吳 艷， 鄒黎菲， 惠復(fù)新， 汪家坤

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院呼吸科，無錫 214023

論 著

微小RNA在叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1激活非小細胞肺癌上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

吳 艷， 鄒黎菲， 惠復(fù)新， 汪家坤*

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院呼吸科，無錫 214023

目的：探討微小RNA(microRNA)在叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1(Fox M1)激活非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenehymal transition，EMT)中的作用。方法：將Fox M1過表達質(zhì)粒，F(xiàn)ox M1-shRNA，miR-539、miR-485-5p模擬物及其抑制物轉(zhuǎn)染至人NSCLC細胞株中，應(yīng)用Western印跡和real-time PCR檢測細胞株中Fox M1蛋白和mRNA及miR-539、miR-485-5p的表達。同時應(yīng)用CCK-8和細胞遷移實驗觀察Fox M1、miR-539和 miR-485-5p對NSCLC細胞的增殖和侵襲功能的影響。應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-539和 miR-485-5p與EMT調(diào)控蛋白ZEB1和Snail1的關(guān)系。結(jié)果：Fox M1過表達下調(diào)NSCLC 細胞中miR-539、miR-485-5p，轉(zhuǎn)染Fox M1-shRNA后NSCLC細胞中 miR-539、miR-485-5p升高。MiR-539和miR-485-5p抑制Fox M1對NSCLC細胞增殖和侵襲的促進作用。NSCLC細胞中miR-539對EMT調(diào)控蛋白ZEB1，miR-485-5p對EMT調(diào)控蛋白Snail1的表達有抑制作用。結(jié)論：miR-539和miR-485-5p能抑制NSCLC細胞中Fox M1-EMT通路，從而影響NSCLC細胞的增殖和侵襲，抑制NSCLC的遠處轉(zhuǎn)移。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1；上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化；非小細胞肺癌；微小RNA

惡性腫瘤是我國城市居民死亡的首位原因，占全部死亡總數(shù)的25%，肺癌已替代肝癌成為我國惡性腫瘤的首位死亡原因。肺癌的遠端轉(zhuǎn)移是肺癌患者的主要死亡原因[1]。肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的85%，其臨床癥狀重，預(yù)后差[2-3]。目前，應(yīng)用于臨床的靶向治療藥物可使NSCLC患者的生存期明顯延長，生活質(zhì)量顯著提高。但這些藥物治療的靶點局限，且僅對小部分患者有效，因此急需尋找新的治療靶點。Fox (forehead box) M1是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。研究[4]表明，F(xiàn)ox M1與NSCLC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Fox M1的過表達能促進NSCLC腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[5]。而EMT在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在Fox M1促進 NSCLC腫瘤細胞遷移和侵襲能力中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[8-9]證實，miRNA在NSCLC中具有重要的調(diào)節(jié)作用。miR-663a在NSCLC組織中下調(diào)，并且通過靶向JunD作為腫瘤抑制劑起作用[10]。MiR-223通過靶向胰島素樣生長因子-1受體增強NSCLC細胞對厄洛替尼的敏感性[11]。Fox M1-EMT是涉及多個信號通路和分子調(diào)節(jié)機制的復(fù)雜過程，這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中不僅包含一些蛋白分子、調(diào)控因子信號的調(diào)控，還受到miRNA的調(diào)控。因此，本研究通過觀察miR-539、miR-485-5p對NSCLC細胞中Fox M1-EMT信號通路的影響，為NSCLC靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人NSCLC細胞系A(chǔ)549和H1299購自中國科學(xué)院上海細胞庫(中國上海)，并用含10%胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen，美國)在37℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 Fox M1過表達質(zhì)粒、Fox M1抑制劑(Fox M1-shRNA，Genepharma，中國)，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)根據(jù)說明書分別轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞中。NSCLC細胞分別轉(zhuǎn)染miR-539、miR-485-5p 模擬物(mimic)和對照miRNA(Genepharma，中國)，應(yīng)用Lipofectamine 2000以50 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染。同樣，miR-539、miR-485-5p抑制劑(inhibitor)和對照(Genepharma，中國)根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000以100 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染入NSCLC細胞中。

