印 琳，劉 芳，郭長城，王 瓊，楊 杰，潘 科，潘 晨，熊 妍，陳穎婷，方 文，陳崢宏

胃黏膜組織中惡臭假單胞菌臨床意義的探討

印 琳1，2，劉 芳2，郭長城2，王 瓊2，楊 杰3，潘 科4，潘 晨3，熊 妍5，陳穎婷3，方 文1，陳崢宏2

目的 探索惡臭假單胞菌在幽門螺桿菌感染相關胃腸疾病中的意義。方法采集14C尿素呼氣試驗陽性患者病變胃黏膜354例，進行細菌的分離培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、尿素酶試驗及幽門螺桿菌特異性16S rRNA基因片段的PCR進行幽門螺桿菌的鑒定，同時提取胃黏膜組織DNA，通過幽門螺桿菌特異性PCR進行快速診斷。將非幽門螺桿菌轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，進行快速尿素酶試驗。尿素酶陽性的非幽門螺桿菌染色體DNA利用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增、測序及序列比對。使用全自動細菌鑒定儀對經(jīng)測序比對為惡臭假單胞菌的菌株進行鑒定。采用K-B紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。結果從354例樣本中分離出革蘭陰性、尿素酶陽性的惡臭假單胞菌10株，經(jīng)16S rRNA基因測序和序列比對，與GenBank中惡臭假單胞菌的相似性≥98%。10株惡臭假單胞菌的胃黏膜標本中，6例標本幽門螺桿菌特異性PCR為陽性，4例為陰性。傳代存活的7株惡臭假單胞菌的K-B法藥物敏感試驗顯示對左氧氟沙星均敏感，1株對四環(huán)素敏感， 5株對阿莫西林耐藥，6株對克拉霉素耐藥，7株對甲硝唑、氨芐青霉素均耐藥。7株菌經(jīng)全自動細菌生化鑒定儀鑒定結果均為惡臭假單胞菌。結論病變胃黏膜中分離出尿素酶陽性且對治療幽門螺桿菌感染的多種抗生素耐藥；可能造成臨床上14C-尿素呼氣試驗假陽性，并繼發(fā)感染影響胃腸疾病的進展。

惡臭假單胞菌；培養(yǎng)；尿素酶；16S rRNA；耐藥性

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)是一種革蘭陰性桿菌，有些菌株為卵圓形，單端叢毛菌，運動活潑。惡臭假單胞菌為魚的一種致病菌，常從腐敗的魚中檢出，可作為人類咽部的正常菌群，是人類少見的條件致病菌，偶從人類尿道感染、皮膚感染和骨髓炎標本中分離出[1]。

Yoshino Y等報道，惡臭假單胞菌是一種低毒機會性致病原，原發(fā)性感染可致免疫功能低下和使用醫(yī)療設備(或?qū)蚬?病人的院內(nèi)感染[2-3]。Souza Dias MB等報道，因輸血或輸液感染暴發(fā)惡臭假單胞菌菌血癥[4]。研究報道肺炎、扁桃體炎、導管相關性血源性感染、急性膽囊炎和膽管炎、血栓性靜脈炎和皮膚軟組織炎癥(SSTI)等可致惡臭假單胞菌菌血癥[5-7]，甚至引發(fā)多器官衰竭并導致死亡[5]。

我們在對胃、十二指腸患者病變胃黏膜進行幽門螺桿菌(H.pylori)分離培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，病變胃黏膜中存在對治療幽門螺桿菌的抗生素耐藥，并且是尿素酶陽性的非幽門螺桿菌，經(jīng)細菌16S rRNA基因的PCR及測序確定為惡臭假單胞菌，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 病變胃黏膜來源于2015年3月至2015年12月，因上消化道不適癥狀就診于貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院、貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院、貴陽市兒童醫(yī)院、黔南布依族苗族自治州人民醫(yī)院內(nèi)鏡室，14C-尿素呼氣試驗陽性、胃鏡檢查有病變的患者354例。患者術前6～8 h禁飲禁食，手術用的胃鏡經(jīng)過嚴格洗滌消毒處理。無痛胃鏡狀態(tài)下，對于內(nèi)窺鏡下觀察有病變的胃黏膜，使用一次性活檢鉗采集病灶旁組織1塊。標本采集取得病人知情同意，實驗方案通過貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(上海博微生物科技有限公司)；MH瓊脂培養(yǎng)基(杭州濱和微生物試劑有限公司)；選擇性培養(yǎng)基：MH血瓊脂培養(yǎng)基(含10%無菌脫纖維羊血和幽門螺桿菌選擇性添加劑[英國，OXOID，含萬古霉素5.0 mg，頭孢磺啶2.5 mg，甲氧芐氨嘧啶2.5 mg，兩性霉素B 2.5 mg])。

