張袁骕程向東徐志遠呂 航杜義安湯加寧羅華榮

槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45細胞生長和轉(zhuǎn)移的實驗研究

張袁骕1程向東2徐志遠2呂 航2杜義安3湯加寧1羅華榮4

目的研究槐耳清膏對人胃癌MKN-45細胞在裸鼠體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，并探討其作用機制。方法采用BALB/c裸鼠建立人胃癌MKN-45細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，隨機分為槐耳清膏組、空白對照組，每組20只。建模后，每5天測量裸鼠荷瘤并計算腫瘤相對體積（RTV）；用藥5周后處死裸鼠，Real-time qPCR檢測腫瘤組織Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和VEGF表達水平。結(jié)果槐耳清膏組末次測得的足墊瘤RTV為（662.75±450.66）mm3，明顯小于空白對照組的（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01）?；倍甯嘟M淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率8/20（40%）與對照組15/20（70%）相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?；倍甯嘟M腫瘤組織Wnt、β-catenin、N-cadherin和VEGF的△CT值分別為（11.36±1.32）、（11.31±1.76）、（12.82±2.22）、（13.22±1.52），均高于對照組的（9.48±2.07）、（9.37±1.88）、（7.74±2.64）、（11.04±1.61），而E-cadherin的△CT值（8.26±2.39）低于對照組的（10.64± 1.48）（P＜0.05）。結(jié)論 槐耳清膏可抑制人胃癌MKN-45細胞在裸鼠上的生長及轉(zhuǎn)移，其機制可能與抗血管生成和阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。

裸鼠；槐耳清膏；人胃癌MKN-45細胞；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

KEY WORDSnude mice;trametes robiniophila;human gastric cancer cell line MKN-45;lymphatic metastasis; EMT

胃癌（gastric cancer，GC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大常見原因，僅僅2012年估計全球范圍內(nèi)就有新發(fā) 951,600例和723100死亡病例[1]。目前早期發(fā)生的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是胃癌預(yù)后不佳的主要原因，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是主要轉(zhuǎn)移擴散途徑之一。所以有必要尋找一種有效抑制胃癌轉(zhuǎn)移的治療方法，降低胃癌的轉(zhuǎn)移及死亡。槐耳是一種在中國已經(jīng)使用了將近1600年的藥用真菌，而近幾十年才發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤特性，并逐漸應(yīng)用于腫瘤的輔助治療之中。研究[2-4]表明，槐耳可以促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、增加化療療效及免疫系統(tǒng)功能。盡管槐耳的抗腫瘤特性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但至今相關(guān)的研究成果仍是相當有限，且其確切的抗腫瘤機制仍是未知的。本實驗采用將人胃癌MKN-45細胞系接種于裸鼠足墊皮下，建立胃癌裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，并用槐耳多糖提取物灌胃方式對其進行治療，觀察腫瘤生長情況及治療效果，旨在為槐耳對抗胃癌生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞株 4～6周齡BALB/c無胸腺裸鼠40只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證 [SCXK（滬）2013-6016]。人胃癌MKN-45細胞株購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶（美國Gibco公司）；槐耳清膏（啟東蓋天力藥業(yè)有限公司）溶于生理鹽水中，配成200mg/mL，20μm濾膜過濾除菌，4℃保存待用；RNA提取試劑盒（AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit，LOT：148052230，德國QIAGEN公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（LOT：AK5102，日本TaKaRa公司）；SYBR染料法實時熒光定量試劑盒（LOT：AK6406，日本TaKaRa公司）。

1.3 主要儀器 37℃恒溫細胞CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司，型號B5060EU）；生物安全柜（美國Thermo公司，型號Forma Class II，A2）；倒置相差顯微鏡（德國LEICA公司，型號DM2000）；石蠟切片機（德國LEICA公司，型號RM2235）；臺式高速離心機（力新儀器，型號Neofuge 23R）；臺式點動離心機（其林貝爾儀器制造有限公司，型號LX-200）；Real-time qPCR儀器（美國Applied Biosystems公司，7900HT Fast Real-time PCR System）。