1.3 qRT-PCR 用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)從細胞中提取總RNA，并通過NanoDrop ND-1000分光光度計(Agilent，美國)測量濃度。ABI 7500系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進行qRT-PCR。反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR擴增用具有g(shù)DNA Eraser(TaKaRa，日本)和SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)的PrimeScript RT試劑盒。MiRNA的反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR擴增使用miDETECA TrackTMmiRNA qRT-PCR入門試劑盒(Rib Bio，中國)。以β-actin作為內(nèi)參，miRNA以U6作為內(nèi)參。每個實驗進行至少3次。qRT-PCR的引物如表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.4 免疫印跡法 將NSCLC細胞裂解并用1×SDS-PAGE上樣緩沖液提取到蛋白質(zhì)中。使用BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中國)測定蛋白質(zhì)濃度。在10%SDS-PAGE凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在用5%脫脂乳封閉2 h后，用如下的第一抗體溫育膜：Fox M1(1∶250，Santa Cruz，美國)和β-actin(1∶1 000，Santa Cruz，美國)。

1.5 CCK-8測定 使用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測定試劑盒(Dojindo，日本)測定細胞增殖。將轉(zhuǎn)染的細胞以2×103個細胞/孔的密度接種在96孔板中；第2 d向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液。將細胞孵育70 min，并使用酶聯(lián)免疫吸附測定讀數(shù)器(Dasit，意大利)測試450 nm處的光密度值，共6 d，每個實驗進行至少3次，并分析結(jié)果的平均值。

1.6 細胞遷移測定 將無血清培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染的NSCLC細胞以合適的密度接種在具有8 mm直徑(Corning，美國)的24孔格式的Transwell室的上部。在底室中，加入800 μL含有10%FBS的正常DMEM培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)箱在37℃、5%CO2下培養(yǎng)24～48 h。用棉簽輕輕擦去上部的細胞，并將遷移的細胞用0.05%結(jié)晶紫染色30 min。在顯微鏡下5個隨機視野中計數(shù)遷移的細胞，每個實驗進行至少3次，分析結(jié)果的平均值。

1.7 熒光素酶報告基因測定 將含有完整miR-539識別序列的ZEB1的3′-UTR和含有完整miR-485-5p識別序列的Snail13′-UTR克隆到pmiR-RB-ReportTM(Rib Bio，中國)中。將細胞(5×104)接種在24孔板中并孵育24 h后進行轉(zhuǎn)染。應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染包含miRNA(miR-539和miR-485-5p)模擬物以及陰性對照的3′-UTR(或3′-UTR-突變體)的螢火蟲熒光素酶構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細胞，提取蛋白，用Dual-Luciferase Reporter System(Promega，中國)測量熒光信號變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0進行統(tǒng)計分析。兩組間的差異通過Student’sttest進行檢驗。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Fox M1下調(diào)NSCLC 細胞中miR-539、miR-485-5p mRNA的水平 通過轉(zhuǎn)染過表達Fox M1的質(zhì)粒及Fox M1的shRNA，結(jié)果顯示不同NSCLCs細胞株Fox M1的mRNA及蛋白水平均能穩(wěn)定地顯示Fox M1高表達及低表達特性(圖1A～1D)。MiR-539、miR-485-5p mRNA水平在不同的NSCLC細胞系中均表現(xiàn)為在Fox M1高表達時降低，在Fox M1被抑制時升高(圖1E、1F)。

圖1 NSCLC細胞系A(chǔ)549和H1299中Fox M1過表達或表達抑制對miR-539、miR-485-5p mRNA表達的影響

2.2 miR-539和miR-485-5p抑制Fox M1對NSCLC細胞增殖和侵襲的影響 本研究通過轉(zhuǎn)染miR-539和miR-485-5p，使NSCLC細胞過表達miR-539和miR-485-5p，并檢測CCK-8及細胞遷移能力來觀察miR-539和miR-485-5p的過表達對NSCLC細胞增殖和侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)miR-539和miR-485-5p過表達抑制NSCLC細胞增殖和侵襲(圖2A、2B)。相反，抑制miR-539和miR-485-5p增強了NSCLC細胞增殖和侵襲的促進作用(圖2C、2D)。在過表達Fox M1的細胞中，miR-539和miR-485-5p過表達抑制Fox M1對NSCLC細胞增殖和侵襲的促進作用，抑制miR-539和miR-485-5p的表達增強Fox M1對NSCLC細胞增殖和侵襲的促進作用(圖3)。

