張金慧， 杜洪靈， 周瓊青

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產科， 上海 200060

短篇論著

葛根素在卵巢早衰患者中的免疫調節(jié)作用

張金慧， 杜洪靈， 周瓊青

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產科， 上海 200060

目的：探討葛根素(Puerarin)對卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)患者的免疫調節(jié)機制。方法：隨機選取抗卵巢抗體(AoAb)陽性的POF患者40例，采用葛根素-安宮黃體酮序貫治療。在治療前和治療第12個周期采用Kupperman評分法評價該方法的臨床療效；并檢測患者AoAb，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞，CD4+/CD8+值，CD19+B淋巴細胞，抗核抗體(ANA)等指標。統(tǒng)計治療過程中不良反應的發(fā)生情況。結果：治療后患者的Kupperman評分、ANA轉陰率、AoAb轉陰率和AoAb濃度降低(P<0.05)。治療后CD8+T細胞數(shù)明顯增加；而CD3+、CD4+T淋巴細胞， CD4+/CD8+比值，CD19+B淋巴細胞數(shù)明顯減少或降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Kupperman評分改變與AoAb，CD3+、CD4+T淋巴細胞數(shù)，CD19+B淋巴細胞數(shù)，ANA變化正相關(P<0.05)；Kupperman評分與CD8+T細胞計數(shù)負相關(P<0.05)。結論：葛根素-安宮黃體酮序貫療法可能通過調節(jié)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞功能來調節(jié)機體免疫功能，通過抑制CD19+B淋巴細胞的增殖及ANA、AoAb等的分泌來消除POF的免疫性損傷，從而實現(xiàn)卵巢的自我修復和功能恢復。

卵巢早衰；葛根素-安宮黃體酮序貫療法；抗卵巢抗體；抗核抗體；T淋巴細胞；B淋巴細胞

女性40歲之前發(fā)生卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)的比率為1%～3%，其中抗卵巢抗體(antiovary antibody, AoAb)陽性率達70%；自體免疫因素是其主要發(fā)病機制之一[1-2]。長期使用糖皮質激素治療可以增加POF患者的雌激素水平，從而緩解POF的癥狀，但會引起其他不良反應。前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，葛根素(Puerarin)具有有效緩解POF癥狀且不增加血雌激素水平和不誘發(fā)婦科腫瘤的優(yōu)點，部分患者甚至可以痊愈。本研究旨在探索葛根素是否具有通過調節(jié)機體免疫機能來抑制AoAb的產生，從而達到有效治療POF的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本課題組2012年1月1日至2014年12月治療POF患者共40例，年齡31～40歲，平均(36.12±4.32)歲；用藥時間12～31個周期，平均(24.22±7.64)個周期。入選標準：(1) 符合POF診斷標準，AoAb陽性；(2) 患者愿意采用葛根素+安宮黃體酮序貫治療。排除患有乳腺癌、子宮內膜癌等婦科腫瘤，結核、血液病等病理性停經，采用其他卵巢和女性激素藥物治療的患者。對照組采用張志君等[4]研究中的健康人群對照組。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核。入選研究對象均簽署知情同意書。

1.2 用藥方法 應用葛根片和安宮黃體酮序貫療法建立月經人工周期。患者每日口服葛根素片(野葛根提取物片，劑量為0.33 g/片，由上海仁濟大藥房提供；上海市預防醫(yī)學研究院檢測示，每片含有異黃酮0.429 mg)1片，1次/d，28 d為1個周期；于每個周期的19～28 d加安宮黃體酮10 mg口服，1次/d。對于已婚者應用避孕套避孕，定期門診隨訪。

1.3 抗體檢測 檢測治療前和治療后第12個月經周期患者的AoAb。月經干凈后3 d抽患者空腹靜脈血，離心后低溫保存?zhèn)溆谩Ｓ没瘜W發(fā)光免疫檢測方法[微粒子酶免疫分析法(MEIA)，德國羅氏診斷有限公司全自動化學發(fā)光免疫分析儀]測定各對象血清卵泡制激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平。采用上海撫生實業(yè)有限公司生產的AoAb等抗體試劑盒，用ELISA法檢測血液AoAb。采用歐蒙(杭州)醫(yī)學實驗診斷有限公司的IgG檢測試劑盒，間接免疫熒光法檢測抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)。CD19+B淋巴細胞，CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群和CD4+/CD8+比值檢測，免疫標化后應用上海匯中細胞生物科技有限公司Cytocounter系列全自動可視化細胞檢測儀進行計數(shù)分析。