1.1.3 其他材料：微需氧產(chǎn)氣袋(日本，三菱化學株式會社)、快速尿素酶試紙(珠海市克迪科技開發(fā)有限公司)、革蘭染色液(青島海博生物技術有限公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)、血液組織細胞基因組DNA提取試劑盒和DNA Marker Ⅶ(北京天根生化科技有限公司)、細菌16S rRNA基因通用引物(27F;1492R)和幽門螺桿菌16S rRNA基因特異性引物(上海英駿生物技術有限公司合成)。藥敏紙片(購自杭州濱和微生物試劑有限公司)：阿莫西林；克拉霉素；甲硝唑；左氧氟沙星；四環(huán)素；氨芐青霉素。高速臺式離心機TGL-16B(上海安亭科學儀器廠)；數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱303AB-4型(武漢精華科教儀器有限公司)；PCR擴增儀(杭州晶格科學儀器有限公司)。貴州省人民醫(yī)院中心實驗室BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 惡臭假單胞菌的分離和鑒定 354例疑為幽門螺桿菌感染的胃黏膜樣本參考文獻[8]進行幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、尿素酶試驗以及幽門螺桿菌特異性16S rRNA基因片段的PCR進行鑒定，區(qū)分幽門螺桿菌和非幽門螺桿菌。將非幽門螺桿菌轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃需養(yǎng)培養(yǎng)18～24 h后，以尿素酶試紙進行快速尿素酶試驗。

取尿素酶陽性的細菌單菌落以細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌染色體DNA，利用細菌16S rRNA基因的通用引物(27F；1492R)[9]進行PCR擴增，純化的PCR產(chǎn)物由生工生物工程上海有限公司(Sangon Biotech)采用Sanger法進行測序，測序結果在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行序列比對，以鑒定菌種。

1.2.2 病變組織中幽門螺桿菌16S rRNA基因片段的PCR擴增：將100 μL患者病變黏膜組織懸液用DNA提取試劑盒提取組織及組織中細菌的DNA，通過幽門螺桿菌特異性16S rRNA 基因片段PCR進行幽門螺桿菌感染的快速診斷[10]。

1.2.3 藥物敏感性試驗 參照WHO推薦的K-B紙片擴散法，測定經(jīng)16S rRNA基因序列比對鑒定為惡臭假單胞菌的單菌落培養(yǎng)物對甲硝唑(5 μg/片)、氨芐青霉素(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、克拉霉素(15 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)6種藥物的藥物敏感性。0.85%生理鹽水制備0.5麥氏單位菌懸液，吸取100 μL菌懸液均勻涂布于MH平板表面，無菌操作將藥敏紙片貼于瓊脂平板上。37 ℃培養(yǎng)18～24 h后測量藥敏紙片抑菌圈直徑。藥敏試驗依據(jù)美國CLSI《抗菌藥物敏感性試驗指南》標準進行結果判斷[11]。

1.2.4 惡臭假單胞菌的全自動生化鑒定 將復蘇成功的經(jīng)NCBI序列比對為惡臭假單胞菌的7株菌送至貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，使用BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行細菌生化鑒定。

2 結 果

2.1 惡臭假單胞菌的分離和鑒定 從354例胃黏膜樣本中共分離獲得10株惡臭假單胞菌，為革蘭陰性桿菌(或球桿菌)，尿素酶試驗陽性。以細菌16S rRNA基因的通用引物進行PCR，10株菌的擴增產(chǎn)物均為1 465 bp(見圖1)，經(jīng)測序及序列比對，與數(shù)據(jù)庫中惡臭假單胞菌16S rRNA基因序列的一致性最高，均高于98%。該10例樣本幽門螺桿菌分離培養(yǎng)結果及臨床診斷見表1。

M: DNA markerⅦ；泳道1-10:10株分離自胃黏膜的惡臭假單胞菌PCR產(chǎn)物；泳道11: 陰性對照(ddH2O)；泳道12:陽性對照(H.pylori NCTC 11637)M: DNA Marker Ⅶ; Lane 1-10: PCR products of 10 strains Pseudomonas putida isolated from gastric mucosa tissue; Lane 11: Negative control (ddH2O); Lane 12: Positive control (H. pylori NCTC 11637).圖1 10株惡臭假單胞菌利用細菌16S rRNA基因通用引物PCR擴增結果Fig．1 PCR amplification of 10 strains Pseudomonas putida by general primers of bacterial 16S rRNA gene

