周 明， 馬建明

揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院普通外科， 揚(yáng)州 225001

論 著

胃癌組織miR-155的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

周 明， 馬建明*

揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院普通外科， 揚(yáng)州 225001

目的：探討胃癌組織miR-155的表達(dá)水平及其臨床意義。方法：收集手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本116例，采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)癌及癌旁組織miR-155的表達(dá)水平，分析其與臨床病理的關(guān)系及對(duì)臨床預(yù)后的影響。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌組織中PTEN的表達(dá)，分析其表達(dá)與miR-155的相關(guān)性。結(jié)果：胃癌組織miR-155表達(dá)高于配對(duì)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；miR-155高表達(dá)與腫瘤TNM分期、侵犯層次、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。K-M曲線分析表明，miR-155高表達(dá)預(yù)示著較低的3年無病進(jìn)展率(P<0.001)及總生存率(P<0.001)。PTEN表達(dá)與miR-155負(fù)相關(guān)，miR-155高表達(dá)患者PTEN表達(dá)低(P<0.001)。結(jié)論：miR-155與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是胃癌潛在的臨床診斷及預(yù)后指標(biāo)。

胃癌；miR-155；PTEN；臨床意義；預(yù)后

胃癌在我國(guó)發(fā)病率、死亡率較高，嚴(yán)重威脅國(guó)人的生命健康，但目前發(fā)病機(jī)制仍未完全明確[1-3]。微小RNA(miRNAs)在調(diào)控腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，可能是腫瘤臨床診治新的靶點(diǎn)，成為目前腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。既往研究[4-7]表明：miR-155在包括結(jié)直腸癌、乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)胃癌組織miR-155的表達(dá)，并分析其與胃癌患者臨床預(yù)后間的關(guān)系，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2010年7月至2013年4月?lián)P州市第一人民醫(yī)院普通外科手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本116例。每例標(biāo)本均配對(duì)距腫瘤5 cm以上的癌旁組織。手術(shù)標(biāo)本離體后，5 min內(nèi)無菌取材并迅速存放在液氮，于-80℃冰箱中保存?；颊甙行?6例，女性70例；年齡 37～83歲，平均(59±3)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診的原發(fā)性胃癌患者，術(shù)前未行放化療；患者及家屬配合，并簽署知情同意書，愿意提供臨床隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行新輔助化療；病理確定為轉(zhuǎn)移性胃癌。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 胃癌組織及癌旁組織總RNA的提取采用RNA提取試劑盒(美國(guó)LC Science公司)，按照試劑盒說明書操作。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。miR-155莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為5′-CGC TGC TAC CTG AGA GTA GAC CAG ATG CAG CGA CCC CT-3′，由上海博仕生物服務(wù)公司設(shè)計(jì)合成。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海博仕生物服務(wù)公司)配制10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束后放-20℃保存。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá) 引物由上海博仕生物服務(wù)公司設(shè)計(jì)合成，miR-155上游引物：5′-TTA ATG CTA ATC GTG ATA G-3′，下游引物：5′-ACC TGA GAG TAG ACC AGA-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′，下游引物：5′-CAG GGG CCA TGC TAA ATC TTC-3′。應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)配制25 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94℃ 3 min預(yù)變性后，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s；35個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)設(shè)2個(gè)復(fù)孔。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)立閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即Ct值)，將原始數(shù)據(jù)取2次重復(fù)的平均值后，用內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，分別計(jì)算癌組織及配對(duì)癌旁組織中的miR-155的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫組化法檢測(cè)PTEN的表達(dá) 將所有患者胃癌病理標(biāo)本制作4 μm厚度病理切片，嚴(yán)格按照GeneTech的EnVision免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行S-P法免疫組化染色。每張免疫組化切片在光鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野拍照保存后，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行免疫組化染色評(píng)分后取均值。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：未著色者計(jì)0分，著色淺者計(jì)1分，中度著色者計(jì)2分，強(qiáng)著色者計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分率評(píng)分如下：陰性者計(jì)0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%者計(jì)1分，11%～50%者計(jì)2分，51%～80%者計(jì)3分，≥80%者計(jì)4分。每張切片計(jì)分=染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析每組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。數(shù)據(jù)均以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。采用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析胃癌組織和配對(duì)癌旁組織miR-155表達(dá)差異。用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析miR-155表達(dá)水平與胃癌臨床各病理參數(shù)之間的關(guān)系。生存曲線用Kaplan-Meier(K-M曲線)方法創(chuàng)建，并用Log-rank方法檢驗(yàn)。PTEN的表達(dá)和miR-155表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌及癌旁組織中miR-155的表達(dá)差異 結(jié)果(圖1)表明：癌組織miR-155的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1 胃癌與癌旁正常組織中miR-155的表達(dá)差異

