齊 翀, 郝 總， 洪 亮， 殷慶章

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院普通外科，上海 200240

短篇論著

大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清中相關(guān)癌基因甲基化水平的檢測

齊 翀, 郝 總， 洪 亮， 殷慶章*

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院普通外科，上海 200240

目的：探討大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清相關(guān)癌基因甲基化水平的變化。方法：選擇2011年9月—2013年12月因原發(fā)性大腸癌入院伴或不伴肝轉(zhuǎn)移患者各32例，分別作為試驗(yàn)組A和試驗(yàn)組B。所有患者在入院之前均未進(jìn)行化療或放療。另選擇20例健康體檢者作為對(duì)照組。提取研究對(duì)象血清中DNA，采用甲基化特異性PCR法檢測E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE基因甲基化異常。結(jié)果：試驗(yàn)組A檢測出19例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常；試驗(yàn)組B檢測出10例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常；對(duì)照組未檢測出E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常。3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因甲基化狀態(tài)聯(lián)合檢測有利于大腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床診治。

大腸癌；肝轉(zhuǎn)移；甲基化；癌基因

在中國，大腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年增高。35%～55%的大腸癌患者會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，約25%的患者在診斷時(shí)已出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移[1]。肝轉(zhuǎn)移是造成大腸癌患者死亡的主要原因之一。目前，臨床常用的大腸癌血清學(xué)標(biāo)志物包括基因和蛋白，但是大多數(shù)標(biāo)志物的特異性和(或)敏感性不理想。近年來發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中存在DNA質(zhì)或量改變。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物有良好的臨床應(yīng)用前景。已有文獻(xiàn)[2-7]報(bào)道，E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的異常甲基化狀態(tài)與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，可用來預(yù)測大腸腫瘤的復(fù)發(fā)。本研究進(jìn)一步分析了大腸癌伴或不伴有肝轉(zhuǎn)移患者的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院于2011年9月—2013年12月確診原發(fā)性大腸癌伴或不伴有肝轉(zhuǎn)移患者各32例，分別作為試驗(yàn)組A和試驗(yàn)組B。所有患者在入院前均未進(jìn)行化療或放療。試驗(yàn)組A 32例患者中，男性13例，女性患者19例；年齡23～78歲，平均(56.5±7.9)歲；Ducks A期11例，B期8例，C期8例，D期5例。試驗(yàn)組B 32例患者中，男性16例，女性16例；年齡24～79歲，平均(55.5±9.9)歲；Ducks A期12例，B期9例，C期6例，D期5例。另外選擇20例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性12例，女性8例；年齡22～75歲，平均(54.5±7.8)歲。3組患者的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，所有患者知情者同意并簽署知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 3組研究對(duì)象的血清收集及DNA提取 術(shù)前采集健康體檢者和患者全血2 mL，3 000 ×g離心，收集約1 mL血清，-80℃冰箱保存。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)，從200 μL血清標(biāo)本中提取基因組DNA。

1.2.2 DNA甲基化修飾和甲基化特異性PCR 基因組DNA的亞硫酸鹽修飾 吸取約1 μg 的DNA樣品，用3 mol/L NaOH進(jìn)行變性反應(yīng)，再行NaHSO3修飾，50℃水浴避光過夜。此時(shí)，胞嘧啶可轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ虬l(fā)生甲基化。修飾后的DNA通過乙醇沉淀與PCR級(jí)去離子水形成懸浮液，再進(jìn)行甲基化特異性PCR。甲基化特異性PCR反應(yīng)體積為25 μL，包括修飾DNA 2 μL、1×PCR buffer Ⅱ (美國Perkin Elmer公司 )、2 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP、上下游引物各1 μmol/L、1 U AmpliTaq Gold polymerase(美國Perkin Elmer公司)。反應(yīng)條件：95℃變性反應(yīng)10 min，再95℃ 變性反應(yīng)30 s，退火45 s，72℃ 退火45 s；共40個(gè)循環(huán)。體外甲基化DNA(美國Intergen公司)作為陽性對(duì)照，不含DNA的蒸餾水作為陰性對(duì)照。吸取PCR 產(chǎn)物10 μL，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙啶(efhidium bromide, EB)染色，紫外光下觀察甲基化特異性引物擴(kuò)增的條帶情況，并進(jìn)行標(biāo)記，未甲基化特異性引物擴(kuò)增條帶標(biāo)為未甲基化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

