張 莉，王利麗，魏財文，楊春蕾，路 超，池晶晶，鄢明華

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)結(jié)合橫向流動試紙條檢測豬鏈球菌2型的應(yīng)用研究

張 莉1，王利麗1，魏財文2，楊春蕾1，路 超1，池晶晶1，鄢明華1

目的 建立一種豬鏈球菌2型的快速檢測方法。方法以豬鏈球菌2型cps2J基因序列為檢測靶標(biāo)設(shè)計6條環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)特異性引物，其中2條促環(huán)引物分別標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)和地高辛(Dig)，用橫向流動試紙條(LFD)檢測擴增產(chǎn)物，建立豬鏈球菌2型LAMP-LFD檢測方法。結(jié)果所建立的檢測方法能夠特異性的檢測出豬鏈球菌2型，與試驗對照菌株不存在交叉反應(yīng)，其最低檢測限為76 cfu/mL，在對100份樣品的檢測中，LAMP-LFD方法檢測出14份陽性樣品，培養(yǎng)法檢測出12份陽性樣品，LAMP-LFD方法檢測陽性率略高于病原培養(yǎng)法，兩者間的P>0.05無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論所建立LAMP-LFD檢測方法具有特異性好、敏感性高、操作簡單、快速等特點，適合于動物食品中豬鏈球菌2型的檢測。

豬鏈球菌2型；cps2J基因；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；橫向流動試紙條

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (No. 2012AA101605), the Agriculture Science and Technology Achievements Transformation and Extension Program of Tianjin (No. 201301030), and the Foun-dation of President of Tianjin Academy of Agricultural Sciences (No. 16003) Corresponding author: Yan Ming-hua, Email: yanmh81971@126.com

豬鏈球菌病(swinestreptococcosis)是由C、D、F及L群鏈球菌引起的豬的多種疾病的總稱，急性型常表現(xiàn)為出血性敗血癥和腦炎，慢性型以關(guān)節(jié)炎、內(nèi)膜炎、淋巴結(jié)化膿及組織化膿等為特征。豬鏈球菌(S.suis,Ss)是引起豬鏈球菌病的重要病原之一。根據(jù)菌體莢膜多糖的多樣性，豬鏈球菌分為1～34型和1/2型，共35個血清型，其中豬鏈球菌2型(S.suisserotype2,Ss2)致病力最強。豬鏈球菌2型不僅可引起豬發(fā)病，對人也具有致病性，人感染后會出現(xiàn)發(fā)燒、腦炎、敗血癥等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生中毒性休克導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡，是一種重要的人獸共患病原菌。自20世紀(jì)50年代以來，英國、美國等許多國家先后報道了人感染豬鏈球菌病例。國內(nèi)四川省、湖南省、浙江省等地均發(fā)生了人感染豬鏈球菌病疫情[1-3]。豬肉是人類重要的食品，其安全性越來越引起人們的關(guān)注。豬鏈球菌2型作為重要的動物源性人獸共患病原給人們的健康和生活造成了重大威脅。因此，建立準(zhǔn)確而快速的豬鏈球菌2型檢測方法是當(dāng)前豬鏈球菌病防控的關(guān)鍵，也是食品檢疫急需的手段。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種能在恒溫條件下快速、準(zhǔn)確、特異地擴增目的DNA的技術(shù)。將橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)與LAMP技術(shù)相結(jié)合，操作者只需將試紙條浸入含有LAMP擴增產(chǎn)物的緩沖液即可直觀的得到檢測結(jié)果，不需要特殊設(shè)備及使用EB等有毒試劑。本研究應(yīng)用上述原理，根據(jù)豬鏈球菌的cps2J基因設(shè)計一套LAMP引物，建立豬鏈球菌2型的特異性LAMP檢測方法，并結(jié)合LFD對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌 (O157∶H7，CVCC 83726)、無乳鏈球菌(CVCC 1887)、停乳鏈球菌(CVCC 588)、金黃色葡萄球菌(CAU0789)、甲型副傷寒沙門氏菌(CVCC 2187)、表皮葡萄球菌(CAU0244)、痢疾志賀氏菌(CVCC 1881)、豬鏈球菌2型(CVCC 3307)、豬鏈球菌1型(S428)、豬鏈球菌7型(8074)、豬鏈球菌9型(DAN22083)購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；蠟樣芽苞桿菌、銅綠假單孢菌均由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜堿購自New England Biolabs公司；DNA提取試劑盒購自天根生物技術(shù)公司；橫向流動試紙條購自Milenia Biotec GmbH 公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬鏈球菌cps2J基因(GenBank：GQ352502.1)上的一段保守核苷酸序列，采用Primer explore V在線軟件設(shè)計特異性LAMP引物，由大連寶生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

