沈若剛 （上?；莺头N業(yè)有限公司“嘉定白蒜”項目課題組 201899）

劉 衛(wèi) （上海交通大學農業(yè)與生物學院 200240）

“嘉定白蒜”分生組織培養(yǎng)脫病毒及優(yōu)種繁育體系的建立

沈若剛 （上?；莺头N業(yè)有限公司“嘉定白蒜”項目課題組 201899）

劉 衛(wèi) （上海交通大學農業(yè)與生物學院 200240）

為確保大蒜高質量生長，培育優(yōu)良的大蒜脫毒苗，以“嘉定2號”白蒜為供試材料，選擇不同處理的莖尖為材料，將其接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，利用莖尖組織培養(yǎng)技術進行了大蒜脫毒苗快速繁殖的相關研究。結果表明，以帶有1片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜，以MS+6-BA 0.5 mg/ L+IAA 0.2 mg/L配比組成的培養(yǎng)基對大蒜脫毒苗成苗效果為最好，同時NAA濃度為0.8 mg/L時，生根率達到最高，為71%，當其濃度增至1.0 mg/L時，生根率開始下降。經(jīng)病毒檢測，大蒜脫毒苗的脫毒率為85%。

“嘉定2號”白蒜；脫毒苗；莖尖培養(yǎng)

大蒜(Allium sativum L.)又叫蒜頭、大蒜頭、胡蒜、葫、獨蒜、獨頭蒜，是蒜類植物的統(tǒng)稱，屬于百合科蔥屬半年生草本植物。大蒜是秦漢時從西域傳入中國的，經(jīng)人工栽培繁育而成，它既能作為調味品，又是預防和治療多種疾病的良藥，還具有抗癌功效，深受大眾喜食。世界上大蒜的栽培總面積為80 萬hm2，總產量為762萬t，單產約為9.5 t/hm2，最高單產達40.6 t/hm2[1]。近年來，我國大蒜的種植面積在逐步增加、產量在逐步提高、市場規(guī)模也在逐步擴大，許多地區(qū)已把大蒜作為主要經(jīng)濟作物進行栽培。

在我國，大蒜的主要繁殖方式為利用鱗莖進行無性繁殖，但鱗莖是大蒜的產品器官，在大蒜無性繁殖過程中，易感染和積累多種病毒，而病毒極易通過種蒜進行傳播，降低了大蒜的品質和產量，給生產者造成了嚴重的損失[2]。研究表明，利用莖尖組織培養(yǎng)技術快速培育大蒜脫毒苗，不僅可解決病毒傳染的問題、提純復壯，而且還可以解決因連年種植大蒜而造成的種性退化等問題[3]。此外，還要建立一個更加適合大蒜生長繁育的體系，以保證大蒜的高質量生長，從而培育更加優(yōu)良的大蒜脫毒苗?，F(xiàn)以“嘉定2號”白蒜為供試材料，選擇不同處理的莖尖為材料，將其接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，利用莖尖組織培養(yǎng)技術進行了大蒜脫毒苗快速繁殖的相關研究?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為“嘉定2號”白蒜，由上?；莺头N業(yè)有限公司提供，該品種為上海嘉定大蒜的主栽品種之一。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試材料的選取與消毒

供試大蒜鱗莖先在8 ℃低溫下貯藏30 d，以打破休眠，然后在超凈工作臺上剝去蒜皮，用75%乙醇消毒10 min，再用無菌水沖洗2-3次，在無菌條件下切取0.2-0.9 mm分別帶有1片葉原基、2-3片葉原基和不帶葉原基的3種莖尖為外植體接種到不同培養(yǎng)基上。

1.2.2 基本培養(yǎng)基試驗

將外植體接種到分別附加BA 0.1 mg/L 和IBA 0.1 mg/L 的MS、B5、WPM和N6 四種不同類型的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后觀察成苗情況。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

