李秋瑩, 張 杰, 姚建亭 王秀良 段德麟

(1. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室實驗海洋生物學與生物技術實驗室, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

海帶轉錄組SSR序列特征及其相關基因功能分析

李秋瑩1,2,3, 張 杰1,2,3, 姚建亭1,2, 王秀良1,2, 段德麟1,2

(1. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室實驗海洋生物學與生物技術實驗室, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

對海帶(Saccharina japonica)轉錄組測序數據進行分析, 從70 497條Unigenes中共檢測到9 237個簡單序列重復(SSR)位點, 并對包含SSR序列的Unigenes進行功能注釋。海帶轉錄組中SSR的類型十分豐富, 其中單核苷酸和三核苷酸重復SSR的數量最多, 分別占SSR總數的40.9%和39.4%, 其次為四核苷酸、二核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復, 分別占SSR總數的9.8%, 6.1%, 3.1%和0.7%。SSR重復單元類型共有147種, 其重復次數的范圍為5～70次。功能注釋發(fā)現約50%含有SSR的Unigenes獲得了注釋信息, 并且大多數與已知蛋白有同源性。COG、GO功能分類結果均表明, 大量含有SSR序列的基因與多種生物功能有關, 其中與碳水化合物代謝及參與細胞組成相關的基因數量最多。本研究結果為深入開發(fā)功能性SSR標記奠定基礎, 也為開展海帶分子標記輔助選育提供支持。

微衛(wèi)星; 轉錄組; 簡單序列重復(SSR); 海帶(Saccharina japonica)

海帶(Saccharina japonica)是中國重要的養(yǎng)殖海藻之一, 廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。全球海帶養(yǎng)殖主要集中在中國、日本和韓國。中國作為海帶養(yǎng)殖大國, 年產海帶近500萬t, 占全球海帶產量的86%左右[1]。海帶的重要性狀均為典型的數量性狀[2], 其遺傳機制十分復雜。海帶重要性狀的分子遺傳解析有賴于有效的分子標記的開發(fā)。近年來, 許多研究應用AFLP、RAPD、SSR等分子標記, 對海帶進行種群遺傳、數量性狀作圖等研究[2-6]。

相比于顯性標記, 共顯性的簡單序列重復(Simple sequence repeat, SSR)標記(也稱為微衛(wèi)星標記)具有共顯性、多等位, 變異高等優(yōu)點, 在基因組中分布廣泛, 常被應用于群體遺傳分析、遺傳連鎖圖譜構建、QTL作圖等研究[7]。海帶中運用SSR標記進行遺傳研究的報道較少。Liu等[8]通過EST數據開發(fā)了15個海帶EST-SSR并成功應用到QTL作圖和海帶群體遺傳多樣性分析中。由于受全基因組序列信息缺乏的限制, 海帶中尚未開展高通量SSR標記的開發(fā), 海帶中開發(fā)的可用SSR標記還十分有限[8-11]。因此, 開發(fā)更多可用的SSR標記對海帶的遺傳研究具有重要意義。以往常用富集文庫法和從數據庫中已知的EST序列開發(fā)SSR, 但這些方法均耗時、費力, 且效率低。高通量測序的不斷增加為SSR的開發(fā)提供了豐富資源, 如轉錄組和基因組的測序數據。SSR根據其開發(fā)來源的不同可以分為: 基因組SSR (genomic SSR)和轉錄組SSR(genic SSR)?；蚪MSSR常比轉錄組SSR更易呈現出多態(tài)性, 而轉錄組SSR比基因組的SSR更易與表型性狀相關聯(lián)[12]。

本文基于海帶轉錄組數據, 對其SSR的組成和分布特征進行分析, 并對含有SSR序列的Unigenes進行功能注釋與分類, 為從海帶中開發(fā)具有功能的SSR標記并應用于數量性狀遺傳解析及分子標記輔助選育提供有利資源。