引物名稱Primer類型Types位置Position序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)擴增產(chǎn)物(bp)productLAMPprimersF3Forwardouter201?218TGGTGTTTCAAACGCAAGB3Reverseouter374?392TGCAGCTCAGATTCTTGAFIP(F1c+F2)ForwardouterF1c：265?288GCCGTCAACAATATCATCAGAATCF2：219?242GAATTACGGTATCAAAAATAGCACBIP(B1c+B2)ReverseouterB1c：290?314ACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGB2：351?368CCATCAAAAGTAGCAAGTLFaForwardouter243?264TCGTTTAATATAATACAAACATLBbReverseouter315?350GAGAATGATAGTGATTTGTCPCRPrimersSS2?F3201?218TGGTGTTTCAAACGCAAG190bpSS2?B3374?392TGCAGCTCAGATTCTTGA

a ：5′標(biāo)記FITC b:5′標(biāo)記Dig

1.4 DNA模板的制備 采用天根生物技術(shù)公司DNA試劑盒提取參考菌株和待檢樣品的DNA用于檢測。

1.5 LAMP-LFD方法的建立

1.5.1 LAMP反應(yīng)條件摸索 豬鏈球菌LAMP的反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL 10×等溫反應(yīng)緩沖液、1.0 μL Bst DNA聚合酶(8 U/μL)、4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、0.5 μL FIP(40 μmol/L)、0.5 μL BIP(40 μmol/L)、0.5 μL F3(5 μmol/L)、0.5 μL B3(5 μmol/L)、0.5 μL LF(5 μmol/L)、0.5 μL LB(5 μmol/L)、1.0 μL模板DNA、4.0 μL甜菜堿(5 mol/L)和9.5 μL超純水。

將溫度按55 ℃、60 ℃、63 ℃、65 ℃依次遞增，確定最佳退火溫度。在最佳溫度條件下，固定其他條件不變，反應(yīng)時間按15、30、45、60 min優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)時間。

1.5.2 LAMP-LFD反應(yīng)條件摸索

1.5.2.1 按照1.5.1的試驗結(jié)果進(jìn)行LAMP擴增，其中LF和LB引物分別標(biāo)記有FITC和Dig。反應(yīng)結(jié)束后，使用橫向流動試紙條讀取LAMP檢測結(jié)果。

1.5.2.2 取LAMP擴增產(chǎn)物10 μL加入到100 μL緩沖液中，混合均勻，將試紙條插入稀釋后的LAMP液體中3 min。

1.5.2.3 取出試紙條水平放置，5 min內(nèi)讀取結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：同時出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線為陽性，只出現(xiàn)質(zhì)控線為陰性，只出現(xiàn)檢測線為無效。

1.6 特異性試驗 用已優(yōu)化的LAMP體系擴增大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、表皮葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、豬鏈球菌2型、豬鏈球菌1型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、蠟樣芽苞桿菌、銅綠假單孢菌的DNA樣品，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD分別檢測擴增產(chǎn)物，檢測LAMP方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 將豬鏈球菌2型新鮮制備的菌液用平板計數(shù)法計算含菌量，并進(jìn)行10倍系列稀釋至10-5，對上述稀釋菌液分別提取模板DNA，并進(jìn)行LAMP和PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD分別檢測擴增產(chǎn)物，確定LAMP和PCR方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 采用同一批次和不同批次提取的豬鏈球菌DNA作為模板分別進(jìn)行5次LAMP擴增，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD法檢測擴增產(chǎn)物，確定所建立LAMP方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 應(yīng)用試驗

1.9.1 試驗?zāi)M樣品的檢測 取10 g未檢出豬鏈球菌2型的新鮮豬肉，加入100 mL生理鹽水制作為勻漿。將勻漿分為50份，隨機選擇15份加入104cfu/mL的豬鏈球菌菌液，模擬細(xì)菌感染，混合均勻后用細(xì)菌分離培養(yǎng)法和LAMP-LFD方法分別進(jìn)行檢測。

