李奕基，陳新新，符瑞佳，陳小靜，呂 剛，梁 培,3

曼氏迭宮絳蟲鈣/鈣調素依賴蛋白激酶I (SmCaMK I)基因的生物信息學分析與表達鑒定

李奕基1,2，陳新新2，符瑞佳1,2，陳小靜2，呂 剛1,2，梁 培1,2,3

目的 開展SmCaMK I(曼氏迭宮絳蟲鈣/鈣調素依賴蛋白激酶I)的潛在生物學特征分析和功能研究。方法利用相關網站和軟件對SmCaMK I的同源性核苷酸序列比對分析、保守位點預測、構建分子進化樹、編碼氨基酸的淋巴細胞表位進行分析預測。此外，SmCaMK I進行擴增，并克隆到表達載體pET-28α(+)中進行蛋白的表達純化，制備大鼠免疫血清進行蟲體免疫組織定位分析。結果SmCaMK I是一個全長基因，由1 068 bp組成，編碼355個氨基酸。SmCaMK I與細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的CaMK I保守功能域的氨基酸序列一致性分別為89%和88%，與人的CaMK I氨基酸序列一致性僅僅只有44%。分子進化樹分析中SmCaMK I與絳蟲屬的親緣關系最近，與其他物種親緣性較遠。與人類CaMK I相比，淋巴細胞表位具有統(tǒng)計學差異。SmCaMK I能夠定位在成蟲的睪丸和蟲卵，在裂頭蚴中大量表達和特異定位于體表。結論SmCaMK I是參與蟲體生長發(fā)育繁殖的重要蛋白分子，還可能是一個潛在的疫苗靶標蛋白。

曼氏迭宮絳蟲；SmCaMK I；生物信息學分析；原核表達；免疫組織化學定位

曼氏迭宮絳蟲(Spirometramansoni)屬于絳蟲綱、假葉目、迭宮屬。曼氏迭宮絳蟲成蟲主要寄生于貓科動物體內，偶有寄生于人體，但是其中期裂頭蚴可在人體寄生，導致曼氏裂頭蚴病，其危害遠大于成蟲[1]。1882年Manson首次在我國廈門的一具男尸中檢出曼氏裂頭蚴，之后世界各地相繼有病例報告。曼氏裂頭蚴病多見于東亞和東南亞各國，歐洲、美洲、非洲和澳洲也有記錄[2]。目前在我國已有1 000多例病例，分別來自27個省、市、自治區(qū)[3]。感染者年齡為未滿周歲～62歲，以10～30歲感染率最高，各民族均有[4-5]。

人感染裂頭蚴的主要途徑有局部敷貼生蛙肉、吞食生的或未煮熟的蛙肉/蛇肉、誤食感染的劍水蚤[6]。曼氏裂頭蚴可寄生于人體全身部位，可在體內移行，寄生部位多變，其中以寄生在眼部與大腦最為危險，嚴重可導致失明、殘疾甚至危及生命。此外，曼氏裂頭蚴臨床表現(xiàn)各不相同，由于缺乏特異性表現(xiàn)，誤診、漏診現(xiàn)象較為普遍[7]。目前，臨床上也缺乏預防裂頭蚴感染的特異性疫苗。

鈣/鈣調素依賴蛋白激酶(Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中一員[8]。CaMK具有相似的-N端催化域(CaMKⅡ除外)和具有自身抑制功能的-C端調節(jié)域，在與Ca2+/CaM結合之前，激酶保持在一個抑制狀態(tài)，在兩者結合后被激活[9]。鈣/鈣調素依賴蛋白激酶I (Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase I, CaMK I)有4種亞基(α、β、γ、δ)，分子量在38～42 kDa之間，幾乎在所有細胞當中表達[10]。Skelding等人發(fā)現(xiàn)，CaMK I參與細胞周期的G1期，并對細胞周期與細胞增殖的調節(jié)有著非常重要的影響[11]。CaMK I含有絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，能使許多細胞內底物磷酸化，從而誘發(fā)一系列的作用，如受精[12]、成骨細胞分化[13]、維持血管張力[14]、神經突觸增生[15]、免疫和炎癥反應[16]、醛固酮的合成于釋放[17]、對細胞周期的調控[18]等。姚利曉等人發(fā)現(xiàn)一種日本血吸蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其免疫血清具有免疫保護作用，能有效的殺傷日本血吸蟲童蟲，影響童蟲發(fā)育[19]。