圖2 miR-539和miR-485-5p對NSCLC細胞(H1299)增殖和侵襲能力的影響

A, B: miR-539和miR-485-5p對H1299細胞增殖的抑制作用；C, D: miR-539和miR-485-5p對H1299細胞遷移能力的抑制作用.NC: normal control; miR-539: miR-539 mimic; miR-485-5p: miR-485-5p mimic.*P<0.05, **P<0.01;n=3

2.3 NSCLC細胞中miR-539對ZEB1以及miR-485-5p對 Snail1的調(diào)控 通過生物信息學(xué)方法，本研究發(fā)現(xiàn)miR-539 能結(jié)合 ZEB1的3′-UTR區(qū)，miR-485-5p能與Snail1的3′-UTR結(jié)合(圖4A)。為了了解miR-539和miR-485-5p是否能分別調(diào)控ZEB1和Snail1，我們通過基因轉(zhuǎn)染的途徑在NSCLC細胞中過表達或抑制miR-539和miR-485-5p時發(fā)現(xiàn)Fox M1的蛋白和mRNA水平升高或降低(圖4B～4E)。同時將3′-UTR ZEB1和Snail1含有野生型或突變型miR-539和miR-485-5p結(jié)合序列分別克隆到熒光素酶報告基因載體中并將載體同時轉(zhuǎn)染入細胞后，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明，miR-539和miR-485-5p能有效抑制野生型熒光素酶活性而對突變型熒光素酶活性無影響(圖4F)。

圖3 miR-539和miR-485-5p對 Fox M1對NSCLC細胞(H1299)增殖和侵襲能力的抑制作用

A, B: miR-539和miR-485-5p抑制H1299細胞中Fox M1對H1299增殖的影響; C, D: miR-539和miR-485-5p抑制H1299細胞中Fox M1對H1299遷移能力的影響.a, d: Fox M1+NC; b: Fox M1+miR-539 mimic; c: Fox M1+miR-539 inhibitor; e: Fox M1+miR-485-5p mimic; f: Fox M1+miR-485-5p inhibitor.*P<0.05,**P<0.01;n=3

圖4 H1299細胞中miR-539對ZEB1以及miR-485-5p對 Snail1的調(diào)控

A: miR-539 能結(jié)合 ZEB1的3′-UTR區(qū), miR-485-5p能與Snail13′-UTR 結(jié)合; B, C: miR-539 和miR-485-5p過表達對H1299細胞中Fox M1的蛋白水平(B)及mRNA水平的影響(C); D, E: miR-539 和 miR-485-5p的抑制對H1299細胞中Fox M1的蛋白水平(D)和mRNA水平(E)的影響; F: miR-539和miR-485-5p過表達能有效抑制野生型熒光素酶活性而對突變型熒光素酶活性無影響.*P<0.05,**P<0.01;n=3

3 討 論

miRNA 是一類廣泛存在于動植物和病毒中長為20～25個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA。研究[12]發(fā)現(xiàn) miRNA與肺癌的類型、進展、患者預(yù)后及生存率密切相關(guān)。 MiRNA 可作為腫瘤抑制或促進因子調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和癌性血管生成等。研究[13-16]發(fā)現(xiàn)miR-485-5p、miR-539在多種腫瘤中均有明顯下調(diào)，可作為腫瘤惡化的抑制因子。MiR-485-5p可能成為NSCLC早期診斷的標(biāo)志物[17]，而miR-539能增強順鉑對非小細胞肺癌耐藥株的殺傷作用[18]。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC細胞中Fox M1上調(diào)EMT可能是通過抑制miR-539和miR-485-5p的表達發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細胞株中Fox M1的表達抑制miR-539、 miR-485-5p。 miR-539、 miR-485-5p mRNA在Fox M1高表達時降低，在Fox M1表達被抑制時升高。功能實驗發(fā)現(xiàn)miR-539和miR-485-5p過表達時NSCLC細胞的增殖和遷移能力減弱，miR-539和miR-485-5p被抑制時細胞的增殖和遷移能力增強。在過表達Fox M1的H1299細胞內(nèi)，miR-539和miR-485-5p能抑制由于Fox M1導(dǎo)致的細胞侵襲和增殖能力的增強。因此，miR-539和miR-485-5p可能是通過Fox M1來調(diào)控NSCLC細胞的功能。