1.9.2 市售樣品的檢驗 從市場和屠宰場隨機采集50份豬肉樣本，加入生理鹽水勻漿后，用細(xì)菌分離培養(yǎng)法和LAMP-LFD方法分別進(jìn)行檢測。

1.9.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS17.0對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用配對四格表進(jìn)行χ2檢驗。當(dāng)P<0.05是，說明兩種方法有差別。以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計算LAMP-LFD檢測樣品的靈敏度等指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 豬鏈球菌2型LAMP-LFD方法的建立

2.1.1 LAMP反應(yīng)條件摸索

2.1.1.1 反應(yīng)溫度篩選結(jié)果 采用1.5中所述的25 μL反應(yīng)體系，分別在55 ℃、60 ℃、63 ℃、65 ℃ 4個恒溫溫度下擴增1 h，瓊脂糖凝膠電泳觀察，55 ℃無擴增產(chǎn)物，60 ℃有彌散擴增條帶，63 ℃、65 ℃為多種大小條帶的組合LAMP特征性圖形，為陽性結(jié)果，而63 ℃的條帶最為清晰，因此選擇63 ℃為最適反應(yīng)溫度。結(jié)果見圖1。

M：100bp DNA ladder Marker1：65 ℃；2：63 ℃；3：60 ℃；4：55 ℃圖1 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.1 Effect of reaction temperature on the LAMP produce

2.1.1.2 反應(yīng)時間篩選結(jié)果 在63 ℃恒溫下選擇15、30、45和60 min 4個時間點分別進(jìn)行LAMP擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示擴增45 min時已經(jīng)能夠看到梯狀電泳條帶，但是量較少，而60 min時擴增帶的非常清晰，說明60 min為反應(yīng)的最佳擴增時間。結(jié)果見圖2。

M：100bp DNA ladder Marker1：15 min；2:30 min；3：45 min；4：60 min；5：negative control圖2 LAMP反應(yīng)時間的優(yōu)化Fig.2 Effect of reaction time on the LAMP produce

2.1.1.3 LAMP-LFD反應(yīng)條件摸索 取陰性和陽性LAMP擴增產(chǎn)物，使用橫向流動試紙條讀取LAMP結(jié)果，可見陽性產(chǎn)物的試紙條的陽性檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色帶，陰性產(chǎn)物的試紙條只在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色帶。結(jié)果見圖3。

2.2 特異性試驗 試驗結(jié)果表明所建立的豬鏈球菌LAMP-LFD檢測方法能夠特異地檢測豬鏈球菌2型，檢測大腸桿菌、蠟樣芽苞桿菌、銅綠假單孢菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、表皮葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、豬鏈球菌1型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型均為陰性。從圖4可見采用瓊脂糖凝膠電泳和試紙條方法的檢測結(jié)果完全一致。

1：positive sample；2：negative sample圖3 LAMP-LFD檢測結(jié)果Fig.3 Result of LAMP-LFD

1：空白；2：大腸桿菌 (O157：H7，CVCC 83726)；3：蠟樣芽苞桿菌；4：銅綠假單孢菌；5：停乳鏈球菌(CVCC 18847)；6：停乳鏈球菌(CVCC 588)；7：金黃色葡萄球菌(CAU0789)；8：甲型副傷寒沙門氏菌(CVCC 2187)；9：表皮葡萄球菌(CAU0244)；10：痢疾志賀氏菌(CVCC 1881)；11：豬鏈球菌2型(CVCC 3307)；12：豬鏈球菌1型(S428)；13：豬鏈球菌7型(8074)；14：豬鏈球菌9型(DAN22083)；M：100bp DNA ladder Marker1：negative control；2：Escherichia coli (O157：H7，CVCC 83726)；3：Bacillus cereus；4：Pseudomonas aeruginosa(Schroter)Migula；5：Streptococcus agalactiae(CVCC 1887)；6：Streptococcus dysgalactiae(CVCC588)；7：Staphylococcus aureus(CAU0789)；8：Salmonella aratyphi-A(CVCC 2187)；9：Staphylococcus epidermidis(CAU0244)；10：Shigella dysenteriae(CVCC 1881)；11：Streptococcus suis serotype 2(CVCC 3307)；12：Streptococcus suis serotype 1(S428)；13：Streptococcus suis serotype 7(8074)；14：Streptococcus suis serotype 9(DAN22083)；M：100 bp DNA ladder Marker圖4 LAMP特異性試驗結(jié)果Fig.4 Result of LAMP specificity test

