時間。

2.2.2 菌液接種量對EPS產(chǎn)量的影響 接種量直接影響發(fā)酵液內(nèi)的最初活菌數(shù),從而影響菌體的生長以及EPS 的生物合成。如圖6所示,菌體干重隨著接種量的增大而增加,而胞外多糖產(chǎn)量出現(xiàn)先增多后下降的趨勢。接種量過少,菌體需更多時間繁殖,從而延遲了多糖的產(chǎn)生;接種量過多,菌體間競爭過于激烈,且需要更多碳源維持大量菌體生長,使其產(chǎn)糖受到抑制。故選擇2.5%作為產(chǎn)EPS的最適接種量,這一結(jié)果與蹇華麗等[16]的報道一致。

圖6 接種量對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on soluble EPS yield

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH對EPS產(chǎn)量的影響 pH能改變微生物的相關(guān)酶活性與菌體代謝途徑,因此微生物的生長及代謝產(chǎn)物的合成受到培養(yǎng)基pH的影響。如圖7所示,初始pH偏低或偏高,會影響菌體的生長,同時影響EPS的生成。培養(yǎng)基初始pH為7.0時菌體干重達(dá)到最高值,EPS產(chǎn)量也達(dá)到最高點(diǎn)。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of initial pH on soluble EPS yield

2.2.4 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響 如圖8所示,發(fā)酵溫度為28～30 ℃時,EPS產(chǎn)量較高且菌體干重也較多。當(dāng)溫度較低時,菌體生長、代謝緩慢,EPS產(chǎn)生受到影響;溫度較高時,會影響到菌體內(nèi)酶的活性,從而影響菌體的生長代謝及EPS的產(chǎn)生。

圖8 發(fā)酵溫度對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on soluble EPS yield

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對可溶性EPS產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of rotation speed on soluble EPS yield

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對EPS產(chǎn)量的影響 糞產(chǎn)堿桿菌是好氧菌,搖床轉(zhuǎn)速會影響供氧量,從而使菌體的生長代謝及其產(chǎn)物的合成受到影響。如圖9所示,搖床轉(zhuǎn)速過低,會導(dǎo)致供氧不足,菌體會生長緩慢,EPS產(chǎn)量較低;搖床轉(zhuǎn)速過高,培養(yǎng)基溶氧量過高,細(xì)胞呼吸、代謝旺盛,會使其過早衰亡,從而導(dǎo)致菌體對碳源等物質(zhì)的利用及產(chǎn)物的合成受到影響,EPS產(chǎn)量下降。因此,最佳搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)置為200 r/min。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)條件

通過單因素實(shí)驗(yàn),初步確定組成如下的最佳培養(yǎng)基配方:蔗糖40 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏1 g/L,CaCO315 g/L;最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件:菌液接種量2.5%,初始pH7.0,發(fā)酵溫度30 ℃,搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min。

選擇對產(chǎn)EPS影響較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發(fā)酵溫度作為實(shí)驗(yàn)因子,分別以四個因子的最佳條件為參考各設(shè)置3個水平,進(jìn)行L9(34)對產(chǎn)EPS發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知,4個因素對糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)EPS影響的大小順序?yàn)?蔗糖>酵母膏>發(fā)酵溫度>菌液接種量。綜合比較各因素不同水平胞外多糖產(chǎn)量,最終確定該四因素最佳組合條件:蔗糖50 g/L,酵母膏0.5 g/L,菌液接種量2.5%,發(fā)酵溫度30 ℃。按照該條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的EPS的平均值為10.8 g/L,顯著提高了EPS的產(chǎn)量。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)和結(jié)果分析
Table 2 The orthogonal design scheme and result analysis

實(shí)驗(yàn)號ABCD胞外多糖產(chǎn)量(g/L)1111145962122233223133310714212370135223149426231264447313210753832133308933218462k12996745447836000k26133385762666840k37508532655893797R4512359714833043因素主次排序1243

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn),從培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件探討了糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)EPS的最佳條件,然后在此基礎(chǔ)上,選擇對EPS產(chǎn)量影響較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發(fā)酵溫度,進(jìn)行了L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。最終得到的最優(yōu)化培養(yǎng)條件為:蔗糖50 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏0.5 g/L,CaCO315 g/L,MgSO4·7H2O 0. 5 g/L,KH2PO42. 72 g/L,K2HPO41.71 g/L;發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為:發(fā)酵時間4 d,菌液接種量2.5%,培養(yǎng)基初始pH7.0,發(fā)酵溫度30 ℃,搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min。在此最優(yōu)方案下,糞產(chǎn)堿桿菌AF 01胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到10.8 g/L。

因此,優(yōu)化得到最優(yōu)糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件真實(shí)可靠,具有實(shí)際意義,對今后該多糖的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions for soluble extracellular polysaccharide production by Alcaligenes Faecalis AF 01

JIANG Zhang-li,HAN Fu-xia,JIN Ze-lin,ZHANG Yi,GAO Hong-liang,CHANG Zhong-yi,JIA Cai-feng*

(School of Life Sciences,East China Normal University,Shanghai 200241 China)

For the production of exopolysaccharide(EPS)fromAlcaligenesFaecalisAF01,single-factor test and orthogonal experimental design were employed to optimize the fermentation conditions. The results showed that the optimal medium components were consisted of 50 g/L sucrose,1.1 g/L KNO3,0.5 g/L yeast extract and 15 g/L CaCO3. The optimal fermentation conditions were incubation time of 4 d,the initial pH of 7.0,2.5% inoculum amount,shaking speed of 200 r/min and culture temperature of 30 ℃.Under the optimized conditions,the yield of the soluble extracellular polysaccharide was significantly improved and a maximum EPS yield of 10.8 g/L was achieved. The optimized medium and our results provided some important data for commercial production of this polysaccharide.

Alcaligenesfaecalis;soluble extracellular polysaccharide;fermentation condition optimization

2016-06-24

蔣樟麗(1994-),女,在讀本科,研究方向：食品微生物，E-mail：zljiang1994@163.com。

*通訊作者:賈彩鳳(1979-),女,博士,高級實(shí)驗(yàn)師,研究方向:食品微生物,E-mail:cfjia@bio.ecnu.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)23-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.023