在篩選出的最佳培養(yǎng)基上，附加8種不同濃度的細胞分裂素和生長素：（1）MS+BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（2）MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（3）MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，（4）MS+BA 1.0 mg/ L+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，（5）MS+BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，（6）MS+BA 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，（7）MS+BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，（8）MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L。接種后3-4周，對各增殖培養(yǎng)基上分化出的試管叢生苗莖尖和成芽數(shù)進行統(tǒng)計。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

將組培苗轉入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ L的NAA，2-3周后統(tǒng)計生根率。

1.2.5 試管苗移栽

移栽前將大蒜脫毒苗置于自然光照下，打開瓶蓋煉苗3 d，或直接注入自來水，使其根部充分吸水，用鑷子將苗從試管中輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到已消毒的混合基質中，混合基質中泥碳土∶蛭石∶腐熟肥為1∶1∶1。移栽后澆足水分，移栽初期不宜澆灌營養(yǎng)液，以防止高離子濃度造成植株的生理干旱。用塑料薄膜保濕7 d，成苗率達80%以上，30 d后移至無大蒜栽培地（隔離區(qū)）種植。

1.2.6 病毒檢測

將剝離的大蒜莖尖置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個月，長成球形胚狀體或愈傷組織塊，將此材料搗碎、研磨，制成組織汁液，用磷酸鹽作緩沖液在3 000 r/min條件下離心20 min，棄去殘渣，取上清液，用2%磷鎢酸（pH6.8）負染色1-2 min，在電鏡（JBM-100CXII型）下觀察，每個樣品做3個銅網(wǎng)，每個銅網(wǎng)至少取20個以上不同視野檢測病毒，并以未脫病毒樣品作對照，確認所含病毒的基本形態(tài)和特征。

2 結果與分析

2.1 外植體大小對莖尖成活率的影響

一般大蒜無病毒區(qū)分布在近生長點0.1-1.0 mm范圍內，因此大蒜脫毒頻率的高低，關鍵在于剝取莖尖的大小。本試驗在同等條件下，采用長度為0.2-0.9 mm分別帶有1片葉原基、2-3片葉原基和不帶葉原基的3種莖尖為外植體。結果表明，莖尖外植體大小對成活率有明顯影響，帶有2片葉原基的莖尖萌動早、顯綠快、成活率高，但該外植體大小在1.0 mm左右，難以保證脫毒效果；而剝取不帶葉原基的莖尖（0.1 mm），接種后多數(shù)變?yōu)楹稚?、中途枯死，或變硬、停留在原來狀態(tài)，長成完整植株的概率很??；以帶有1片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜，這與李昌華等[4]的研究結果基本相似。

2.2 基本培養(yǎng)基的篩選

由表1可知，各培養(yǎng)基里的莖尖均能誘導成苗，經(jīng)差異顯著性測定，MS、N6、B5培養(yǎng)基的成苗率均顯著高于WPM培養(yǎng)基，MS和N6培養(yǎng)基的成苗率均達90%。觀察結果表明，在MS培養(yǎng)基上，幼芽變綠早（僅6-7 d）、幼苗健壯，對繼代培養(yǎng)至關重要；N6培養(yǎng)基誘導成苗率雖高，但幼芽變綠較MS培養(yǎng)基遲2-3 d，且幼苗長勢較弱，影響了其后來的增殖與擴繁；在WPM培養(yǎng)基上外植體培養(yǎng)速度慢、生長發(fā)育差。由此可見，MS培養(yǎng)基配合適當濃度的BA和NAA是誘導“嘉定白蒜”莖尖成苗較為適宜的培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對莖尖成苗的影響

2.3 激素和生長素的配比

以MS為基本培養(yǎng)基進行激素及生長素配比試驗，接種后3-4周各增殖培養(yǎng)基均可不同程度地分化出試管叢生苗。由表2可見，處理（1）優(yōu)于其它處理組合，每個莖尖平均分化4.0個芽，且增殖的新生芽生長正常。初步結果認為，較低濃度的BA和IAA對“嘉定白蒜”莖尖外植體的芽分化具有良好的促進作用。處理（7）、（8）雖然增殖系數(shù)分別為3.1、2.6，但分化出的單株有玻璃苗或假莖膨大異常現(xiàn)象，這可能與BA濃度偏高有一定關系。