2.3 敏感性試驗 從圖5可看出PCR的最低檢測限為760 cfu/mL，LAMP電泳法和LAMP-LFD的最低檢測限為76 cfu/mL，比PCR的敏感性高10倍。

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 取同一次和不同時間提取的鏈球菌DNA各5份，將其作為模板進(jìn)行5次LAMP擴增，反應(yīng)后結(jié)果完全一致，說明所建立的方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

M1：250 bp DNA ladder Marker M2:100 bp DNA ladder Marker 1：0.76 cfu/mL；2：7.6 cfu/mL；3：76 cfu/mL；4：7.6×102 cfu/mL；5：7.6×103 cfu/mL；6：7.6×104 cfu/mL；N：negative control圖5 LAMP(A)、LAMP-LFD(B)、PCR(C)檢測方法的敏感性試驗Fig.5 Sensitivity of LAMP (A), LAMP-LFD (B) and PCR (C)

2.5 應(yīng)用試驗

2.5.1 試驗?zāi)M樣品的檢測 分別應(yīng)用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法和建立的方法對50份試驗?zāi)M樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢測到陽性樣品12份，LAMP-LFD方法檢測到樣品14份。

2.5.2 市售樣品的檢測 使用細(xì)菌分離培養(yǎng)法和LAMP-LFD兩種方法對市場和屠宰場隨機采集的50份豬肉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果2種方法均未檢出豬鏈球菌2型。

2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用SPSS17.0軟件對上述結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)菌分離培養(yǎng)法和LAMP-LFD方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)，LAMP-LFD方法的靈敏度為91.67%，特異度為96.60%。

表2 兩種方法檢測結(jié)果比較[3]Tab.2 Comparison of results for two methods

LAMP?LFD培養(yǎng)法Culture+—合計Total陽性預(yù)測值PPV陰性預(yù)測值NPV+1131478．57%——18586—98．84%合計Total1288100——靈敏度Sensitivity91．67%———特異度Specificity—96．60%———

Note:χ2=0.683，P=0.625>0.05，兩種方法無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討 論

豬鏈球菌2型引起的感染在養(yǎng)豬業(yè)中被認(rèn)為是一個全球性問題。1951年，Jansen和Van Dorssen在世界范圍內(nèi)首次報道人感染豬鏈球菌病例。1998年我國首次報道人感染豬鏈球菌病例。2012年浙江省瑞安地區(qū)從血液和腦脊液中分離到了豬鏈球菌2型，后經(jīng)MLST和毒力基因鑒定為高致病株[4]。鑒于豬鏈球菌2型對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康安全造成的重大威脅，建立快速、敏感和特異的檢測方法，對該病的診斷及研究具重要意義。

國內(nèi)外已報道的豬鏈球菌診斷方法有很多種，其中細(xì)菌分離培養(yǎng)方法最為經(jīng)典，是確診疾病的重要手段，但該方法費時費力，而且樣品尤其是食品中致病菌的含量很低，分布也不均勻，采用分離細(xì)菌的方法容易漏檢。分子生物學(xué)方法的發(fā)展顯著提高了檢測的敏感性。談忠鳴等[5]建立的豬鏈球菌2型快速PCR可檢測到103稀釋的DNA，朱靜等[6]建立的熒光定量PCR的最低檢測限達(dá)32 cfu/mL。張九州等[7]等根據(jù)GenBank登錄的SS2特異的莢膜多糖(cps2H)基因序列作為檢測靶標(biāo)，建立了一種檢測SS2的LAMP方法，其最低檢測量為0.186 fg/μL模板DNA，且與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。Jinhai Zhang等[8]也報道了一種檢測SS2cps2J基因的LAMP方法，研究人員分別采用SYBR Green、凝膠電泳、比濁、鈣黃綠素測定和羥基萘酚藍(lán)檢測等方法對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明SYBR Green、凝膠電泳和鈣黃綠素檢測方法的靈敏度較高，最低檢測限為7.16拷貝/反應(yīng)，與熒光定量PCR方法靈敏度相當(dāng)。本研究建立了一種能檢測豬鏈球菌2型血清型的LAMP-LFD方法，該方法采用LFD試紙條對LAMP擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，最低能夠檢測到76 cfu/mL的細(xì)菌，其敏感性與朱靜等報道的熒光定量PCR方法處于同一數(shù)量級。迄今，已經(jīng)報道的LAMP擴增產(chǎn)物檢測方法較多。應(yīng)用最為廣泛的是瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green、鈣黃綠素測定等方法。瓊脂糖凝膠電泳是常用的方法之一，其不足之處是易產(chǎn)生氣溶膠的污染，導(dǎo)致假陽性。與SYBR Green、鈣黃綠素測定等其它可視化LAMP產(chǎn)物檢測方法相比，LFD方法在LAMP引物的設(shè)計中，2條促環(huán)引物分別標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)和地高辛(Digixon，Dig)，當(dāng)LAMP擴增后，陽性擴增產(chǎn)物具有FITC和Dig的雙重標(biāo)記。依據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)原理，擴增產(chǎn)物通過FITC與試紙條上膠體金標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素的抗體特異性結(jié)合，形成三元復(fù)合物，經(jīng)過層析作用，由Dig與試紙條檢測線上的檢測線上的生物素相結(jié)合，呈現(xiàn)出紅褐色。由于抗原-抗體的免疫學(xué)篩選左右，LFD方法具有更良好的特異性[9-11]。