2.2 胃癌組織miR-155表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果(表1)表明：胃癌組織miR-155表達(dá)水平與侵犯層次、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，高表達(dá)miR-155患者較低表達(dá)患者有較深的腫瘤浸潤(rùn)深度、較高的TNM分期及較多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而與性別、年齡、腫瘤大小及脈管侵犯無明顯相關(guān)。

2.3 胃癌組織miR-155表達(dá)與胃癌患者臨床生存之間的關(guān)系 本研究限定36個(gè)月為隨訪總生存期及無病進(jìn)展期的截點(diǎn)。結(jié)果表明：隨訪期內(nèi)，116例患者中有68例進(jìn)展，61例死亡。3年總累計(jì)無病生存率及總生存率分別為41.4 % 和47.4%。為研究miR-155表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，依據(jù)miR-155在胃癌患者中表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組及低表達(dá)組。采用K-M曲線分析miR-155表達(dá)在胃癌患者預(yù)后中的意義。3年累計(jì)無病生存率在高表達(dá)組為17.9 %，明顯低于低表達(dá)組的42.5 %(P<0.001，圖2A)；3年累計(jì)總生存率在高表達(dá)組為22.0%，明顯低于低表達(dá)組的50.5 %(P<0.001，圖2B)。

表1 胃癌組織miR-155表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 胃癌患者基于miR-155表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線A：3年無病進(jìn)展生存率；B：3年總生存率

2.4 miR-155表達(dá)與抑癌基因PTEN表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)果表明：miR-155表達(dá)與PTEN表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.8453,P<0.001)，miR-155高表達(dá)患者PTEN表達(dá)較低(圖3、圖4)。

圖3 胃癌組織miR-155不同表達(dá)組中PTEN蛋白的表達(dá)Original magnification: ×20 (A, B), ×40 (C, D)

圖4 胃癌組織PTEN的表達(dá)與miR-155表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

Tsukamoto等[6]采用基因芯片方法分析470種miRNA在胃癌中表達(dá)，篩選出胃癌miRNAs表達(dá)譜。Zhang等[7]研究結(jié)果顯示，miR-21在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，其通過作用于靶基因第10號(hào)染色體上缺失與張力蛋白同源的磷酸脂酶基因(PTEN)，從而促進(jìn)胃癌增殖和轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果表明，miRNAs發(fā)揮促癌基因或抑癌基因作用，參與胃癌發(fā)生發(fā)展。

MiR-155是一種經(jīng)典的多功能miRNA，參與許多生物過程，包括造血、免疫及炎癥反應(yīng)。miR-155可以抑制Caspase-3或促凋亡基因TP53BP1的活性，起到抗凋亡的作用[8]，還可以通過下調(diào)SOCS1基因起到促進(jìn)增殖的作用[9]。Yamanaka等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-155在淋巴瘤/白血病中高表達(dá)，通過下調(diào)抑癌基因，如PTEN、PDCD4 和SHIP1，激活A(yù)kt信號(hào)通路促進(jìn)疾病進(jìn)展。Du等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-155在鼻咽癌中高表達(dá)，且能夠下調(diào)與疾病進(jìn)展及臨床預(yù)后相關(guān)的基因JMJD1A的表達(dá)。以上證據(jù)顯示，miR-155在惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后方面起著不可忽視的作用。

