章 瑩，宗紅英，何 立，蔡國斌

剛地弓形蟲DXR基因的克隆表達與生物學(xué)特性分析

章 瑩1，宗紅英2，何 立2，蔡國斌2

目的 對剛地弓形蟲1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶(TgDXR)基因進行克隆、表達、純化和生物學(xué)特性分析。方法收集、純化RH株弓形蟲速殖子，提取cDNA和基因組DNA；PCR擴增TgDXR的基因片段；構(gòu)建成熟TgDXR/pET-24b重組原核表達載體；經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克??；在大腸桿菌BL21中用IPTG誘導(dǎo)表達。親和層析純化重組TgDXR蛋白，并對該蛋白的生物學(xué)特性和酶的動力學(xué)活性進行分析。結(jié)果從弓形蟲RH株的cDNA和基因組DNA中分別擴增出長度為1 542 bp和5 464 bp的TgDXR片段，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒；SDS-PAGE結(jié)果表明，目的基因在大腸桿菌中高效表達。重組蛋白的相對分子量約50 kDa。酶活性實驗顯示，Mg2+、Mn2+是最佳金屬螯合離子，反應(yīng)最佳pH值為7.5，該酶活性抑制劑膦胺霉素(Fosmidomycin)對該酶蛋白的IC50為0.52 μmol/L。結(jié)論RH株剛地弓形蟲TgDXR可在原核表達系統(tǒng)中高效表達，該重組蛋白具有生物學(xué)活性，并有望作為弓形蟲特異性藥物靶標(biāo)。

剛地弓形蟲；DXR；克隆表達；膦胺霉素

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲。弓形蟲病是一種危害十分嚴重的人獸共患寄生蟲病[1]。目前，該病治療尚無理想的特效藥物，主要以乙胺嘧啶和磺胺類藥物聯(lián)合應(yīng)用為主。尋求新型的活性高、毒性低、能完全殺滅弓形蟲緩殖子的藥物是研究的焦點[2-3]。

動物體內(nèi)類異戊二烯有2種不同類型的合成途徑，即甲羥戊酸(MVA)途徑和2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑。MVA合成途徑主要存在于人、動物、酵母真菌及一些古細菌當(dāng)中，而MEP途徑是絕大多數(shù)病原微生物如結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌、肺炎桿菌、腦膜炎雙球菌、梅毒密螺旋體、以及頂復(fù)門寄生原蟲如瘧原蟲、弓形蟲等合成萜類化合物的唯一途徑[4]。MEP途徑在不同物種之間的這一差異，使得催化該途徑的酶成為潛在的、同時又具有選擇性的分子藥物靶。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶(DXR)是MEP途徑中的第2個反應(yīng)關(guān)鍵酶[4]。膦胺霉素(fosmidomycin, Fos)是傳統(tǒng)的DXR小分子抑制劑，是研究MEP途徑的有用工具[5]。本研究通過克隆弓形蟲DXR(TgDXR)基因，構(gòu)建原核表達載體，對體外表達的蛋白進行純化，對該酶的生物學(xué)活性及Fos對其的抑制活性進行了分析，從而為深入研究TgDXR作為藥物靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、主要試劑 弓形蟲RH株(國際標(biāo)準(zhǔn)強毒株)液氮保存，Trizol、原核表達質(zhì)粒pET-24b、T4 DNA連接酶、大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21(RIL)購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶NdeI、HindIII、cDNA合成試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自Promega公司，Ni-NTA agarose購自Amersham Biosciences公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、膦胺霉素(Fos)、NADPH、BSA等試劑均購自Sigma公司。

1.2 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫剛地弓形蟲基因組中目的基因序列(DS984747，scf_1112359874706 genomic scaffold)和(XM_002370765，mRNA)，分別設(shè)計2對TgDXR基因擴增的特異性引物：一對長片段PCR技術(shù)(long-range PCR)擴增TgDXR基因組序列和合成該基因cDNA全長的上游引物TgDXR-F：5′-CTCTTCTCTGTCAACTCACCATGTTGAAG-3′，對應(yīng)的下游引物TgDXR-R：5′-GAGGGCCTTTAAGCCGAGGAAGTGAACACG-3′；另一對為體外表達TgDXR酶成熟蛋白的含限制性內(nèi)切酶的RT-PCR上游引物TgDXR-NF：5′-GCCATATGAAGAGACTTGTGGTTTTGGGAAG-3′(NdeI)，對應(yīng)的下游引物TgDXR-HR：5′-GGAAGCTTCTTCCTCGGCTTAAAGGCCCTCG-3′(HindIII)，由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