1.4 療效評價 采用Kupperman評分法[5]，按照更年期癥狀計分：潮熱出汗4分；失眠、煩燥、焦慮各2分；睡眠中斷、心悸、疲倦、緊張、抑郁、癢感和痛感、易哭、注意力不集中、陰道干燥、性欲減退、性交痛各占1分。每種癥狀的評分根據(jù)程度(無、輕、中、重)分別乘以0、1、2、3后計算總分，滿分為63分(最嚴重)。治療前后對照，降低的分數(shù)作為療效評判指標。總分5分以下者，停藥3個周期。癥狀緩解，月經規(guī)律且色、量正常判為治愈。癥狀部分緩解，停藥后療效難以維持者繼續(xù)按照標準用藥治療。

1.5 安全性評估 在用藥前和用藥后每半年體檢，進行宮頸防癌涂片、乳腺、E2水平、肝腎功能等檢測，B超檢查子宮、卵巢的大小及子宮內膜厚度等,以篩查雌激素相關性疾病。

2 結 果

2.1 POF患者的臨床療效評價 結果(表1)表明：治療后第12個周期患者的Kupperman評分較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。40例患者中，治愈14例，治愈率為35%。與對照組相比，治療前患者的FSH、LH明顯增高(P<0.05)，E2明顯降低(P<0.05)。治療后患者的FSH和LH水平較治療前降低(P<0.05)，E2無明顯變化。治療后與對照組FSH和LH水平差異無顯著性，治療后E2較對照組明顯降低(P<0.05)。

2.2 POF患者的免疫指標測定 用藥第12個月經周期， CD19+B細胞計數(shù)及 CD3+、CD4+T細胞計數(shù)和CD4+/CD8+比值明顯減小，而CD8+計數(shù)明顯增加，AoAb濃度降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。本組患者中有14例AoAb轉為陰性，轉陰率為35%；ANA陽性率由90%下降到45%，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Kupperman評分與AoAb濃度，CD3+、 CD4+T細胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B細胞數(shù)變化正相關(P<0.05)，而與CD8+T細胞數(shù)負相關(P<0.05)，與ANA正相關。AoAb濃度變化與CD3+、CD4+T細胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B細胞數(shù)變化正相關(P<0.05)，而與CD8+T細胞數(shù)負相關(P<0.05)，與ANA正相關(P<0.05)。

2.3 不良反應 患者在治療后2～3個月經周期開始恢復月經規(guī)律；6個周期后月經色、量基本穩(wěn)定；12個周期時Kupperman評分比較穩(wěn)定，其中35%的患者治療12個周期評分5分以下，獲得治愈，停藥。因此，將第12個周期的指標月經水平用以評估療效，患者依從性好，結果較為準確，之后的化驗結果易受到其他環(huán)境和生活因素干擾。研究總計觀測12～31個周期，平均(24.22±7.64)個周期，發(fā)現(xiàn)月經情況穩(wěn)定，葛根素治療耐受良好，均未發(fā)現(xiàn)明顯藥物不良反應及乳腺、卵巢、子宮部位的雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生。

組 別nFSHzB/(U·L-1)LHzB/(U·L-1)E2ρB/(pg·L-1)Kupperman評分(分)對照組526．52±6．404．59±3．1951．5±8．870治療前4081．8±19．3?59．4±22．4?35．2±11．2?48．0±18．2治療后4022．3±17．6△25．4±17．2△39．1±15．4?21．0±13．6△

*P<0.05與對照組相比;△P<0.05與治療前相比

組 別nAoAbU/mLANACD19+BCD3+TCD4+TCD8+TCD4+/CD8+Kupperman評分(分)治療前406．91±2．3736457±1482261±4431152±337285±1491．54±0．8448±18．15治療后403．72±2．54?18?226±124?816±254?424±234?1067±385?0．83±0．24?21±13．57?