2 實驗方法

2.1 接種細胞培養(yǎng)及準備 人胃癌MKN-45細胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；觀察細胞，當細胞處于對數(shù)生長期，用PBS洗滌細胞去除殘留培養(yǎng)基，再用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化后用PBS制成單細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，濃度為5×107/mL，制備好的細胞懸液于冰水浴中保存，于30min內(nèi)進行接種。

2.2 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型的建立 無菌條件下，取上述MKN-45細胞懸液，50μL/只接種于裸鼠右下肢足墊，觀察人胃癌MKN-45細胞在裸鼠足墊生長和成瘤及轉(zhuǎn)移情況。

實驗分組：將建模后的40只裸鼠隨機分成為槐耳清膏組[槐耳清膏5g/（kg·2d）灌胃]、空白對照組[生理鹽水0.5mL/2d灌胃]，每組各20只。

2.3 腫瘤體積測量 建模2周后，每5天測量并記錄接種MKN-45細胞足墊大小變化，計算足墊瘤相對體積（relative tumor volume，RTV）=πxyz/6（x為長度，y為寬度，z為厚度）。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移觀察：連續(xù)給藥5周后處死足墊成瘤的裸鼠，解剖腘窩淋巴結(jié)，經(jīng)常規(guī)病理HE染色，判斷是否存在轉(zhuǎn)移，以轉(zhuǎn)移數(shù)/成功建模數(shù)計算淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

2.4 Real-time qPCR檢測足墊瘤組織中相關(guān)mRNA表達 留取實驗裸鼠的足墊瘤組織，用RNA試劑盒提取其總RNA，用紫外分光光度計在260和280nm處測吸光度D值，計算RNA含量和純度，按cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進行操作，取3μgRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR引物均由生工生物股份有限公司合成，其中β-Actin為內(nèi)參照，見表1。用Real-time qPCR方法檢測上述相關(guān)mRNA的表達量，反應(yīng)體系（20μL）：SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2x）10μL，上下游引物各 0.8μL，cDNA模板 2μL，ROX Reference Dye（50x）0.4μL，dH2O6μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，30sec；40個循環(huán)：95℃，3sec；60℃，30sec。

2.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，組間比較采用t檢驗，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 Real-time qPCR引物序列

3 結(jié) 果

3.1 槐耳清膏抑制裸鼠模型的腫瘤生長 通過觀察胃癌細胞MKN-45足墊種植裸鼠模型的腫瘤生長變化來評估槐耳的抗腫瘤效應(yīng)。對照組足墊瘤RTV增長速率明顯高于實驗給藥組，末次測得槐耳清膏組的足墊瘤RTV為（662.75±450.66）mm3，明顯小于空白對照組的RTV（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01），見表2。此外，槐耳組裸鼠的活躍度明顯好于對照組，而體質(zhì)量及進食量無明顯差異。

表2 兩組小鼠建模后足墊瘤相對體積變化（RTV）（±s）

表2 兩組小鼠建模后足墊瘤相對體積變化（RTV）（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01

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3.2 槐耳清膏抑制腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 于建模后5周處死裸鼠并解剖腘窩，見圖1（插頁）；留取腘窩淋巴結(jié)組織進行常規(guī)病理HE染色檢測，判斷其轉(zhuǎn)移情況見圖2（插頁）。腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移如表3所示，槐耳組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（40%）與對照組（70%）相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 兩組小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（只）

3.3 Real-time qPCR測定足墊瘤組織相關(guān)mRNA表達 mRNA的表達水平以相對表達量△CT值進行分析，即△CT=CT目的-CT內(nèi)參。對照組與實驗組足墊瘤組織中提取總RNA，通過RT-PCR檢測Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、VEGF的表達。我們發(fā)現(xiàn)在給予槐耳清膏灌胃治療后的足墊腫瘤組織中Wnt、β-catenin、N-cadherin、VEGF的△CT值均高于對照組，而E-cadherin的△CT值低于對照組（P＜0.05），見表4。這些結(jié)果表明槐耳清膏可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來阻礙EMT相關(guān)進程，進而抑制人胃癌MKN-45細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表4 兩組小鼠相關(guān)mRNA熒光定量△CT值比較（±s）