因此，我們推測SmCaMK I可能對于曼氏迭宮絳蟲的生長發(fā)育有著重要的作用，為此，本次實驗通過進行SmCaMK I的生物信息學的分析、基因克隆和獲得蛋白以及其在蟲體中的組織定位分析，為進一步研究SmCaMK I在曼氏迭宮絳蟲生長發(fā)育、免疫逃避和疫苗研發(fā)等奠定物質基礎和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 曼氏迭宮絳蟲CaMK I全長序列、pET-28α(+)質粒全長為5 369 bp，是兩端均帶有His標簽的原核表達質粒，含有卡那霉素抗性基因，均由海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院寄生蟲教研室基因組文庫提供。大腸桿菌DH5α、BL21(DE)、PCR Mix、DL2000、DL15000、質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化技術有限公司；EcoR I限制性核酸內切酶、XolI限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶，蛋白質Marker、預染蛋白Marker購自Thermo Fisher Scientific公司；Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rat IgG(H+L)購自美國proteintech公司；His-Tag Mouse monoclonal antibody、Cy3標記的山羊抗小鼠IgG (H+L)購自碧云天生物科技有限公司；增強型DAB顯色試劑盒購自北京索來寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1SmCaMK I基因的識別 曼氏迭宮絳蟲成蟲cDNA文庫中EST克隆GDTC009_E09通過NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLASTx程序，將基因的編碼氨基酸序列與GenBank中其他物種的同源氨基酸序列進行比對，推測該基因的功能，判斷其是否為全長基因。

1.2.2SmCaMK I氨基酸序列生物信息學分析

1.2.2.1 利用蛋白分析系統(tǒng)Expasy(http://www.expasy.org/)對蛋白的理化性質和功能域進行分析。

1.2.2.2 利用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站下載不同物種的同源蛋白，使用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2.3 使用BepiPred和NetTepi在線軟件對蛋白的淋巴細胞表位進行預測分析。

1.2.3SmCaMK I基因克隆 以曼氏迭宮絳蟲成蟲文庫質粒作為模板，利用PCR的方法進行擴增，特異性引物通過Primer Premier 5.0 和 PCRDESIGN軟件進行設計，上游和下游引物分別是5′-GACGAATTCATGAGTCGCAAAACACCT-3′ (EcoR I)；5′-GACCTCGAGTCACACTTCAGGATTTAC-3′(XhoI)。擴增的反應條件如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35循環(huán)，72 ℃穩(wěn)定10 min。將PCR產物進行純化，利用相同的限制性內切酶進行酶切并與預先酶切好的原核表達載體pET-28α(+)進行連接。將連接產物轉入到大腸埃希菌DH5α中，挑取陽性克隆，進行增菌，提取重組質粒進行雙酶切鑒定和測序驗證。

1.2.4SmCaMK I蛋白表達 將重組質粒轉化入大腸埃希菌BL21中，進行IPTG誘導，8 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。在沉淀中加入5 mmol/L咪唑，使用超聲裂解法裂解細胞，12 000 r/min， 4 ℃離心10 min，棄去上清。在沉淀中依次加入0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L、4 mol/L、6 mol/L、8 mol/L尿素溶液重懸混勻，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，分別收集上清液并做好標記。上清液進行12%SDS-PAGE驗證，選取出目的蛋白含量最多的溶液進行蛋白純化。將得到的上清液進行梯度遞減透析尿素，然后利用0.45 μm濾膜過濾，根據(jù)His柱蛋白純化說明書進行蛋白純化。

1.2.5SmCaMK I免疫大鼠血清制備 將純化得到的SmCaMK I蛋白和佐劑(1∶1)混合進行乳化，免疫SD大鼠。其中初次免疫是用不完全佐劑，之后的3次加強免疫是用完全佐劑。每兩周免疫一次，在免疫后的第8周取血，利用ELISA檢測血清滴度。