表2 不同激素配比對莖尖成苗增殖的影響

2.4 不同濃度NAA對大蒜綠苗生根的影響

由表3可知，隨著NAA濃度的增加，生根率均有不同程度的提高，以NAA濃度為0.8 mg/L時生根效果最為理想，生根率達71%，當其濃度增至1.0 mg/L時，生根率開始下降。說明在生根培養(yǎng)基中添加適量NAA有利于組培苗生根，但濃度過高不僅生根率下降，而且產生的根短而脆，造成后期移栽成活率不降。在本試驗范圍內，生根培養(yǎng)基中以MS培養(yǎng)基附加NAA0.6-0.8 mg/L較為適宜。

表3 不同濃度NAA對大蒜綠苗生根的影響

2.5 病毒檢測結果

以本試驗培育的脫毒組培苗為試樣，進行花葉病癥狀觀察及電鏡檢查檢測，并以未脫毒植株為對照。結果表明，對照中全部含病毒，該病原體為一種彎曲線狀病毒，粒子直徑為10-12 nm，長度不等，大多數(shù)病毒顆粒的長度集中在600-850 nm，為典型的大蒜花葉病毒[5]，平均每銅網(wǎng)網(wǎng)孔病毒粒子含量達110粒；被檢測的13份再生植株中，有11份樣品在所有的視野中沒有觀察到病毒，脫毒率為85%，且脫毒蒜個體健壯、葉片綠而肥大、根系發(fā)達、清秀無黃色斑點。由此可見，“嘉定白蒜”通過莖尖培養(yǎng)具有明顯的脫毒效果，可消除或減輕種蒜帶毒率，從而獲得無性系脫毒苗原種。

3 結論與討論

利用大蒜莖尖誘導愈傷組織進行不定芽的增殖從而生產大蒜脫毒苗，是目前為止大蒜快速繁殖且降低病毒傳染率的一種十分重要的手段。本試驗主要是通過不同莖尖大小的處理進行組織培養(yǎng)，結果表明，莖尖外植體大小對成活率有明顯影響，以帶有1片葉原基、大小為0.2-0.6 mm的莖尖外植體較為適宜；不同培養(yǎng)基和激素配比對于愈傷組織的誘導率和成苗率有顯著影響，以MS+BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基誘導成苗率較高，同時以MS附加NAA 0.6-0.8 mg/L的培養(yǎng)基生根率較高；對脫毒苗進行病毒檢測，脫毒率為85%，表明莖尖培養(yǎng)具有明顯的脫毒效果。

許多研究表明[6，7]，培養(yǎng)基中附加不同的激素對大蒜脫毒苗的誘導率具有不同的效果，同時，不同的激素配比、不同的NAA濃度、不同的白蒜品種對大蒜成苗率、生根率及其他性狀均有不同的影響效果。因此，要根據(jù)不同的大蒜品種確定合適的激素配比，從而建立優(yōu)種繁育體系。

[1] 宋滿坡.大蒜莖尖的組織培養(yǎng)[J].信陽農業(yè)高等?？茖W校學報,2005,15（3）：86-87.

[2] 陳世儒,黃菊輝.大蒜離體快繁及脫毒[J].園藝學報,1991, 18(3):245-250.

[3] 趙一鵬,宋建偉,周巖,等.植物組織培養(yǎng)及其在園藝上的應用[J].河南職業(yè)技術師范學院學報,2002,30（3）：30-32.

[4] 李昌華,李小川,趙美華,等.大蒜莖尖脫毒技術及組織培養(yǎng)研究[J].華北農學報,1995,10(3):20-25.

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[6] 屈二軍,李文建,張現(xiàn)青,等.植物激素對大蒜愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)的影響[J].安徽農業(yè)科學,2008,36（21）：8932-8933.

[7] 湯青林,王志敏,宋明,等.大蒜不定芽的誘導及其增殖系數(shù)的調節(jié)[J].中國農學通報,2006,22（6）：224-226.

2015-06-28