1 材料與方法

1.1 海帶轉錄組中SSR序列的分析

實驗數據來源于本實驗室分別對黑暗處理和藍光誘導下海帶幼孢子體的轉錄組測序數據[13]。使用MISA腳本工具(http: //pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對兩個轉錄組一共得到的70 497條非冗余Unigenes (總長度為37 895 389 bp)進行了SSR序列的篩選。篩選條件為單核苷酸重復次數至少15次, 二核苷酸重復次數至少8次, 三核苷酸重復次數至少6次,四、五、六核苷酸重復次數至少5次, 復合型SSR的中間間隔小于10 bp。利用Primer3 version 4.0(http: // frodo.wi.mit.edu/primer3)對SSR進行引物設計。

1.2 含有SSR序列的Unigene的功能分析

使用Blastall程序分別將含有SSR序列的Unigene比對到Nr蛋白數據庫、Swiss-Prot數據庫、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數據庫和Cluster of Orthologous Groups (COG) 數據庫(E-value ＜1e-5)。使用Blast2go 和WEGO軟件分別對Unigenes進行Gene ontology (GO) 注釋信息分析和功能分類[14-15]。含有單核苷酸序列的Unigenes未進行功能分析。

2 結果

2.1 SSR序列的分布

利用MISA腳本工具在海帶轉錄組70 497條Unigenes中檢測到9 237個SSR位點。在檢測的Unigenes中包含SSR的Unigenes共7 725條, 其中1 238條包含2個或2個以上的SSR位點。在檢測到的SSR位點中, 185個位點以復合形式存在。海帶轉錄組中SSR的平均分布頻率為每4.1 kbp一個SSR位點。SSR類型分析顯示其類型十分豐富, 且各種類型分布頻率不均衡。單核苷酸和三核苷酸重復的SSR類型數量最多、所占比例最大, 分別為3 781個(40.9%)和3 642個(39.4%), 共占SSR總數的80.3%。而二、四、五和六核苷酸重復類型共占SSR總數的19.7%, 其數目和所占的比例分別為568(6.1%)、901(9.8%)、282(3.1%)、63(0.7%)。

一個SSR位點的重復次數是可變的, 這也是SSR呈現多態(tài)的主要原因。由于篩選條件的原因, 海帶轉錄組SSR最小重復次數為5, 最大的重復次數為70,重復6次的SSR位點最多, 占總數的20.6%(1 901個) (圖1)。以二、四、五和六核苷酸為重復單元的SSR重復次數主要集中在5～14次。長度超過20 bp的SSR序列共3 032個。二、四、五和六核苷酸重復單元的最大重復次數分別為70(GA)、40(ACA)、44(TAGA)、13(AAGCA)和10(CATCAC)。

2.2 SSR重復單元類型

本研究中, 海帶轉錄組SSR重復單元的類型共有147, 其中將互補的序列歸為一種類型。擁有重復單元類型最多的是五核苷酸重復(64種, 圖2)。二核苷酸最豐富的重復單元類型為AG/CT型(53%), 而CG/GC類型最少, 在二核苷酸重復類型總數中所占比例不足1%(圖3)。在三核苷酸重復單元中, AGC/CTG重復所占比例高達46%, 其次為ACC/GGT(14%) (圖3)。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元類型較多, 所占比例較低, 有的類型僅出現1次。除單核苷酸重復外, 在所有重復單元類型中出現頻率最多的是AGC/CTG。

圖1 海帶轉錄組不同重復次數的SSR數量變化Fig. 1 Variations in SSR for different repeat times in the Saccharina japonica transcriptome

圖2 海帶轉錄組不同核苷酸類型SSR含有的重復單元類型數目Fig. 2 Number of repeat motif types in different SSR types in the Saccharina japonica transcriptome

圖3 海帶轉錄組中二核苷酸和三核苷酸SSR的不同重復單元的比例Fig. 3 Proportion of different motifs in dinucleotide and thrinucleotide SSRs of the Saccharina japonica transcriptome