1.2.6SmCaMK I的Western Blot鑒定 將純化蛋白進行12%SDS-PAGE跑膠，100V，冰水中電泳1 h左右，轉膜。5%脫脂奶粉常溫封閉2 h。利用PBST進行洗膜，孵育一抗 (His-Tag小鼠血清，1∶1 000；免疫大鼠血清，1∶400)，4 ℃過夜。洗滌之后，分別孵育大小鼠二抗(1∶5 000)，洗滌，然后進行DAB顯色，按照試劑盒進行顯色，出現(xiàn)條帶后放入去離子水中以終止反應。

1.2.7SmCaMK I蟲體免疫組織化學定位 將收集曼氏迭宮絳蟲成蟲和裂頭蚴分別用4%多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋。將包埋的裂頭蚴和成蟲切片，厚度約4～5 μm(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科完成)，切片50 ℃烘干后存于-20 ℃?zhèn)溆?。將切片室溫平?0 min后，60 ℃烤箱烤片40 min。于二甲苯中進行脫蠟，用梯度酒精逐級水化，洗滌。放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，水浴自然升溫至95 ℃，保溫20 min后自然冷卻至室溫進行抗原修復。洗滌后進行正常山羊血清室溫封閉2 h，PBST沖洗。在切片上滴加200 μL稀釋的重組蛋白免疫小鼠血清(1∶200稀釋，稀釋液為1%BSA-PBS)，用免疫前的正常小鼠血清作陰性對照，置于濕盒內4 ℃孵育過夜。次日，洗滌。每張切片加200 μL的紅色熒光Cy3標記的山羊抗小鼠IgG (H+L)(1∶400稀釋)，室溫下濕盒內孵育2 h，洗滌。切片加200 μL組織自發(fā)熒光淬滅劑，室溫避光靜置15 min，洗滌之后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1 蛋白編碼氨基酸序列中功能位點分析 通過同源氨基酸的比對分析，該基因具有完整的編碼閱讀框，并且屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族蛋白。采用NCBI的BLAST對SmCaMK I的結構功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)SmCaMK I有4個活性位點分別為活性位點、ATP 結合位點、多肽底物結合位點、激活環(huán)。分別將細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，EUB632702.1)、多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，CDS40668.1)、人(Homosapiens，NP_003647.1)功能域的氨基酸與SmCaMK I功能域的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)序列一致性為89%、88%、44%。

2.2 系統(tǒng)進化樹 采用MEGA5.0基于NJ法構建系統(tǒng)進化樹，將曼氏迭宮絳蟲、細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、麝貓后睪吸蟲(Opisthorchisviverrini，XP_009163606.1)、華支睪吸蟲(Clonorchissinensis，GAA29101.1)、微小膜殼絳蟲(Hymenolepismicrostoma，CDS32035.1)、家兔(Oryctolaguscuniculus，XP_008248543.1)、大鼠(Rattusnorvegicus，NP_878262.1)、小鼠(Musmusculus，NP_659066.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis，XP_008248543.1)、人(Homosapiens，NP_003647.1)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus，EAL93663.1)的CaMK I氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹。結果如圖1所示，同屬于絳蟲類SmCaMK I與細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的CaMK I同源序列屬于同一進化分支，證明其親緣關系最接近；而與人類、鼠類、原核生物分布于不同的分支，在進化上說明親緣關系較遠。

圖1 SmCaMK I同源氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹Fig.1 The evolution tree of SmCaMK I

2.3 淋巴細胞表位分析 利用BepiPred、NetTepi軟件分析對該蛋白質編碼的氨基酸序列的表位進行分析，發(fā)現(xiàn)SmCaMK I可能有10個潛在的B淋巴細胞抗原表位(aa1-aa17、aa57-aa72、aa129-aa135、aa153-aa161、aa166-aa171、aa195-aa199、aa209-aa219、aa236-aa246、aa262-aa268、aa350-aa355)和5個T淋巴細胞表位(77aa-85aa、93a-101aa、173aa-181aa、188aa-196aa、327aa-335aa)。將SmCaMK I與人類CaMK I抗原表位進行對比發(fā)現(xiàn)，B細胞表位重合率較高，但是對應的編碼氨基酸差異較大，并且T淋巴細胞表位存在統(tǒng)計學差異，如圖2和圖3所示。