豬鏈球菌血清型眾多，莢膜多糖(cps)為公認(rèn)的豬鏈球菌毒力因子，它能保護(hù)細(xì)菌在非免疫動物體內(nèi)不被吞噬[12]。豬鏈球菌2型的莢膜多糖共有cps2Z、2J等14個開放閱讀框，其中cps2J基因除與1/2型有較高同源性外，與其他血清型序列同源性都很低，是目前國內(nèi)外利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別豬鏈球菌2型種型的靶基因[8,13]。本研究所建立的LAMP方法選擇豬鏈球菌cps2J基因作為靶基因，設(shè)計了一組型特異性引物，試驗結(jié)果顯示，該方法與大腸桿菌、銅綠假單孢菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、表皮葡萄球菌、痢疾志賀氏菌以及豬鏈球菌1、7、9型等12種食源性病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。

為了驗證本研究建立方法在動物性食品中應(yīng)用的可能性，研究人員將培養(yǎng)的SS2加入勻漿后的豬肉樣品中，應(yīng)用建立的方法進(jìn)行食品中病原菌模擬檢測，結(jié)果表明該方法可直接用于樣品中豬鏈球菌2型的檢測，其最低能夠檢測到76 cfu/mL的細(xì)菌。綜上，本方法具有快速、特異、敏感等特點，不需特殊儀器設(shè)備和專業(yè)的實驗條件，操作更為簡便，非常適用于臨床和基層使用，對豬鏈球菌2型突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置的早期篩檢中具有重要意義。

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Rapid detection ofStreptococcussuisserotype 2 with loop mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick

ZHANG Li1, WANG Li-li1, WEI Cai-wen2, YANG Chun-lei1,LU Chao1, CHI Jing-jing1, YAN Ming-hua1

(1.TianjinVeterinaryResearchInsititution,Tianjin300384,China;2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The aim of this study is to establish a rapid detection method forStreptococcussuisserotype 2. Six specific primers of transcription loop method were designed based on the conservative regions ofcps2Jgene ofS.suisserotype 2, two loop primers were respectively labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC) and digoxin(Dig). After amplification, the products of LAMP were detected by lateral flow devices (LFD), then the LAMP-LFD was established. The assay was highly specific for theS.suisserotype 2. No cross-reaction was observed with any of the other pathogenic bacteria. The sensitivity of the assay was 76 cfu/mL. For the 100 suspected samples, 14 positive samples were identified by the LAMP-LFD method, while 12 positive samples were identified by culture method. The LAMP-LFD method had higher sensitivity than that of the culture method, butPvalue>0.05, that was not in significant level. The LAMP-LFD method established in this study was a simple and rapid operation with good sensitivity and specificity. It can be used as reliable method for animal produce detection ofS.suisserotype 2.

Streptococcussuisserotype 2;cps2Jgene; loop mediated isothermal; amplification; lateral flow dipstick

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.007

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目(No.2012AA101605)，天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目(No.201301030)，天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院基金項目(No.16003)聯(lián)合資助

鄢明華，Email:yanmh81971@126.com

1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300384； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

R379

A

1002-2694(2016)12-1077-06

2016-06-15；

2016-10-02