2.2 胃黏膜組織進行幽門螺桿菌特異性PCR快速診斷結果 10例分離出惡臭假單胞菌的胃黏膜標本均未培養(yǎng)出幽門螺桿菌，有6例組織標本的幽門螺桿菌特異性PCR結果為陽性，4例標本為陰性，見表1。

2.3 惡臭假單胞菌的K-B法藥敏檢測結果 由于傳代保種中死亡，有3株菌未做藥敏試驗，存活的7株菌對左氧氟沙星均敏感，對四環(huán)素1株敏感，但對甲硝唑、氨芐青霉素均耐藥，對阿莫西林、克拉霉素多為耐藥，見表2。

2.4 全自動細菌生化鑒定及藥敏試驗結果 7株傳代存活的菌株經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀鑒定為惡臭假單胞菌。細菌生化反應見表3。

3 討 論

低胃酸(pH<4)通常被認為是一個防止胃內(nèi)微生物過度生長的有效殺菌屏障[12]，并且胃內(nèi)膽汁酸的反流，較厚的粘液層和胃的蠕動等因素都不適宜于細菌的定植。同時，唾液和食物中由口腔內(nèi)乳酸桿菌轉(zhuǎn)化硝酸鹽形成的亞硝酸鹽在胃液作用下產(chǎn)生的一氧化氮，也參與上消化道的先天性防御。因此過去長期認為“胃是無菌器官”[13-14]。直至1982年，Barry Marshall 和Robin Warren發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌，并指出幽門螺桿菌與胃炎、胃潰瘍、胃癌、胃黏膜相關性淋巴樣組織淋巴瘤的相關性(MALT)[15]，徹底顛覆胃內(nèi)無菌的傳統(tǒng)觀點。

表1 10株惡臭假單胞菌培養(yǎng)及鑒定一般情況

Tab.1 General culture and identification information of 10 strains P. putida

標本編號Specimenserialnumber革蘭染色Gramsstaining尿素酶試驗Ureasetest胃黏膜組織的H．pylori特異性PCRH．pylorispecificPCRofgastricmucusatissueH．pylori培養(yǎng)結果H．pyloriculture臨床診斷ClinicaldiagnosisG16G-球桿菌G-coccobacillus+--慢性非萎縮性胃炎Chronicnon?atrophicgastritisG45G-球桿菌G-coccobacillus++-胃角潰瘍A1-H1期；慢性非萎縮性胃炎Gastricangleulcer(A1-H1phases)；Chronicnon?atrophicgastritiswithgas?tricantrumerosionG47G-短桿菌G-bacillusbrevis+--慢性非萎縮性胃炎伴幽門前區(qū)淺潰瘍A2期Chronicnon?atrophicgastritiswithprepyloriculcer(A2phase)G79G-球桿菌G-coccobacillus+--慢性非萎縮性胃炎Chronicnon?atrophicgastritisG88G-球桿菌G-coccobacillus++-胃竇潰瘍H1期；慢性非萎縮性胃炎Gastricantrumulcer(H1phase)；Chronicnon?atrophicgastritisD210G-短桿菌G-bacillusbrevis++-慢性胃炎ChronicgastritisD217G-短桿菌G-bacillusbrevis++-慢性胃炎；十二指腸息肉Chronicgastritis；DuodenalpolypsD228G-短桿菌G-bacillusbrevis++-全胃炎AllgastritisD230G-短桿菌G-bacillusbrevis++-胃多發(fā)性潰瘍MultiplegastriculcerD256G-短桿菌G-bacillusbrevis+--慢性胃炎Chronicgastritis

注：“+”為陽性，“-”為陰性

Note：＂+＂is positive； ＂-＂is negative

表2 7株惡臭假單胞菌K-B法藥敏檢測結果Tab．2 Antibiotic susceptibility of 7 strains of P. putida

藥物名稱Nameofantibiotics菌株數(shù)(n)No．ofstrains敏感株(n)No．ofsusceptiblestrains中介(n)No．ofintermediatestrains耐藥株(n)No．ofresistantstrains甲硝唑metronidazole7007氨芐青霉素Ampicillin7007阿莫西林amoxicillin7025克拉霉素clarithromycin7016四環(huán)素tetracycline7160左氧氟沙星levofloxacin7700

表3 7株非幽門螺桿菌的生化鑒定結果Tab．3 Biochemical identification results of 7 non-H.pylori strains