3組研究對(duì)象的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化檢測結(jié)果見表1。試驗(yàn)組A有19例甲基化異常，陽性率為59.38%；試驗(yàn)組B有10例甲基化異常，陽性率為31.25%；對(duì)照組沒有檢測出甲基化異常。3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。試驗(yàn)組A中1例患者血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化異常檢測結(jié)果見圖1。

表1 3組研究對(duì)象血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化異常檢測結(jié)果 n

**P<0.01各組間比較

圖1 試驗(yàn)組A中1例患者的甲基化檢測結(jié)果

3 討 論

大腸癌患者的診斷對(duì)及時(shí)治療具有重要意義，表觀遺傳學(xué)改變?nèi)鏒NA甲基化異常在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往研究[8]測定了大腸癌患者外周血游離DNA中含表皮生長因子和卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白 (TPEF)基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化率，結(jié)果提示聯(lián)合檢測K-ras、TPEF基因異?？赡苁且环N非損傷性篩選和診斷大腸癌的有效方法。此外，HSP60[9]、TIP30啟動(dòng)子[10]、CEA、CA19-9和CA242[11]、DLC-1[12]等基因的甲基化情況均有助于診斷大腸癌。

不同基因的甲基化情況也可反映大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的情況，大腸癌患者和健康人的這些基因的甲基化情況不同。本研究檢測了大腸癌患者血清中E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE 基因的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)32例原發(fā)性大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者中，19例患者的這5個(gè)基因之一甲基化異常，陽性率為59.38%；32例原發(fā)性大腸癌不伴有肝轉(zhuǎn)移患者中，10例患者出現(xiàn)甲基化異常，陽性率為31.25%；而10名健康人沒有出現(xiàn)基因的甲基化異常。這些結(jié)果表明，大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者甲基化異常的發(fā)生率較高，基因甲基化異常參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)合患者的臨床資料，大腸癌相關(guān)基因的異常甲基化狀態(tài)對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的臨床診治有重要意義，而多個(gè)基因聯(lián)合檢測可以提高診斷的靈敏度和特異性。

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[本文編輯] 姬靜芳

Detection of related oncogenes methylation in serum of colorectal cancer patients with liver metastasis

QI Chong，HAO Zong，HONG Liang，YIN Qing-zhang*

Department of General Surgery, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective：To explore the detection results of serum related gene methylation in colorectal cancer patients with liver metastasis.Methods：From hospitalized patients with primary colorectal cancer from September 2011 to December 2013, 32 colorectal cancer patients with liver metastasis and 32 colorectal cancer patients without liver metastasis were selected as the experimental group A (n=30) and experimental group B (n=30), respectively.All patients did not undergo chemotherapy or radiotherapy before admission.In addition, 20 healthy subjects were recruited as the control group.DNA was extracted from serum, and E-cad, ID4, ESR1, APC, and HACE gene methylation were detected by methylation specific PCR method.Results：19 cases with E-cad, ID4, ESR1, APC or HACE abnormal methylation were detected in the experimental group A, 10 cases were detected in the experimental group B, no case was detected in the control group.There were significant differences among the three groups (P<0.01).Conclusions：Detection of serum E-cad, ID4, ESR1, APC, HACE gene methylation status is of great significance for clinical diagnosis and treatment of colorectal cancer liver metastasis.

colorectal cancer; liver metastasis; methylation; oncogene

2016-01-04[接受日期]2016-04-28

上海市衛(wèi)生局基金(20114268).Supported by Foundation of Shanghai Health Bureau(20114268).

齊 翀，碩士，主治醫(yī)師.E-mail: qichong8836@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64308151-8528, E-mail: williamyin@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160009

R 735.3+4

A