1.3TgDXR基因組序列擴增 從液氮中取出RH株弓形蟲，37 ℃水浴解凍，腹腔注射小鼠，數(shù)天后抽取腹腔液，分別用胰酶和氯化銨液消化，生理鹽水洗滌，離心得速殖子。使用基因組DNA提取試劑盒參照說明書提供的方法提取弓形蟲基因組DNA。以合成的DNA為模板進行長片段PCR擴增：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸6 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色鑒定。PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定。

1.4TgDXR基因cDNA序列擴增 參照Trizol試劑盒說明提取弓形蟲總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。以合成的cDNA為模板PCR擴增：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火50 s，68 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.5TgDXR基因與表達載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定將PCR產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pET-24b經(jīng)NdeI、HindIII雙酶切, 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。目的基因TgDXR與質(zhì)粒pET-24b T4連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coliDH5α中, 卡那霉素篩選陽性克隆, 提取陽性克隆質(zhì)粒、雙酶切, 1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測序鑒定。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和純化 將已鑒定的重組質(zhì)粒pET-24b/TgDXR轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coliBL21中，挑取單個菌落接種于含卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中, 37 ℃, 250 r/min振搖12 h, 按1∶100接種于含卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至對數(shù)期OD600為0.4～0.6時, 加入IPTG 至終濃度0.25 mmol/L誘導(dǎo)表達4 h。將菌液離心進行10% SDS-PAGE、考馬斯亮藍R250染色分析重組蛋白表達情況。確定最佳誘導(dǎo)條件后，按照上述方法進行大量誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，PBS重懸，冰浴超聲裂解，12 000 r/min，4 ℃離心20 min收集上清，用Ni-NTA agarose參照說明書，用不同濃度咪唑的緩沖液進行洗滌，獲得純化的目的蛋白。

1.7TgDXR酶生物學(xué)特性測定TgDXR酶活性測定參照文獻[6]方法進行。在U型96孔微量培養(yǎng)版中，每孔內(nèi)100 nmol/LTgDXR酶蛋白、4 mmol/L MgCl2、100 μmol/L DXP、100 μmol/L NADPH和50 μg/mL BSA溶解于50 mmol/L HEPES緩沖液(pH7.6)中，使用Beckman DTX-880 microplate reader連續(xù)10 min、每隔30 s測定OD340值。酶活性抑制實驗則在反應(yīng)液加入DXP之前，抑制劑膦胺霉素(Fos)和TgDXR酶先在30 ℃孵育10 min。不同金屬離子、不同Mg2+濃度和不同pH值對酶活性的影響實驗同上進行。所有數(shù)據(jù)使用Prism(version 5.0)軟件進行統(tǒng)計分析。為了盡量減少誤差，重復(fù)3次獨立性實驗。

2 結(jié) 果

2.1TgDXR基因的PCR擴增與重組表達質(zhì)粒pET-24b/TgDXR的鑒定 分別以弓形蟲RH株速殖子的cDNA和基因組DNA(gDNA)為模板，PCR擴增該基因的cDNA開放閱讀框區(qū)和基因組序列。PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A所示。測序結(jié)果顯示，TgDXR的cDNA開放閱讀框序列全長為1 542 bp；TgDXR的gDNA序列長為5 464 bp；兩者的堿基長度和準(zhǔn)確度與預(yù)期序列的一致度>99%。通過比對分析，發(fā)現(xiàn)TgDXR基因由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成(圖1B)。重組表達質(zhì)粒pET-24b/TgDXR通過NdeI、HindIII雙酶切后可見5 310 bp和1 341 bp 2條帶(圖1C，泳道5)。PCR鑒定結(jié)果和測序結(jié)果顯示，目的基因成熟蛋白表達區(qū)為1 341 bp(圖1C，泳道3)，與預(yù)期TgDXR成熟區(qū)序列一致。結(jié)果表明pET-24b/TgDXR重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1C和D)。