研究[19]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ox M1通過EMT促進 NSCLC腫瘤細胞遷移和侵襲。研究[20]表明，肺癌EMT過程受到多種miRNA調(diào)控，miR-138通過靶向GIT1和SEMA4C抑制非小細胞肺癌細胞的細胞增殖和逆轉(zhuǎn)EMT。MiR-145和miR-203通過抑制非小細胞肺癌細胞中的SMAD3抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT[21]，miR-338-3p通過靶向EMT抑制肺癌細胞的轉(zhuǎn)移[22]。然而miR-539和miR-485-5p是否能通過Fox M1-EMT途徑來調(diào)控NSCLC細胞功能尚未可知。多項研究[23-24]證實ZEB1和Snail1是調(diào)控EMT的重要蛋白。Fox M1能通過激活ZEB1和Snail1等促進腫瘤細胞EMT過程[25-27]。實驗通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)，miR-539 能結(jié)合 ZEB1的3′-UTR區(qū)，miR-485-5p能與Snail13′-UTR 結(jié)合。熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，miR-539和miR-485-5p的過表達能分別抑制ZEB1和Snail1的表達，參與調(diào)控NSCLC細胞的Fox M1-EMT通路。

綜上所述，本研究證實miR-539和miR-485-5p能通過調(diào)控Fox M1-EMT通路來影響NSCLC腫瘤細胞增殖和侵襲能力，影響腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移，為臨床NSCLC的診治提供了新的理論依據(jù)。

[1] TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] MOLINA J R, YANG P, CASSIVI S D, et al.Non-small cell lung cancer: Epidemiology, risk factors, treatment, and survivorship[J].Mayo Clin Proc,2008,83(5):584-594.

[4] XU N, JIA D, CHEN W, et al.Fox M1is associated with poor prognosis of non-small cell lung cancer patients through promoting tumor metastasis[J].PLoS One, 2013,8(3):e59412.

[5] KE Y, ZHAO W, XIONG J, et al.MiR-149 inhibits non-small-cell lung cancer cells EMT by targeting FOX M1[J].Biochem Res Int,2013,2013:506731.

[6] GAO D, VAHDAT L T, WONG S, et al.Microenvironmental regulation of epithelial-mesenchymal transitions in cancer[J].Cancer Res,2012,72(19):4883-4889.

[7] 孔飛飛,袁海花,王炯軼,等.Fox M1對非小細胞肺癌細胞遷移、浸潤的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(11):2427-2431.

[8] FENG B, ZHANG K, WANG R, et al.Non-small-cell lung cancer and miRNAs: novel biomarkers and promising tools for treatment[J].Clin Sci(Lond),2015,128(10):619-634.

[9] EBRAHIMI A, SADRODDINY E.MicroRNAs in lung diseases: Recent findings and their pathophysiological implications[J].Pulm Pharmacol Ther,2015,34:55-63.

[10] ZHANG Y, XU X, ZHANG M, et al.MicroRNA-663a is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibits proliferation and invasion by targeting JunD[J].BMC cancer,2016,16:315.

[11] ZHAO F Y, HAN J, CHEN X W, et al.MiR-223 enhances the sensitivity of non-small cell lung cancer cells to erlotinib by targeting the insulin-like growth factor-1 receptor[J].Int J Mol Med,2016,38(1):183-191.

[12] CALIN G A, SEVIGNANI C, DUMITRU C D, et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9):2999-3004.

[13] LV L Y, WANG Y Z, ZHANG Q, et al.miR-539 induces cell cycle arrest in nasopharyngeal carcinoma by targeting cyclin-dependent kinase 4[J].Cell Biochem Funct,2015,33(8):534-540.

[14] GU L, SUN W.MiR-539 inhibits thyroid cancer cell migration and invasion by directly targeting CARMA1[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,464(4):1128-1133.

[15] JING L L, MO X M.Reduced miR-485-5p expression predicts poor prognosis in patients with gastric cancer[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(8):1516-1520.

[16] GUO G X, LI Q Y, MA W L, et al.MicroRNA-485-5p suppresses cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma by targeting stanniocalcin 2[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(10):12292-12299.

[17] PENG H, WANG J, LI J, et al.A circulating non-coding RNA panel as an early detection predictor of non-small cell lung cancer[J].Life Sci, 2016,151:235-242.

