吳永輝林 曉羅冬嬌鐘永翔王恩智王鑫華

三氧化二砷對(duì)VEGF誘導(dǎo)人骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞TRAF-2和STAT-6表達(dá)的影響

吳永輝1林 曉1羅冬嬌2鐘永翔1王恩智1王鑫華1

目的通過(guò)觀察三氧化二砷（As2O3）對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)人骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF-2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（STAT-6）表達(dá)的影響，探討As2O3治療骨肉瘤的作用機(jī)制。方法分別采用CCK8法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、TRAF2和STAT-6的表達(dá)。結(jié)果2μmol/L的As2O3對(duì)SaOS-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)57%（0.57±0.03比0）（P＜0.01），使VEGF誘導(dǎo)作用顯著降低（0.42±0.02）（P＜0.05），TRAF-2及STAT-6的表達(dá)也顯著下降（分別為：149.00±7.21比167.33±8.02；1.29±0.12比2.53±0.67）（P均＜0.05）。結(jié)論As2O3可能通過(guò)TRAF-2和STAT-6途徑對(duì)SaOS-2細(xì)胞的生長(zhǎng)呈劑量相關(guān)的抑制作用。

骨肉瘤；SaOS-2細(xì)胞；As2O3；TRAF-2；STAT-6;VEGF

骨肉瘤是一種起源于間葉組織最常見的骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤，多數(shù)病例在原發(fā)灶較小的早期即發(fā)生廣泛的轉(zhuǎn)移，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。研究表明，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與炎癥因子及凋亡的異常表達(dá)密切相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體（TNF-R）相關(guān)因子（TRAF）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）參與了癌癥的發(fā)病過(guò)程[1]，但它們?cè)诠侨饬霭l(fā)病機(jī)制中所起的作用如何國(guó)內(nèi)報(bào)道甚少。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）被認(rèn)為是一種低毒、有效的化療藥物，已在Ⅲ期成骨肉瘤、尤文肉瘤患者取得較好的近期臨床療效[2]，但其具體機(jī)制不清。本研究通過(guò)觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endotheilial growth factor，VEGF）誘導(dǎo)SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞TRAF-2和STAT-6表達(dá)及As2O3對(duì)其表達(dá)的影響，探討As2O3治療骨肉瘤的機(jī)制，為臨床治療提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SaOS-2細(xì)胞株購(gòu)于上海細(xì)胞所，VEGF購(gòu)于PROSPEC公司，一抗TRAF2抗體購(gòu)于abcam公司（批號(hào)ab12122），注射用As2O3由北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司產(chǎn)生（批號(hào)20130304）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 復(fù)蘇SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞，細(xì)胞在1640培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清）（購(gòu)于gibco公司），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)3111，Thermo公司生產(chǎn)）中培養(yǎng)，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別給予VEGF（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）（命名為 V10組、V50組、V100組）、As2O3（1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L）（分別命名為 A1組、A2組、A4組）、VEGF 100ng/mL聯(lián)合As2O3 2μmol/L（命名為A2+100組）及細(xì)胞對(duì)照組（不加VEGF或As2O3）。

1.3 CCK-8 檢測(cè)：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞，細(xì)胞濃度為3.5×103/孔，加藥后繼續(xù)置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。使用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度（OD）值，具體操作方法按說(shuō)明書進(jìn)行。每組分別做3次平行實(shí)驗(yàn)，每孔細(xì)胞重復(fù)3次檢測(cè)取其平均值，并設(shè)空白組調(diào)整。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組的OD值-樣品組的OD值）/對(duì)照組的OD值×100%，細(xì)胞活力=樣品組的OD值/對(duì)照組的OD值×100%。