表4 兩組小鼠相關(guān)mRNA熒光定量△CT值比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

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4 討論

槐耳清膏是藥用真菌槐耳的提取物，其主要活性成分是多糖蛋白，含多種氨基酸及微量元素，已廣泛用于臨床的抗腫瘤治療中，但其確切的機制尚未完全清楚。本實驗通過槐耳清膏灌胃方式作用于人胃癌MKN-45細胞的裸鼠模型，檢測其種植瘤大小變化及腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，本研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可以明顯抑制腫瘤細胞在裸鼠上的生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，明確其抗腫瘤作用。該實驗結(jié)果與李立新等[5]所做的槐耳清膏對荷瘤裸鼠肝癌生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用一致。

血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件[6]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤細胞分泌的這一種細胞因子，其通過促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移及新生血管形成在腫瘤的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用[7-8]。對組織標本的Real-time qPCR檢測結(jié)果表明，VEGF的表達明顯受到抑制，我們判斷槐耳清膏可能通過抑制腫瘤細胞分泌VEGF，進而抑制腫瘤支持血管的生成，限制了腫瘤進一步的生長及轉(zhuǎn)移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞來源的惡性腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要生物學過程[9]。大量研究表明，多種信號通路參與腫瘤的EMT過程，如Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β）、Notch信號通路等[10-12]。在腫瘤細胞EMT過程中，緊密連接蛋白ZO-1（zonula occluden-1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等上皮標志物表達下調(diào)，波形蛋白（vimentin）、N型鈣黏蛋白（N-cadherin）等間質(zhì)標志物表達上調(diào)，使上皮來源的腫瘤細胞失去其細胞極性,疏松細胞間的連接，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組。這一系列的改變導致腫瘤細胞的黏附能力下降，進而增加遷移運動能力，使得腫瘤細胞更易于脫離原有位置，發(fā)生侵襲或隨血行、淋巴等途徑轉(zhuǎn)移到體內(nèi)遠隔部位，重新定位于新的器官或組織，最終導致腫瘤的多發(fā)轉(zhuǎn)移。本研究表明，經(jīng)槐耳清膏灌胃治療后，其腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率存在明顯差異，且Real-time qPCR檢測表明腫瘤組織中Wnt、β-catenin、N-cadherin這些相關(guān)mRNA的表達減少，而E-cadherin增加。當Wnt信號明顯受到抑制時，β-catenin無法累積進入核內(nèi)，從而降低EMT相關(guān)靶基因的激活，分別降低N-cadherin和升高E-cadherin的表達，增強細胞之間粘附能力，阻礙腫瘤細胞EMT進程，降低腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

本研究對于臨床出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者應(yīng)用槐耳治療提供了一定的依據(jù)，但是由于研究中的細胞種類單一，不足以代表所有類型腫瘤的情況，故仍需進一步擴大細胞類型來深入探討槐耳清膏對不同腫瘤的影響。

總之，槐耳清膏在裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中對人胃癌MKN-45細胞在裸鼠上的生長和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，且可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路干預(yù)EMT相關(guān)進程，這些結(jié)果都提示槐耳清膏對于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者存在一定的療效。

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］Wang X，Zhang N，Huo Q，et al.Anti-angiogenic and antitumor activities of Huaier aqueous extract［J］.Oncology reports，2012，28（4）：1167-1175.

［3］Ren J，Zheng C，F(xiàn)eng G，et al.Inhibitory effect of extract of fungi of Huaier on hepatocellular carcinoma cells［J］.允ournal of Huazhong University of Science and Technology [Medical Sciences].2009，29（2）：198-201.

［4］Sun Y，Sun T，Wang F，et al.A polysaccharide from the fungi of Huaier exhibits anti-tumor potential and immunomodulatory effects［J］.Carbohydrate polymers，2013，92（1）：577-582.