圖2 B淋巴細胞表位比對Fig.2 The alignment of B lymphocyte epitopes

圖3 T淋巴細胞表位比對Fig.3 The alignment of T lymphocyte epitopes

2.4SmCaMK I基因的擴增和克隆 利用特異性引物，從曼氏迭宮絳蟲成蟲cDNA文庫中擴增出SmCaMK I基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測在1 000 bp附近有特異性條帶。根據(jù)生物信息學分析ORF Finder分析此基因編碼區(qū)為1 068 bp，說明擴增產物與理論值大小基本符合。將提取的重組質粒使用限制性內切酶EcoR I和XhoI進行雙酶切，分別獲得的基因片段在1 000 bp和5 000 bp附近，如圖4。測序結果表明插入序列與SmCaMK I基因序列一致，上述結果說明重組原核表達質粒構建成功。

M1:DL2 000 DNA Marker；1:SmCaMK I基因；2:pET-28α空質粒；3:pET-28α(+)-SmCaMK I重組質粒；4:pET-28α(+)-SmCaMK I重組質粒雙酶切；M2:DL15 000 DNA MarkerM1: DL2 000 DNA Marker; 1: SmCaMK I gene; 2: pET-28a(+) plasmid; 3: pET-28a(+) SmCaMK I recombinant plasmid; 4: pET-28a(+) SmCaMK I recombinant plasmid was digested by double enzyme; M2: DL15 000 DNA Marker圖4 重組質粒pET-28α(+)-SmCaMK I的PCR及酶切鑒定圖Fig.4 The identification of the pET-28α(+)-SmCaMK I by PCR amplification and digestion with restriction enzymes

M:蛋白Marker；1:大腸桿菌空載未誘導；2:大腸桿菌空載誘導；3:大腸桿菌重組質粒未誘導；4:大腸桿菌重組質粒誘導；5:誘導后菌液上清；6:誘導后菌液沉淀；7:純化蛋白。M:Protein molecular weight markers, lysate of E.coli with pET-28a(+) vector before induction (lane 1) and after induction (lane 2), lysate of E.coli with pET-28a(+)-SmCaMK I before induction (lane 3) and after induction (lane 4), supernatant (lane 5) and precipitant (lane 6) of lysate of E.coli with pET28a(+)-SmCaMK I after induction, and the purified recombinant SmCaMK I protein (lane 7).圖5 SmCaMK I蛋白的表達和純化的12%SDS-PAGE電泳分析Fig.5 Analysis 12%SDS-PAGE of protein expression and purification of SmCaMK I

2.5 蛋白表達及純化 將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21中進行表達，12%SDS-PAGE電泳分析結果如圖5所示，在45 kDa附近有表達條帶，與目的蛋白分子量44.13 kDa基本相符合。蛋白進行純化，得到的純化蛋白條帶位置與預測分子量相符。2.6SmCaMK I的western blot鑒定 圖6顯示，純化蛋白能被His單克隆抗體識別，且能與大鼠免疫血清特異性反應，識別條帶均在40～55 kDa之間，與預測分子量相符合。

A為His單克隆抗體識別；B為SmCaMK I蛋白免疫大鼠的免疫血清識別。A:rSmCaMK I protein was probed by anti-His-tag mouse serum (A) and anti-rSmCaMK I rat serum (B).圖6 SmCaMK I蛋白的His識別和抗原性鑒定Fig.6 His Tag and anti-SmCaMK I rat serum identification of SmCaMK I

2.7SmCaMK I在蟲體中組織定位SmCaMK I能夠定位在成蟲的睪丸和蟲卵，如圖7；在裂頭蚴階段，整個蟲體發(fā)出熒光和特異定位于體表，如圖8。

3 討 論

CaMK I廣泛存在于各組織的細胞中，作為一個細胞內級聯(lián)反應的信號分子[20]，其對于下游靶酶的磷酸化和對細胞周期的調控起著重要的作用，主要在細胞中參與信號轉導和調控細胞增殖。有研究表明使用CaMK抑制劑能抑制分裂間期DNA的復制[21]。CaMK證實是細胞周期過程的介導因子，其中CaMK I是G1期重要的調節(jié)因子[22]。鈣離子是普遍存在的第二信使，在許多生物體和參與眾多的生理過程[23]。在細胞內游離的鈣離子的變化是一種常見的信號轉導，CaMK I是參與介導鈣離子來發(fā)揮作用的[24]。在克氏錐蟲研究中發(fā)現(xiàn)，CaMK參與調節(jié)寄生蟲繁殖所需的血紅蛋白誘導的細胞信號通路[25]。