1.4 總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-qPCR）測(cè)定STAT-6表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞密度為每孔2× 105個(gè)，細(xì)胞加藥培養(yǎng)48h后，將細(xì)胞消化收集，加入Trizol 1mL裂解細(xì)胞提取總RNA（購(gòu)自Generay公司，批號(hào)1305G09），取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測(cè)，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長(zhǎng)吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續(xù)RT-qPCR所需。并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，批號(hào)00141145），實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)STAT-6的表達(dá)（qPCR試劑Super-Real Premix Plux購(gòu)自TIANGEN公司，批號(hào)#M2029）。引物序列（由上海捷瑞公司合成）如下：STAT-6的上游引物5’-GGCAACCAAGACAACAATG-3’，下游引物5’-：TGCTGATGAAGCCAATGAT-3’，PCR產(chǎn)物大小為385bp；內(nèi)參GAPDH的上游引物5’-AGAAG GCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCA TCCACAGTCTTC-3’，PCR產(chǎn)物大小258bp。實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)條件如下：50℃ 3min、95℃15min、95℃ 10s、59℃ 20s、72℃ 30s（40循環(huán)）、95℃10s（融解曲線），退火溫度為60度。每個(gè)樣本重復(fù)3次試驗(yàn)，通過(guò)觀察樣本擴(kuò)增曲線和熔解曲線了解實(shí)驗(yàn)情況，同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參基因GAPDH檢測(cè)（定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System），結(jié)果分析采用比較 CT值法：△CT實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組= CTSTAT-6-CTGAPDH，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組，基因相對(duì)表達(dá)量（RQ）采用2-△△CT方法計(jì)算。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定TRAF-2表達(dá) 收集加藥后細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩遍，1500rpm離心10min（臺(tái)式低速離心機(jī)：80-2型，上海醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS洗滌細(xì)胞兩遍，同上離心后，0.1%曲拉通室溫破膜30min，再次如上離心，10%BSA室溫封閉30min，離心棄封閉液，以100μl 10%BSA重懸細(xì)胞，加入0.2μg TRAF2抗體（0.1μg/105個(gè)細(xì)胞），室溫孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞二遍，離心后沉淀物以100μL 10%BSA重懸細(xì)胞，加入0.2μg FITC-熒光二抗（0.1μg/105個(gè)細(xì)胞），室溫避光孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞二遍，1500rpm離心10min，500μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)（Accuri C6流式細(xì)胞儀由BD公司生產(chǎn)），門內(nèi)收集5000個(gè)細(xì)胞，記錄平均熒光強(qiáng)度（meanfluorescence intensity，MFI）。另設(shè)空白對(duì)照組（不加抗體，其他處理同上）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，Levene法檢驗(yàn)方差齊性。多組間兩兩比較方差齊時(shí)應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)應(yīng)用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞活力及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 CCK-8細(xì)胞活力分析顯示，V100組細(xì)胞生長(zhǎng)活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），V50組、V10組的細(xì)胞生長(zhǎng)活力與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A2組、A4組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于對(duì)照組（P均＜0.01），A1組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A2+100組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著低于A2組（P＜0.05），見表1-2。

表1 VEGF誘導(dǎo)SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活力（±s）

表1 VEGF誘導(dǎo)SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活力（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組V10組V50組V100組濃度（mg/mL）0 10 50 100株數(shù)3 3 3 3細(xì)胞活力1 1.12±0.07 1.14±0.05 1.50±0.10*

表2 As2O3對(duì)SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（±s）

表2 As2O3對(duì)SaOS-2人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與A2組比較，△P＜0.05

?

2.2 STAT-6 mRNA表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，目的基因的熔解曲線均為單一峰，熔解溫度為87.5℃。V100組STAT-6 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），A2+100組顯著低于V100組（P＜0.05），見表3。

表3 各組STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與V100組比較，▲P＜0.05

組別對(duì)照組V100組A2+100組株數(shù)3 3 3 STAT-6 RQ值（2-△△CT）1 2.53±0.67* 1.29±0.12▲TRAF-2（MFI值）136.33±6.11 167.33±8.02** 149.00±7.21▲

2.3 TRAF-2蛋白表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，V100組TRAF-2蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），A2+100組顯著低于V100組（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAF-2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

TRAF家族是一種細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有死亡域結(jié)構(gòu)的TNF-R超家族成員之一，最初作為直接結(jié)合胞質(zhì)區(qū)TNF-R超家族的信號(hào)接頭，也具有E3泛素連接酶的活性并激活下游區(qū)的信號(hào)靶點(diǎn)。依賴TRAFs激活的具有代表性的信號(hào)通路為NF-κBs、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶（MAPKs）和干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）[3]。它具有重要的生理作用，能調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫、胚胎發(fā)育、組織動(dòng)態(tài)平衡、應(yīng)激反應(yīng)、骨新陳代謝、炎癥及腫瘤等疾病[4-5]。抑制TRAF-2介導(dǎo)的NF-κB的活性可促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白質(zhì)1（AP-1）的產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)節(jié)TRAF-2的途徑可作為抗癌和抗炎的治療藥物[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，TRAF-2和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以復(fù)合物的形式激活允NK及P38信號(hào)通路，參與人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期阻止。本研究發(fā)現(xiàn)，加入VEGF后人骨肉瘤細(xì)胞TRAF-2的表達(dá)增加，提示VEGF能誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞增加分泌TRAF-2，推測(cè)VEGF可能通過(guò)TRAF-2的途徑促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。