2.2 重組蛋白TgDXR的表達與純化 重組質(zhì)粒pET-24b/TgDXR轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后，在37 ℃、IPTG終濃度為0.25 mmol/L、誘導(dǎo)表達4 h時可獲得大量表達的可溶性目的蛋白，該重組蛋白預(yù)測的理論分子量約為50.3 kDa。經(jīng)Ni-NTA agarose鎳親和層柱法純化后進行SDS-PAGE分析，在50 kDa處有一條清晰的目的蛋白回收帶(與理論分子量一致)，即純化后的目的蛋白(圖2)。

2.3TgDXR酶生物學(xué)特性 在Mg2+和NADPH存在的情況下，體外原核表達的重組TgDXR成熟蛋白具有酶的活性。不同金屬離子對酶活性的影響實驗顯示：Mn2+對酶活性的影響幾乎與Mg2+相同，而以Co2+作為螯合離子時，酶的活性只有一半(圖3A)。Mg2+濃度對酶活性的影響結(jié)果顯示：隨著Mg2+濃度的升高，該酶的活性逐漸增強，4 mmol/L時酶的活性達到最大(圖3B)。酶反應(yīng)緩沖液的pH值對酶活性的影響結(jié)果顯示：pH 6.5 ～ 8.5時該酶蛋白均有酶活性，而當(dāng)pH值為7.5～8.0時，酶活性相對最強(圖3C)。DXR酶活性抑制劑膦胺霉素(Fos)對酶活性的影響結(jié)果表明：隨著抑制劑濃度的升高，酶活性逐漸被抑制，經(jīng)Prism 5.0軟件分析該小分子化合物的半抑制濃度IC50為(0.520±0.043)μmol/L(圖3D)。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 表達原液部分; 2. 未結(jié)合部分; 3. 洗脫部分; 4. 純化部分1; 5. 純化部分2; 6. 純化部分3

M: Protein molecular weight marker; 1. original fractions; 2. un-binding fractions; 3. washing fractions; 4. elucted fraction 1; 5. elucted fraction 2; 6. elucted fraction 3

圖2 重組TgDXR成熟蛋白純化SDS-PAGE分析

Fig.2 Purification of recombinant matureTgDXR protein by SDS-PAGE analysis

3 討 論

類異戊二烯及其衍生物在細胞的初級和次級代謝中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，類異戊二烯的合成有2種不同類型的途徑，即甲羥戊酸(MVA)途徑和2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑[4]。經(jīng)典的MVA合成途徑存在于人和動物宿主中；而絕大多數(shù)病原微生物以及頂復(fù)門寄生原蟲如瘧原蟲、弓形蟲等合成萜類化合物的唯一途徑是MEP途徑[7]。頂質(zhì)體(apicoplast)對于頂復(fù)門寄生原蟲的生存有著極為重要的作用，阻斷其某些基因的復(fù)制與表達后，蟲體將無法繼續(xù)增殖、立即死亡[8-9]。Nair等人(2011)提示頂復(fù)門原蟲DXR可能存在于頂質(zhì)體內(nèi)發(fā)揮催化類異戊二烯合成的作用[10]。DXR酶蛋白是MEP途徑中的第2個反應(yīng)關(guān)鍵酶，其在二價金屬離子和NADPH的輔助下催化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)發(fā)生異構(gòu)并還原生成MEP。該反應(yīng)是MEP代謝途徑中最重要的限速反應(yīng)和整個類異戊二烯化合物代謝中的重要調(diào)控位點[11]。基因組信息數(shù)據(jù)分析表明，該酶在人和哺乳動物機體中未發(fā)現(xiàn)，而在病原微生物和頂復(fù)門寄生原蟲中存在[12]。因此利用DXR這一潛在藥物靶標(biāo)位點研制抗菌和抗寄生原蟲藥物成為人們的研究興趣。不同物種DXR的動力學(xué)參數(shù)不同，相差也較大。二價金屬離子可作為DXR的輔基，該酶催化時必須以NADPH作為專一輔酶[13]。膦胺霉素Fos及其衍生物FR900098是傳統(tǒng)的DXR抑制劑，是研究MEP途徑的有用工具[12]。體外實驗顯示Fos及其衍生物能有效抑制惡性原蟲存活[14]，體內(nèi)實驗以文氏鼠瘧原蟲(Plamodiumvinckei)感染小鼠為模型，顯示Fos能夠有效治愈鼠瘧疾類異戊二烯及其衍生物在細胞的初級和次級代謝中起著重要的作用