2.3 SSR相關Unigene的功能注釋與分類

為了解所獲得的SSR序列可能的生物學功能,我們對含有SSR序列的Unigene (共4 728條)進行了功能注釋分析(單核苷酸除外)。同源比對分析結果表明2 240條(47.4%), 1 835條(38.8%), 1 384條(29.3%)和1 072條(22.7%)Unigenes分別與Nr、Swissport、KEGG和COG數據庫中的已知序列具有高度同源性,其中2 842個SSR位于的2 366條(50.0%)Unigenes與至少一個數據庫的蛋白序列具有高度同源性。大部分Unigenes與已知蛋白具有同源性, 464條與假定蛋白或未知蛋白具有較高同源性。

通過COG功能分類對這些注釋的Unigenes進行功能歸類。3 967條Unigene共歸為24類(A: RNA加工和修飾; B: 染色質結構和動態(tài); C: 能量生產和轉換; D: 細胞周期調控, 細胞分裂, 染色體分裂; E: 氨基酸運輸和代謝; F: 核苷酸運輸和代謝; G: 碳水化合物運輸和代謝; H: 輔酶運輸和代謝; I: 脂質運輸和代謝; J: 翻譯, 核糖體結構和生物合成; K: 轉錄; L: 復制, 重組和修復; M: 細胞壁/膜/胞外被膜; N: 細胞運動; O: 翻譯后修飾, 蛋白質折疊, 分子伴侶; P: 無機鹽運輸和代謝; Q: 次生代謝物的生物合成, 運輸和分解代謝; R: 一般功能預測; S: 未知功能; T: 信號轉導機制; U: 細胞內運輸, 分泌和膜泡運輸; V: 防御機制; W: 細胞外結構; Z: 細胞骨架)(圖4), 其中“一般功能預測”是最大一類(占COG注釋的Unigene總數的12.0%),其次是“碳水化合物運輸和代謝”(9.3%)和“細胞壁/膜/胞外被膜”(9.2%); “細胞外結構”(0.2%)是最小的一類(圖4)。可以看出含有SSR序列的這些基因功能豐富多樣。GO分類分析將3 366個Unigenes分到3大類(生物學過程, 細胞組成, 分子功能)的31個功能類群中(圖5)。其中, “細胞”、“細胞組分”、 “催化活性”以及 “代謝過程”是最大的幾個功能類群。

圖4 海帶轉錄組包含SSR序列的Unigene COG功能分類Fig. 4 COG functional classification of the unigenes containing SSR in the transcriptome of Saccharina japonica

3 討論

3.1 海帶轉錄組SSR序列特征

基于已知序列開發(fā)SSR標記是SSR標記開發(fā)最直接的、快捷的方法。目前已有多個物種通過對轉錄組數據的分析獲得了大量的SSR標記[16-18]。我們的研究發(fā)現海帶轉錄組中SSR標記資源也十分豐富,在70 497條Unigenes中共檢測出9 237個SSR位點,包含各種核苷酸重復類型。在檢測的SSR類型中, 單核苷酸重復類型是最多的, 但是由于轉錄組與基因組不同, 許多單核苷酸重復是由RNA聚合酶添加的polyA結構, 而不是存在于基因組DNA中的SSR,因此, 在做后續(xù)分析的時候并未對單核苷酸重復進行分析[19]。除了單核苷酸重復的SSR外, 最豐富的重復類型是三核苷酸重復, 這與Zhang等人[11]的研究結果一致。與高等植物相似, 海帶中AT/TA重復是二堿基中較豐富的重復單元, 而CG/GC是最少的[7]。SSR重復次數的不同是引發(fā)其長度多態(tài)性的主要原因, 其突變機制主要有DNA聚合酶滑移錯配、不平等重組、錯配和逆轉錄轉座[7]。而且SSR重復次數越多通常多態(tài)性也越高[20]。海帶轉錄組中發(fā)現的SSR序列的重復次數較高, 最多重復次數為70。因此, 我們認為這些SSR具有高多態(tài)的潛力, 可在種群遺傳多樣性和種群結構研究中發(fā)揮重要作用。

圖5 海帶轉錄組包含SSR序列的Unigene GO功能分類Fig. 5 GO functional classification of the unigenes containing SSR in the transcriptome of Saccharina japonica