*P<0.05與治療前相比

3 討 論

POF免疫性損傷的發(fā)病機制尚不清楚，以AoAb介導的自身免疫性損傷被認為是該病的主要發(fā)病機制。AoAb是自身免疫系統(tǒng)將卵巢組織作為抗原進行攻擊而產生的自身抗體，主要包括抗透明帶抗體、抗顆粒細胞抗體和抗內膜細胞抗體等[6]。其主要產生機制為：(1)排卵過程中卵泡破裂，免疫屏障暫時開放和部分細胞外溢，導致卵巢組織抗原暴露，產生自身抗體；(2)反復多次助孕穿刺取卵導致的卵巢組織免疫屏障破壞致使抗原性暴露，產生自身免疫；(3)炎癥、人流、痛經、囊腫破裂、子宮內膜異位等導致卵巢免疫屏障破壞[7]，相關抗原暴露誘導抗體產生；(4)宮外孕、卵巢囊腫等手術直接導致屏障破壞和抗原暴露；(5)自身免疫功能異常導致產生一系列自身免疫性疾病等。文獻[8]報道，POF患者AoAb、CD4、CD8等細胞因子均有異常，卵巢抗原暴露的同時產生細胞免疫和體液免疫，損害卵巢。卵巢免疫性損害的主要機制可能在于：(1)AoAb包裹卵細胞并影響其排出；(2)AoAb在補體作用下產生細胞毒作用，破壞卵巢細胞，引起卵泡發(fā)育不全及POF；(3)AoAb干擾孕卵破殼而妨礙著床；(4)AoAb損害卵巢內分泌功能，導致雌激素水平降低。CD19+B淋巴細胞代表B淋巴細胞總數(shù)及抗體分泌能力。而CD3+T淋巴細胞代表成熟T淋巴細胞及細胞免疫水平。CD4+T淋巴細胞屬于輔助T細胞，而CD8+T淋巴細胞屬抑制性T細胞。CD4+/CD8+代表機體免疫狀態(tài)，明顯增高表示免疫機能處于過度活躍狀態(tài)，降低提示機體處于免疫抑制狀態(tài)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素-安宮黃體酮治療后，患者血液中AoAb和ANA水平均明顯下降，部分患者轉為陰性，而CD19+B細胞亞群數(shù)明顯下降，說明機體抗體分泌水平降低；同時T淋巴細胞CD3+、CD4+，CD4+/CD8+比值均明顯降低，而CD8+亞群明顯增加，說明T細胞系統(tǒng)調節(jié)機制發(fā)揮明顯作用。T細胞進一步抑制B淋巴細胞抗體分泌，使得AoAb分泌減少或停止排放，卵巢的免疫性損害停止并在機體修復機制作用下得以康復。由于AoAb引起的卵巢炎在早期對原始卵泡影響較小且治療效果明顯，因此及早進行AoAb測定對于不孕不育患者有重要意義。

葛根素治療前后Kupperman評分與AoAb濃度的變化均與CD3+、CD4+T淋巴細胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B淋巴細胞數(shù)正相關，而與CD8+T淋巴細胞數(shù)負相關，反映了AoAb濃度的變化與T淋巴細胞和B淋巴細胞免疫水平之間的相關性。本研究結論支持POF以體液免疫為主的疾病，而非染色體異常所致的推測[9]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素不但可以有效緩解POF的臨床癥狀，降低Kupperman評分，還可抑制FSH、LH分泌而不增加血液E2濃度，避免雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生，在部分患者中取得了治愈的效果。本研究在臨床效果、激素水平、安全性等都與前期研究取得了相似結果。治療后AoAb轉陰率達35%，濃度明顯降低，而ANA轉陰率45%，說明葛根素-安宮黃體酮序貫治療對于AoAb、ANA都有明顯抑制作用。本研究還顯示，該療法無糖皮質激素治療的不良反應。