［5］李立新，葉勝龍，王艷紅，等.槐耳浸膏干預(yù)荷瘤裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移的實驗研究［J］.肝臟，2006，11（6）：404-406.

［6］Al-Moundhri MS，Al-Shukaili A，Al-Nabhani M，et al.Measurement of circulating levels of VEGF-A，-C，and-D and their receptors，VEGFR-1 and-2 in gastric adenocarcinoma［允］.World journal of gastroenterology：W允G，2008，14（24）：3879-3883.

［7］Frankel AE，Gill PS.VEGF and myeloid leukemias［J］.Leukemia research，2004，28（7）：675-677.

［8］Finn RS，Zhu AX.Targeting angiogenesis in hepatocellular carcinoma：focus on VEGF and bevacizumab［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2009，9（4）：503-509.

［9］Lopez-Novoa JM，Nieto MA.Inflammation and EMT：an alliance towards organ fibrosis and cancer progression［J］. EMBO molecular medicine，2009，1（6-7）：303-314.

［10］Kalluri R，Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition［J］.The允ournal of clinical investigation，2009，119（6）：1420-1428.

［11］Huber MA，Kraut N，Beug H.Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression［J］.Current opinion in cell biology，2005，17（5）：548-558.

［12］Fuxe J，Vincent T，Garcia de Herreros A.Transcriptional crosstalk between TGFβ and stem cell pathways in tumor cell invasion：role of EMT promoting Smad complexes［J］. Cell Cycle，2010，9（12）：2363-2374.

（收稿：2015-09-20 修回：2015-10-13）

Trametes Robiniophila Restrains the Growth and Metastasis of Gastric Cancer Cell Line MKN-45 in Mice

ZHANG Yuansu1,CHENG Xiangdong2,XU Zhiyuan2,LV Hang2,DU Yian3,TANG允ia'ning1,LUO Huarong4.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Gastrointestinal Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;3 Department of Abdominal Surgery,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;4 Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou(317000),China

ObjectiveTo study the effects of trametes robiniophila on the growth and metastasis of human gastric cancer cell MKN-45 in nude mice,and to explore the mechanism.MethodsBALB/c nude mice were inoculated with MKN-45 cells to establish the lymph node metastasis model of human gastric carcinoma.After the model was successfully established,40 mice were randomly divided into control group and trametes robiniophila group（n=20 in each group）.After the mass formed,the caliper was used to measure the tumor size every 5 days. The relative tumor volume（RTV）was calculated.After 5 weeks,the nude mice were killed for determination of Wnt,beta-catenin,N-cadherin,VEGF mRNA expression by Real-time qPCR.ResultsAfter 5 weeks of drugs intervention,the RTV in trametes robiniophila group were less than that in control group（662.75±450.66mm3 vs 1611.85±611.83mm3,P＜0.01）.The lymph node metastasis rate of trametes robiniophila group was 8/20（40%）,lower than that in control group 15/20（75%）（P＜0.05）.Compared with control group,the△CT value of Wnt,β-catenin, N-cadherin,and VEGF in trametes robiniophila groupwere higher（11.36±1.32 vs 9.48±2.07，11.31±1.76 vs 9.37± 1.88，12.82±2.22 vs 7.74±2.64，13.22±1.52 vs 11.04±1.61）,the△CT value of E-cadherin were lower（8.26±2.39 vs 10.64±1.48）,with all P＜0.05.ConclusionTrametes robiniophila can inhibit the growth and lymphatic metastasis of human gastric cancer in nude mice,which might be related with anti-angiogenesis and setting the epithelialmesenchymal transition（EMT）process back.

浙江省中醫(yī)藥重點研究計劃（No.2012ZZ002）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.20131279004719）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No. 2015ZA090）

1浙江中醫(yī)藥大學研究生院（杭州 310053）；2.浙江省中醫(yī)院胃腸外科（杭州 310006）；3浙江省腫瘤醫(yī)院腹部外科（杭州 310022）；4浙江省臺州醫(yī)院病理科（臺州 317000）

程向東，Tel：13968032995；E-mail：abcsurg@gmail.com