[18] 吳展陵,鐘敏華.miR-539增強順鉑對非小細胞肺癌耐藥株的殺傷作用研究[J].解放軍醫(yī)藥雜志, 2016, 28(4):31-34.

[19] KONG F F, QU Z Q,YUAN H H, et al.Overexpression of Fox M1is associated with EMT and is a predictor of poor prognosis in non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2014,31(6):2660-2668.

[20] LI J, WANG Q, WEN R, et al.MiR-138 inhibits cell proliferation and reverses epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer cells by targeting GIT1 and SEMA4C[J].J Cell Mol Med,2015,19(12):2793-2805.

[21] HU H, XU Z, LI C, et al.MiR-145 and miR-203 represses TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition and invasion by inhibiting SMAD3 in non-small cell lung cancer cells[J].Lung cancer,2016,97:87-94.

[22] LI Y, CHEN P, ZU L, et al.MicroRNA-338-3p suppresses metastasis of lung cancer cells by targeting the EMT regulator Sox4[J].Am J Cancer Res,2016,6(2):127-140.

[23] BOURCY M, SUAREZ-CARMONA M, LAMBERT J, et al.Tissue Factor Induced by Epithelial-Mesenchymal Transition Triggers a Procoagulant State That Drives Metastasis of Circulating Tumor Cells[J].Cancer Res, 2016,76(14):4270-4282.

[24] THAKUR N, GUDEY S K, MARCUSSON A,et al.TGFβ-induced invasion of prostate cancer cells is promoted by c-Jun-dependent transcriptional activation of Snail1[J].Cell Cycle, 2014,13(15):2400-2414.

[25] MIAO L, XIONG X, LIN Y, et al.Down-regulation of Fox M1leads to the inhibition of the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cells[J].Cancer Genet,2014,207(3):75-82.

[26] BALLI D, USTIYAN V, ZHANG Y, et al.Fox M1transcription factor is required for lung fibrosis and epithelial-to-mesenchymal transition[J].EMBO J,2013,32(2):231-244.

[27] BAO B, WANG Z, ALI S, et al.Over-expression of Fox M1leads to epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotype in pancreatic cancer cells[J].J Cell Biochem,2011,112(9):2296-2306.

[本文編輯] 葉 婷， 曉 璐

The role of microRNAs in activation of epithelial-mesenchymal transition in non-small-cell lung cancer by forkhead box M1

WU Yan, ZOU Li-fei, HUI Fu-xin, WANG Jia-kun*

Department of Respiratory Medicine, Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214023, Jiangsu, China

Objective：To investigate the role of microRNAs in Fox M1-induced non-small cell lung cancer (NSCLC) epithelial-mesenchymal transition (EMT).Methods：Over expression Fox M1plasmid, Fox M1-shRNA, miR-539, miR-485-5p mimics and inhibitor were transfected into NSCLC cells.The expression of Fox M1protein and mRNA, miR-539 and miR-485-5p were detected by Western blotting and real-time PCR.The CCK-8 and cell migration was used to observe the effect of Fox M1, miR-539 and miR-485-5p on the proliferation and invasion of NSCLC.Luciferase reporter assay was used to explore the relationship between miRNA( miR-539 and miR-485-5p) and EMT regulatory protein (ZEB1and Snail1).Results：Real-time RT-PCR and Western blotting showed Fox M1over expression inhibited the expression of miR-539, miR-485-5p, miR-539 and miR-485-5p in NSCLC cells were increased after transfected Fox M1-shRNA.MiR-539 and miR-485-5p suppressed enhancement of proliferation and invasion of NSCLC cells by Fox M1.miR-539 targeted and inhibited the translation of ZEB1,miR-485-5p targeted and inhibited the translation of Snail1in NSCLC cells.Conclusions：The mechanism of Fox M1up-regulation of EMT protein is to decrease the expression of miR-539 and miR-485-5p in NSCLC cells, thus to affect the proliferation and invasion of NSCLC cells, and to inhibit distant metastasis.

forkhead box M1; epithelial-mesenchymal transition; NSCLC; microRNA

2016-09-26[接受日期]2016-11-30

吳 艷，碩士，副主任醫(yī)師.E-mail: wuyanyangting@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0510-85350137, E-mail: wwwztg90203@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160990

R 734.2

A