A. 二價金屬離子對酶活性的影響；B. Mg2+濃度對酶活性的影響；C. pH值對酶活性的影響；D. DXR抑制劑(膦胺霉素，F(xiàn)os)對酶活性的影響A.Effects of divalent metal ions on TgDXR activity; B.effects of [Mg2+] on TgDXR catalyzed reaction; C.effects of pH on TgDXR catalyzed activity;D.effects of DXR inhibitor (fosmidomycin, Fos) on TgDXR activity.圖3 重組TgDXR成熟酶蛋白生物學(xué)特性分析Fig.3 Biological characteristic analysis of the recombinant mature TgDXR enzyme

關(guān)于弓形蟲DXR的研究，相對于瘧原蟲DXR報道較少。本研究先根據(jù)GenBank注釋的T.gondiiME49株的DXR基因序列設(shè)計特異性引物，PCR克隆T.gondiiRH株DXR基因序列，結(jié)果擴增出的基因序列與預(yù)測的ME49株的DXR基因序列大小相等，順序一致性高于99%。前期研究提示：頂復(fù)門原蟲與植物的類異戊二稀合成代謝酶的N-末端均具有頂質(zhì)體靶向引導(dǎo)肽序列，包括信號肽和轉(zhuǎn)導(dǎo)肽[16]。根據(jù)比對結(jié)果分析，TgDXR 1-67位氨基酸應(yīng)是一個引導(dǎo)肽區(qū)域，而68-513位共446個氨基酸構(gòu)成了TgDXR成熟蛋白。

本研究把去掉信號肽和轉(zhuǎn)導(dǎo)肽片段的TgDXR成熟蛋白區(qū)克隆到原核表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌中進行可溶性表達。所表達的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析分子量與推測的分子量相吻合，表明所獲表達產(chǎn)物的大小與目的基因產(chǎn)物所編碼蛋白的大小相一致。之后利用體外重組表達的TgDXR成熟蛋白進行酶生物學(xué)特性分析和抑制動力學(xué)試驗。研究表明，體外重組表達的TgDXR蛋白在Mg2+或Mn2+存在條件下，能氧化NADPH并催化DXP生成MEP。而Co2+作為螯合劑時，酶的催化活性減半。小分子化合物DXR-抑制劑膦胺霉素(Fos)對TgDXR活性有較強的抑制作用，提示TgDXR是開發(fā)新型抗弓形蟲藥物的重要靶標(biāo)。

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Cloning, expression and biological features of Toxoplasma gondii DXR

ZHANG Ying1, ZONG Hong-ying2, HE Li2, CAI Guo-bin2

(1.DepartmentofMedicalGenetics,WuhanUniversitySchoolofBasicMedicalSciences,Hubei430071,China;>2.DepartmentofHumanParasitology,WuhanUniversitySchoolofBasicMedicalSciences,Hubei430071,China)

To clone, express and purify of the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) gene fromToxoplasmagondiiRH strain and analyze its biological characters, the DXR ofT.gondii(TgDXR) was amplified from cDNA and genomic DNA by PCR. The mature domain ofTgDXR was cloned into the pET-24b vector to construct the prokaryotic expression vectorTgDXR/pET-24b, which was efficiently expressed inE.coliBL21 (RIL). RecombinantTgDXR was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The biological properties of this enzyme were characterized and enzyme activity/fosmidomycin (Fos) inhibition assay was tested. Result showed thatTgDXR in the non-mevalonate isoprene biosynthesis pathway was a potential target for developingToxoplasmakilling drugs.

Toxoplasmagondii;(DXR); prokaryotic expression; fosmidomycin

Cai Guo-bin, Email: gbcai2011@whu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.009

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(No.2042015kf036)

蔡國斌，Email: gbcai2011@whu.edu.cn

1. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，武漢 430071； 2. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，武漢 430071

R382.5

A

1002-2694(2016)12-1091-05

2016-06-08；

2016-09-02

Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2042015kf036)