Oxidase+L．Gamma．Glutamyl．p．Nitroanilid+Arginine?Arginine-L．Proline．p．Nitroanilide+Glycine?Proline-p．Nitrophenyl．B．D．Glucoside-Glycine-Bis[p．Nitrophenyl]Phosphate-N?Glutaryl?Glycine．Arginine-B．D．Allose-L?Arginine-B．Gentiobiose-L?GlutamicAcid-Dextrose+L?Leucine+D．Fructose-L?Phenylalanine+D．Galactose-L?Proline-D．GluconicAcid-L?PyroglutamicAcid-D．Melibiose-L?Tryptophane-D．Sorbitol-Lysine．Alanine-D．Sucrose-Acetate-GalacturonicAcid-Adonitol-L．Arabinose-Citrate-L．Rhamnose-Colistin-Mehyl．B．Glucoside-D．Mannitol-Maltulose-KetoglutaricAcid(A)-N．Acetyl．Galactosamine-Malonate-N．Acetyl．Glucosamine-PolymyxinB-Ornithine-TiglicAcid-Urea-4?Methylumbelliferyl-Esculin-

注：“+”為陽性，“-”為陰性

Note：＂+＂is positive； ＂-＂is negative

近年來，隨著分子生物學和細菌16S rRNA基因鑒定技術的發(fā)展并用于胃微生態(tài)的研究，出現(xiàn)較新的關于胃內(nèi)菌群以及影響胃內(nèi)菌群因素的相關報道。Aviles-Jimenez等研究發(fā)現(xiàn)人體胃有一個復雜的微生物群定植，主要包括變形桿菌屬、放線菌屬、厚壁菌屬、梭形桿菌屬，顯示了與口腔和食管內(nèi)微生物群的顯著區(qū)別[16]。Hu Y等使用細菌分離培養(yǎng)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)也從胃內(nèi)分離鑒定出201株非幽門螺桿菌[17]。Osaki等報道發(fā)現(xiàn)，長期幽門螺桿菌感染能改變蒙古沙鼠胃內(nèi)微生物的細菌組成[18]。Nardone G等發(fā)現(xiàn),長期使用PPIs和H2受體拮抗劑，能影響胃內(nèi)微生態(tài)的組成，當胃內(nèi)pH>3.8時可出現(xiàn)細菌過度增長[14]。

我們在對臨床病變胃黏膜進行幽門螺桿菌分離培養(yǎng)的工作中發(fā)現(xiàn)，即使是在含有萬古霉素、頭孢磺啶、甲氧芐氨嘧啶和兩性霉素B的幽門螺桿菌選擇性培養(yǎng)基中仍然有非幽門螺桿菌的生長，其中不乏尿素酶陽性的非幽門螺桿菌。本次研究在354例疑為幽門螺桿菌感染者的胃黏膜組織中分離獲得的非幽門螺桿菌，經(jīng)16S rRNA基因測序和NCBI數(shù)據(jù)庫比對，10株菌的序列比對結果與惡臭假單胞菌一致性最高。在傳代保種和菌種復蘇過程中，3株菌死亡，傳代存活的7株菌經(jīng)全自動細菌生化鑒定儀鑒定為惡臭假單胞菌。

分離培養(yǎng)出惡臭假單胞菌的10例病人樣本均未培養(yǎng)出幽門螺桿菌，但有6例組織為幽門螺桿菌特異性PCR陽性，這6例PCR陽性但培養(yǎng)陰性的原因可能為黏膜中幽門螺桿菌數(shù)量較少，或者在運送過程中死亡，或者因患者曾經(jīng)使用抗生素治療以及惡臭假單胞菌在培養(yǎng)基上競爭性生長抑制了幽門螺桿菌的生長和繁殖。另4株分離得到惡臭假單胞菌的胃黏膜樣本無論培養(yǎng)還是靈敏度較高的組織PCR均未檢測到幽門螺桿菌，但這些患者的14C-尿素呼氣試驗卻為陽性，且胃鏡檢查也有黏膜病變，提示胃內(nèi)存在尿素酶陽性的非幽門螺桿菌。Abreu MT等報道，胃內(nèi)微生態(tài)群中產(chǎn)尿素酶的細菌除了幽門螺桿菌，還有奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色釀膿葡萄球菌、頭狀葡萄球菌和微球菌屬可致14C-尿素呼氣試驗假陽性結果[19]。部分惡臭假單胞菌也具有尿素酶活性[20]，可分解尿素產(chǎn)氨，氨中和部分胃酸，造成局部低酸環(huán)境，有利于細菌在胃內(nèi)的生存。本實驗分離得到的惡臭假單胞菌經(jīng)尿素酶試紙快速檢測為陽性，但臨床生化鑒定卻為陰性，原因為該菌種存在尿素水解試驗結果不確定的菌株[20]。臨床上，部分病人進行胃鏡檢查前曾有過抑酸劑和抗生素(如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素)的服用史。經(jīng)過治療，胃內(nèi)幽門螺桿菌的生長受到抑制，但胃生理和生態(tài)環(huán)境改變的胃黏膜可能繼發(fā)一些非幽門螺桿菌的生長，特別是對治療幽門螺桿菌感染用的抗生素耐藥的細菌。本次研究從患者胃黏膜分離的7株惡臭假單胞菌均對甲硝唑、氨芐青霉素耐藥，多數(shù)菌株對阿莫西林、克拉霉素耐藥，然而這些抗生素正是目前常用于治療幽門螺桿菌感染的抗菌藥物。