為了探討miR-155在胃癌中的作用，本研究采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)116例胃癌及配對(duì)癌旁組織miR-155的表達(dá)水平，并分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，miR-155在胃癌組織中表達(dá)升高，且高表達(dá)miR-155與TNM分期、腫瘤侵犯層次及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達(dá)與PTEN負(fù)相關(guān)，miR-155高表達(dá)患者PTEN表達(dá)較低，提示miR-155在胃癌中可能通過靶向PTEN蛋白發(fā)揮致癌作用，且參與胃癌進(jìn)展。

為了進(jìn)一步研究miR-155的表達(dá)在胃癌患者預(yù)后中的作用，本研究隨訪了術(shù)后116例胃癌患者。36個(gè)月的隨訪期內(nèi)，116例患者中有68例進(jìn)展，61例死亡。K-M曲線分析結(jié)果提示：3年累計(jì)無病生存率在miR-155高表達(dá)組為17.9%，而在低表達(dá)組為42.5%。3年累計(jì)總生存率在高表達(dá)組為22.0%，低表達(dá)組為50.5%。Log-rank檢驗(yàn)提示：miR-155高表達(dá)組的3年累計(jì)無病生存率及3年累計(jì)總生存率均低于miR-155低表達(dá)組(P<0.001)。結(jié)果提示高miR-155表達(dá)可能預(yù)示著胃癌患者較差的預(yù)后。

Lu等[12]報(bào)道，miR-155在胃癌組織中高表達(dá)，并且參與胃癌的進(jìn)展，與本研究結(jié)果一致。本研究納入了含有116例患者的隊(duì)列研究，并且對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)miR-155在胃癌組織中也呈高表達(dá)趨勢(shì)，并且還與TNM分期、腫瘤侵犯層次及患者的預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，miR-155可能是胃癌潛在的診斷、預(yù)后及治療靶點(diǎn)，測(cè)定血漿中miR-155的表達(dá)可能會(huì)成為早期診斷胃癌及評(píng)價(jià)預(yù)后的輔助指標(biāo)。

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[本文編輯] 葉 婷， 賈澤軍

Expression of miR-155 in gastric cancer and its prognostic significance

ZHOU Ming, MA Jian-ming*

Department of General Surgery, Yangzhou No.1 People’ Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu, China

Objective：To discuss the expression of miR-155 and its clinical significance in gastric carcinoma.Methods：One hundred and sixteen pairs of human gastric carcinoma tissues were obtained from patients who underwent surgical resection.The level of miR-155 in 116 gastric cancer tissues and the adjacent normal gastric tissues were detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the association between miR-155 expressions with clinicopathological factors and prognostic values were explored.Immunohistochemical staining for PTEN in all pathological specimens from gastric cancer biopsy was performed.The correlationship between PTEN and miR-155 expression was analyzed.Results：The expression of miR-155 in gastric cancer tissues was higher than that of adjacent normal gastric tissues (P<0.001).The up-regulated expression of miR-155 was associated with TNM stage, invasion level and lymph node metastases (P<0.05).Kaplan-Meier analysis demonstrated that high miR-155 expression clearly predicted poorer progression free survival (PFS,P<0.001) and overall survival (OS) (P<0.001) within three years.PTEN expression was negatively correlated to miR-155 expression.Gastric cancer tissues with higher miR-155 expression disclosed lower PTEN expression (P<0.001).Conclusions：MiR-155 may plays a pivotal role in the development and progression of gastric carcinoma, and it may be the potential biomarker in the diagnosis and prognosis of gastric carcinoma.

gastric carcinoma; miR-155; PTEN; clinical significance; prognosis

2016-01-21[接受日期]2016-09-26

周 明，碩士生，主治醫(yī)師.E-mail: 13852200328@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0514-82981199-81006, E-mail: genesis.7@live.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160076

R 735.2

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