該序貫療法中，安宮黃體酮作為人工合成孕激素，無調節(jié)免疫的作用。葛根素可有效治療POF得益于葛根富含的異黃酮等20余種生物活性成分，其藥理作用主要有：(1)改善微循環(huán)，促進組織血流，改善供血，有利于組織修復和功能恢復；(2)類雌激素作用可以部分替代雌激素作用而產生直接治療效果；(3)促進炎性介質疏散、緩解平滑肌痙攣，發(fā)揮解熱、解痙、消炎、鎮(zhèn)痛作用，緩解組織炎性反應，對于局部炎癥起到直接治療作用，有利于自身修復；(4)加強細胞組織基底膜的修復作用，促使卵巢生物屏障的修復，隔離暴露的抗原，阻礙抗體產生；(5)直接作用于淋巴系統(tǒng)，抑制T細胞系統(tǒng)功能，干擾B淋巴細胞的分泌和釋放抗體能力，并影響其活性。研究提示葛根素治療卵巢早衰不是一種成分作用的結果，而是各種成分的多節(jié)點、多環(huán)節(jié)、多機制作用的結果[10]。應充分發(fā)揮其安定心神、平衡免疫、增加營養(yǎng)、調節(jié)代謝的全身性治療作用。

POF患者的發(fā)病原因并不明確，有研究提出了卵巢自身抗體學說、基因突變學說等[11]，而葛根素-安宮黃體酮序貫療法可通過抑制AoAb產生或使其部分轉陰，從而抑制自身免疫對卵巢的損害，使紊亂的內分泌軸重新獲得協(xié)調并“重啟動”。大部分患者只是癥狀得到緩解或部分緩解，說明POF患者的發(fā)病基礎呈多樣性，可能存在著難以治愈的病理基礎[12]。

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[本文編輯] 葉 婷， 曉 璐

Effect of Puerarin on the immune regulation of patients with premature ovarian failure

ZHANG Jin-hui, DU Hong-ling, ZHOU Qiong-qing

Department of Obstetrics and Gynecology, Putuo District People’s Hospital, Shanghai 200060, China

Objective：To discuss the immune regulation mechanism of Puerarin in patients with premature ovarian failure (POF), and to study the anti-ovary anti-body (AoAb), antinuclear antibody(ANA), CD3+, CD4+, CD8+T lymphocyte cell and CD4+/CD8+and changes of CD19+B lymphocyte cell before and after treatment.Methods：Totally 40 POF cases with AoAb positive, treated with Puerarin-progesterone sequential treatment, were random selected.The clinical efficacy was analyzed before treatment and at the 12th cycle of treatment by using Kupperman, and the AoAb, CD3+, CD4+, CD8+T cells and CD4+/CD8+, CD19+B lymphocyte cell，ANA and other indicators were recorded and analyzed.The incidence rate of adverse reactions in the treatment process was recorded.Results：Kupperman score, ANA negative rate, AoAb negative rate and concentration of antibody after treatment were significantly decreased (P<0.05).The CD8+T cell counts increased significantly, while the CD3+, CD4+T cells, CD4+/CD8+, CD19+B lymphocytes were significantly reduced after treatment (P<0.05).Kupperman score was positively correlated with the number of AoAb, CD3+, CD4+T cells, CD19+B cell count, and ANA (P<0.05), and negative correlated with CD8+T cell count (P<0.05).Conclusions：Puerarin-progesterone sequential treatment is a safe and effective method for the POF.Puerarin may regulate immune function through the CD3+, CD4+and CD8+T cells, eliminate the immune injury of the POF by inhibiting the CD19+B cell, and secretion of ANA and AoAb to realize the self-repairing and functional recovery of ovarian.

premature ovarian failure; puerarin-progesterone method; anti-ovary antibody; antinuclear antibody; T cell; B cell

2016-08-13[接受日期]2016-11-05

上海市普陀區(qū)科學技術委員會基金(KW15201).Supported by the Putuo District Science and Technology Project of Shanghai (KW15201).

張金慧，副主任醫(yī)師.E-mail: zjinhui68@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160804

R 711.75

A