致謝：感謝貴州醫(yī)科大學消化內(nèi)鏡中心許良壁主任及全體工作人員的支持與幫助；感謝貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院內(nèi)鏡室的支持與幫助；感謝貴陽市兒童醫(yī)院內(nèi)鏡室的支持與幫助；感謝黔南布依族苗族自治州人民醫(yī)院的支持與幫助！

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Investigation of clinical significance ofPseudomonasputidaisolated from gastric biopsies

YIN Lin1,2, LIU Fang2, GUO Chang-cheng2, WANG Qiong2, YANG Jie3, PAN Ke4,PAN Chen3, XIONG Yan5, CHEN Ying-ting3, FANG Wen1, CHEN Zheng-hong2

(1.DepartmentofClinicalLaboratorySciences,GuizhouMedicalUniversity.Guiyang550004,China;2.DepartmentofMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang520025,China;3.DepartmentofGastrointestinalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;4.DepartmentofGastrointestinalMedicine,thePeople'sHospitalofQiannanAutonomousPrefecture,Duyun558000,China;5.DepartmentofGastrointestinalMedicine,GuiyangChildren'sHospital,Guiyang550004,China)

In order to investigate the role ofPseudomonasputidainH.pylori-associated gastrointestinal diseases, 354H.pyloripositive cases determined by14C-urea breath test were underwent endoscopy forH.pyloriisolation and identification.H.pyloriand non-H.pyloriwere identified by colonial morphology, Gram's staining, urease test andH.pylorispecific 16S rRNA gene fragment PCR amplification. Non-H.pyloriwere then inoculated on nutrient agar plate under aerobic conditions at 37℃ for 18-24 hours. Single bacterial colony was used for rapid urease test. Simultaneously, total genomic DNA were extracted from gastric mucosal tissue andH.pylorispecific 16S rDNA was amplified by PCR for rapid diagnosis. Urease positive non-H.pyloriwas selected for genomic DNA extraction and then bacterial 16S rDNA was amplified by general primers and then determined by sequencing. Sequence comparison was carried out by the BLASTn program and the GenBank databases (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Single colony which was identified asPseudomonasputidaby sequence alignment was then picked for subculturing. Drug susceptibility of 7 alive strains were detected by K-B disk diffusion method and also identified by automatic bacteria identification instrument. The results of 16S rDNA sequencing showed that a total of 10 strains were identified asPseudomonasputidafrom 354 cases. All of them are Gram's negative bacteria with urease activity. In these ten cases, 6 wereH.pylori-positive determined byH.pylorispecific PCR amplification, and 4 cases wereH.pylori-negative. All the seven alive strains ofPseudomonasputidawere susceptible to levofloxacin, 1 was susceptible to tetracycline, 5 were resistant to amoxicillin, 6 were resistant to clarithromycin and 7 were resistant to both metronidazole and Ampicillin. In conclusion,Pseudomonasputidawhich were urease-positive and resistant to antibiotic inH.pylorieradication can be isolated from diseased gastric mucosal tissue bacteria. These strains may cause false positive in clinical14C-urese breath test, and influenceH.pylori-associated gastrointestinal diseases progression.

Pseudomonasputida; culture; urease; 16S rRNA; drug resistance

Chen Zheng-hong, Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.011

國家自然科學基金資助項目(No．81460314)；貴陽市衛(wèi)生和計劃生育委員會科學技術計劃項目([2014]筑衛(wèi)計科技合同字第018號)聯(lián)合資助

陳崢宏，Email：chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院臨床生化教研室,貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室,貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴陽 550004； 4.黔南布依族苗族自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科,都勻 558000； 5.貴陽市兒童醫(yī)院消化內(nèi)科,貴陽 550000

R378

A

1002-2694(2016)12-1102-06

2016-05-14；

2016-09-14

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81460314) and the Guiyang Municipal Health and Family Planning Commission, Science and Technology Project, 2014(No. 018)