3.2 海帶SSR序列相關功能分析

海帶轉錄組中SSR序列所在Unigenes的功能注釋結果表明, 約50%的含有SSR的Unigenes具有注釋信息, 并且大多數與已知蛋白具有高度同源性。COG、GO功能分類結果均表明, 大量的SSR序列分布在與碳水化合物代謝及細胞組成相關的基因中。其中一些基因可能與海帶中重要的多糖, 甘露醇、褐藻膠和巖藻多糖的合成積累相關, 因為它們分別是海帶中重要的儲存多糖及細胞壁組成成分[21]。我們選取了含有SSR的幾個參與淀粉和蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝的重要基因進行了引物設計(表1), 以便于后續(xù)應用研究。分布于這些基因中的SSR變異可能會與海帶中這些多糖的合成和積累有關。并且碳水化合物代謝作為基礎能量代謝, 與海帶其他性狀形成也相關。因此, 研究這些功能性SSR標記可為海帶中相關多糖積累及細胞壁形成研究提供支撐, 也為將來海帶的分子標記輔助選育提供依據。

4 結論

利用已知的海帶轉錄組數據開發(fā)海帶SSR標記是較為直接、快捷的方法。海帶轉錄組中的SSR類型豐富且重復次數較高, 具有較高的多態(tài)性潛能,是開發(fā)新的SSR標記的重要資源。海帶轉錄組中大量含有SSR序列的基因參與多種生物功能, 其中參與基礎的碳水化合物代謝的基因最多, 這些功能性SSR標記更易于進行性狀關聯(lián)研究。因此, 本研究為進一步開發(fā)海帶SSR標記奠定了基礎, 對于后續(xù)海帶遺傳資源評價、遺傳圖譜繪制、分子標記輔助選育等研究具有重要意義。

表1 海帶中參與多糖代謝部分基因相關SSR及引物Tab. 1 SSR in the genes involved in carbohydrate metabolism and primer information in Saccharian japonica

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Received: Feb. 6, 2015

Characterization of SSR in Saccharina japonica transcriptome and functional analysis of SSR-containing unigenes

LI Qiu-ying1,2,3, ZHANG Jie1,2,3, YAO Jian-ting1,2, WANG Xiu-liang1,2, DUAN De-lin1,2
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

microsatellite; transcriptome; simple sequence repeat (SSR); Saccharina japonica

In this study, we identified a total of 9 237 SSR (simple sequence repeat) loci in 70 497 unigenes from the transcriptome data of Saccharina japonica and conducted a function analysis of unigenes containing SSR. SSRs were abundant in the transcriptome of S. japonica, and the most commonly repeating motifs were mononucleotides and trinucleotides (40.9% and 39.4% of the total SSRs, respectively), followed by tetranucleotides, dinucleotides, pentanucleotides, and hexanucleotides (9.8%, 6.1%, 3.1%, and 0.7% of the total SSRs, respectively). There were 147 repeated motif types ranging from 5 to 70 repetitions. Our analysis of the functional annotation revealed that nearly 50% of the unigenes containing SSRs contain annotation information and that most of them are homologous to known proteins. Our clusters of orthologous group (COG) classification and gene ontology (GO) assignment results indicate that genes containing SSR are involved in various biological functions, of which carbohydrate metabolism and cell components are the top two. These SSRs provide new resources for further developing functional SSR markers, which can play important roles in molecular marker-assisted selection while breeding S. japonica.

S917.3

A

1000-3096(2016)11-0001-06

10.11759/hykx20150206001

(本文編輯: 劉珊珊)

2015-02-06;

2015-03-17

國家自然科學基金項目(31272660); 國家科技支撐計劃項目(2013BAB01B01); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201405040)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 31272660; National Key Technology Research and Development Program, No. 2013BAB01B01; Ocean Public Welfare Scientific Research Project, No. 201405040]

李秋瑩(1986-), 女, 遼寧錦州人, 博士研究生, 研究方向為海藻遺傳, 電話: 0532-82898554, E-mail: liqiuying21@163.com; 段德麟, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898556, E-mail: dlduan@qdio.ac.cn;王秀良, 通信作者, 副研究員, 電話: 0532-82898554, E-mail: xlwang@ qdio.ac.cn