通過完整編碼閱讀框的預測，得知SmCaMK I是一個全長基因，根據(jù)保守功能域得知其編碼氨基酸序列中存在4個活性位點，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白家族。將編碼的氨基酸序列進行蛋白理化性質預測得知，蛋白質理論等電點9.35，理論分子量44.13 kDa。氨基酸溶劑可及性和親疏水性發(fā)現(xiàn)，編碼SmCaMK I的氨基酸有44.79%包埋在蛋白內部，55.21%暴露在溶液界面，不穩(wěn)定系數(shù)39.47，脂肪系數(shù)90.11，親水指數(shù)-0.416，說明SmCaMK I是一個穩(wěn)定的疏水蛋白。在后續(xù)的蛋白表達過程中發(fā)現(xiàn)，經過IPTG誘導表達，目的蛋白主要在細胞沉淀物中存在，上清中蛋白含量極低，該結果與預測結果相符，純化蛋白的12%SDS-PAGE條帶顯示分子量大小與預測值相吻合。

SmCaMK I編碼的功能位點氨基酸序列比對中發(fā)現(xiàn)曼氏迭宮絳蟲與細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的CaMK I的編碼氨基酸序列一致性均達到88%以上，可能是因為同屬于扁形動物門的絳蟲綱[1]。然而與人類的CaMK I一致性僅僅只有44%。此外，在構建的系統(tǒng)進化樹中，我們發(fā)現(xiàn)寄生蟲和哺乳動物、微生物屬于不同的分支，曼氏迭宮絳蟲與其他絳蟲如細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲同屬一個分支，親緣關系最近，而與人類的親緣性相對較遠，這一結果與氨基酸比對分析結果一致。通過淋巴細胞表位預測發(fā)現(xiàn)SmCaMK I與人類的CaMK I序列中B淋巴細胞表位重合率較高，但是重合部分氨基酸序列差異較大，并且T淋巴細胞表位對比中發(fā)現(xiàn)兩者表位分布具有顯著性差異且發(fā)現(xiàn)表位153aa-161aa空間位置與SmCaMK I功能位點重合。將純化蛋白進行免疫大鼠制備免疫血清，通過血清滴度測定顯示出較高的滴度，說明SmCaMK I具有良好的免疫原性。此外，Western Blotting結果顯示該蛋白具有良好的免疫反應性。這些結果充分說明了SmCaMK I是一個非常有研究價值的疫苗候選分子。

A&B成蟲在白光下拍照；C&D分別是免疫大鼠血清識別和正常大鼠血清識別的熒光下拍照，放大倍數(shù)為20x，T:睪丸；E：蟲卵。A&B were corresponding to bright fields at adult worms stage; C&D were respectively treated with anti-rSmCaMK I rat serum and na?ve rat serum in the fluorescent light. The images were magnified at 20x. T: testicle; E: eggs圖7 SmCaMK I在成蟲組織中的定位Fig.7 Immunohistochemical localization of SmCaMK I in adult worm

A&B成蟲白光；C&D分別是免疫大鼠血清識別的熒光和正常大鼠血清識別的熒光下拍照，放大倍數(shù)為20x，t:體表。A&B were corresponding to bright fields at sparganum stage; C&D were respectively treated with anti-rSmCaMK I rat serum and na?ve rat serum in the fluorescent light. The images were magnified at 20x. t: tegument圖8 SmCaMK I在裂頭蚴組織中的定位Fig.8 Immunohistochemical localization of SmCaMK I in sparganum