STAT家族是一種存在于胞漿并在激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白家族，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能。廣泛表達(dá)于機(jī)體不同類型的細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理功能的調(diào)控，并與炎癥、腫瘤和免疫反應(yīng)關(guān)系密切。其機(jī)制可能通過(guò)允AK/STAT信號(hào)通路參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、移行和侵襲[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤STAT-3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于骨軟骨瘤，且與是肺轉(zhuǎn)移及Enneking分期有關(guān)，認(rèn)為STAT-3與骨肉瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)；可能是STAT-3的過(guò)度激活抑制了腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，加入VEGF后人骨肉瘤細(xì)胞STAT-6的表達(dá)增加，提示VEGF能誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞增加分泌STAT-6，推測(cè)VEGF可能通過(guò)STAT-6的途徑促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。

本研究進(jìn)行CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，V100組顯著高于V50組及對(duì)照組，V50組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示100ng/mL的VEGF對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用；A2組、A4組顯著低于對(duì)照組，A1組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示低濃度（1μmol/ L）As2O3對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯作用，中濃度（2μmol/L）和高濃度（4μmol/L）有明顯抑制作用。故本研究采用100ng/mL VEGF聯(lián)合2μmol/L As2O3，觀察As2O3的治療作用。

以往研究發(fā)現(xiàn)，1μmol/L以上濃度的As2O3可明顯地抑制MG-63骨肉瘤細(xì)胞增殖，抑制率可達(dá)70%，細(xì)胞呈典型的凋亡改變，c-myc mRNA被明顯抑制，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[10]。在胃癌細(xì)胞系也取得相似的結(jié)果[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCK8細(xì)胞活力分析顯示，A2組、A4組骨肉瘤細(xì)胞的抑制率高于對(duì)照組，而A1組與對(duì)照組無(wú)差異。提示1μmol/L的As2O3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用不明顯，但隨著作用濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，具有一定的量-效關(guān)系。A2+100組的細(xì)胞抑制率、TRAF-2 和STAT-6低于A2組，提示2μmol/L的As2O3能抑制VEGF對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，推測(cè)As2O3對(duì)骨肉瘤具有一定的治療作用。

綜上所述，As2O3能抑制 VEGF對(duì)骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，2μmol/L的As2O3濃度能抑制骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞的活力、TRAF-2和STAT-6的表達(dá)。

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（收稿：2015-08-13 修回：2015-10-07）

Effects of Arsenic Trioxide on the Expression of TRAF-2 and STAT-6 on Human Osteosarcoma SaOS-2Cell Line Induced by VEGF

WU Yonghui1,LIN Xiao1,LUO Dongjiao2,ZHONG Yongxiang1,WANG Enzhi1, WANG Xinhua1. 1 Department of Osteology(WU Yonghui,LIN Xiao,ZHONG Yongxiang),Department of Clinical Laboratory(WANG Enzhi,WANG Xinhua),Intergated Chinese and western Medicine Hospital of Taizhou,Taizhou (317523),China;2 Department of Laboratory Medicine,Medicine College of Hangzhou Normal University,Hangzhou (311121),China

ObjectiveTo investigate the effect of arsenic trioxide（As2O3）on the expression of tumor necrosis factor receptor-associated factor 2（TRAF-2）and signal transducer andactivator of transcription 6（STAT-6）on human osteosarcoma SaOS-2 cell line induced by vascular endothelial growth factor（VEGF）,in an attempt to explore the mechanism of As2O3 treating human osteosarcoma.MethodsCCK8 assay,real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（QRT-PCR）and flow cytometry methods were used to determine the inhibition rate and expression levels of TRAF-2 and STAT-6 on osteosarcoma SaOS-2 cell line after treatment with As2O3.ResultsTreated with As2O3 of 2 μmol/L,the inhibition ratio of SaOS-2 cell line reached 57%（0.57±0.03 vs 0, P＜0.01）and the induction function of VEGF was notably depressed（0.42±0.02,P＜0.05）.The expression levels of TRAF-2（149.00±7.21 vs 167.33±8.02）and STAT-6（1.29±0.12 vs 2.53±0.67）significantly decreased（all P＜0.05）.ConclusionThe inhibition function of As2O3 on osteosarcoma cell proliferation is in a dose-dependent manner, which may be related to TRAF-2 and STAT-6 pathway.

osteosarcoma;SaOS-2 cell line;arsenic trioxide;tumor necrosis factor receptor-associated factor 2; signal transducer andactivator of transcription 6;vascular endothelial growth factor

浙江省自然基金資助項(xiàng)目（No.LY13H080006）；浙江省溫嶺市科技局基金資助項(xiàng)目（No.2013-1-64）

1浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科（吳永輝、林曉、鐘永翔）、檢驗(yàn)科（王恩智、王鑫華）（臺(tái)州 317523）；2杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系（杭州 311121）

林曉，E-mail：linxiaozg@163.com