在蟲體免疫組織化學定位中，SmCaMK I能夠在成蟲的生殖器官睪丸和蟲卵中大量表達，尤其在蟲卵中，能夠在卵殼上有特異性的定位，這些器官都是蟲體生長發(fā)育繁殖后代的主要部位。CaMK I是參與CaM介導的細胞內Ca2+信號傳導。在曼氏裂體吸蟲研究中發(fā)現(xiàn)，鈣離子能夠通過調節(jié)卵殼合成材料來參與蟲卵的形成[26-27]，并且還有研究發(fā)現(xiàn)曼氏裂體吸蟲的CaM免疫感染寄生蟲的小鼠，能夠顯著減少蟲卵數(shù)量[28]。另外，CaMK I屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。姚利曉等人在東方田鼠血清中發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抗體在殺傷日本血吸蟲中具有重要作用，并且能有效抑制該酶活性，破壞生物體內正常的磷酸化以及去磷酸化的過程，從而干擾日本血吸蟲童蟲的生長發(fā)育[19]，這些實驗結果都充分地證明了SmCaMK I可能在蟲體生長過程中發(fā)揮非常重要的作用。此外，還意外發(fā)現(xiàn)，SmCaMK I能夠在裂頭蚴蟲體內大量表達，還特異定位在體表，寄生蟲體表是一個非常重要的部位，是參與蟲體吸收營養(yǎng)、排泄代謝產物、釋放保護因子。此外，蟲體體表還是直接接觸宿主的部位，也是寄生蟲產生免疫逃避的部位。CaMK I之所以能夠定位在體表可能是因為調節(jié)Ca2+離子，來參與了寄生蟲肌肉和體表的運動。許多的研究證實了，蟲體體表蛋白是一個很好的疫苗候選分子[29]。這進一步證實了，SmCaMK I為今后開發(fā)疫苗提供夯實的理論依據(jù)。

綜上所述，SmCaMK I不僅是一個參與信號傳導的重要蛋白，還是一個參與蟲體生長發(fā)育繁殖的因子，并且還可能是一個潛在的疫苗靶標蛋白。

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Sequence bioinformatics analysis, expression and identification of Calcium/ Calmodulin-dependent protein kinase I (CaMK I) fromSpirometramansoni

LI Yi-ji1,2, CHEN Xin-xin2, FU Rui-jia1,2, CHEN Xiao-jing2, LYU Gang1,2, LIANG Pei1,2,3

(1.KeyLaboratoryofTranslationalMedicineforTropicalDiseases,MinistryofEducation,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;2.SchoolofTropicalMedicineandLaboratoryMedicine,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;3.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China)

The aim for this study is predicting the biological characteristics and potential functions of Calcium/calmodulin dependent protein kinase I (CaMK I) fromSpirometramansoni(SmCaMK I), and cloning it into prokaryotic expression vector, as well as performing immunohistochemical localization, which paved the way for the further study. The nucleotide sequence homology analysis, the conserved sites prediction the physical and chemical parameters and the lymphocyte epitope ofSmCaMK I were performed by NCBI website and online software. The evolution tree was built by MEGA5.0 software. In addition, the CaMK I genes was amplified and cloned into the expression vector pET-28α(+). The protein was expressed and purified, as well as used to prepared for anti-rSmCaMK I rat serum, which was used to perform immunohistochemical localization in parasites.SmCaMK I was a full length gene, composed of 1 068 bp and encoded 355 amino acids. What's more, the deduced amino acid sequence shared above 88% identities withEchinococcusgranulosusandEchinococcusmultilocularis, but 44% identity withHomosapiens. The analysis of system evolution tree showed that the genetic relationship betweenSmCaMK I was the closest and CaMK I from Taenia and far from other species. The lymphocyte epitope prediction showed obviously different betweenSmCaMK I and CaMK I ofHomosapiens. The western Blot results indicate thatSmCaMK I has great immunogenicity. Immunohistochemical localization detection showed thatSmCaMK I was expressed in the testis and eggs of adult worms, and also extensive distributed in tissue and tegument of sparganum. The study indicated thatSmCaMK I is a critical protein involving in parasite's growth and reproduction, and may be a potential vaccine target protein.

Spirometramansoni;SmCaMK I; bioinformatics analysis; prokaryotic expression; immunohistochemical localization

Liang Pei, Email: liangpeilp2012@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.002

國家自然科學基金(No.81560332&No.81260254)和海南省自然科學基金(No.814289)聯(lián)合資助

梁 培，Email：liangpeilp2012@163.com

1.海南醫(yī)學院熱帶病轉化醫(yī)學教育部重點實驗室，海口 571199； 2.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，?？?571199； 3.海南大學農學院，?？?570228

R383

A

1002-2694(2016)12-1044-07

2016-07-20；

2016-10-19

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 81560332 & No. 81260254),and the Natural Science Foundation of Hainan Province (No. 814289)