范 祥，藺 苗，楊永壽，田昆侖，王光明

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；3.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

不同產(chǎn)地瑪咖中總生物堿的含量測定研究

范 祥1，藺 苗2，楊永壽2，田昆侖1，王光明3*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；3.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：采用酸性染料比色法對不同產(chǎn)地瑪咖樣品中總生物堿的含量進(jìn)行測定，以評價(jià)其品質(zhì)。方法：以氧化苦參堿為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定瑪咖中總生物堿的含量，并對瑪咖總生物堿的提取方法、顯色劑的用量、pH值、檢測波長進(jìn)行考察。結(jié)果：采用超聲提取，時(shí)間為40 min，提取3次，顯色劑用量為6 mL，pH為7.2，測量波長為415 nm，瑪咖中總生物堿含量相對較高的3個(gè)產(chǎn)地是秘魯、麗江和迪慶。結(jié)論：本法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可作為瑪咖中總生物堿的含量測定方法。

瑪咖；總生物堿；紫外-可見分光光度法；含量測定

瑪咖（Lepidium meyennii Walp）為十字花科（Brassicaceae）獨(dú)行菜屬（Lepidium）1年生草本植物，藥用部位為地下球莖，顏色有紫色、黃色、白色3種?，斂гa(chǎn)于秘魯海拔3500m以上的安第斯山區(qū)，已有幾千年的栽培歷史，是當(dāng)?shù)夭豢扇鄙俚淖魑镏弧?〕，在我國，瑪咖主要作為保健品。研究表明，瑪咖富含植物蛋白、氨基酸、脂肪及微量元素等營養(yǎng)成分，還含有多種次生代謝物質(zhì)：瑪咖烯（macaene）、生物堿（包括瑪咖酰胺macamide）、芥子油苷及其水解衍生物、甾醇、多酚類及其他成分〔2-4〕。其中瑪咖生物堿可提高動(dòng)物成熟卵泡小體的數(shù)量、精子的流動(dòng)性和精子的數(shù)量，從而可顯著提高哺乳動(dòng)物和魚類的生育力〔2-5〕?，斂飰A還可以作用于視丘下部和腦垂體，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌腺（如腎上腺、甲狀腺、胰腺、卵巢等）的功能，能夠起到平衡荷爾蒙的作用，因此可用于治療女性更年期綜合征〔5〕。其營養(yǎng)成分還具有增強(qiáng)人體精力、耐力等功效，因此又常被稱為”秘魯人參”。

近年來，由于國內(nèi)保健品市場對瑪咖的需求量大增，瑪咖被我國多地引種栽培〔6〕，但生長環(huán)境不同，是否對瑪咖中主要成分造成影響，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用酸性染料比色法對不同產(chǎn)地9批瑪咖中總生物堿的含量進(jìn)行測定，以考察不同產(chǎn)地瑪咖的品質(zhì)。

1 材料

1.1儀器超聲波清洗器（SB2200，寧波新芝生物科技股份有限公司）；恒溫水浴鍋（SSY-4，北京泰克儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；酸度計(jì)（pHS-25，上海虹儀儀器廠）；電子天平（AE240，瑞士梅特勒）；雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（UV2500，日本島津）。

1.2試藥9批不同產(chǎn)地瑪咖樣品（產(chǎn)地分別為秘魯、曲靖會(huì)澤、麗江玉龍雪山、迪慶香格里拉、東川因民、昆明祿勸、新疆塔什庫爾干、大理賓川、四川阿壩，由大理大學(xué)生藥教研室楊月娥老師鑒定為十字花科獨(dú)行菜屬草本植物瑪咖）；氧化苦參堿（中國生物制品藥品研究院，批號：110780-201007），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1溶液的配制

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)粉碎后過2號篩的瑪咖粉0.5 g于150 mL圓底燒瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取40 min，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并提取液，減壓濃縮至干后加20 mL 2%的HCl溶液溶解浸膏，洗滌燒瓶，合并酸液。用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.2，再用等體積氯仿萃取3次。合并萃取液，減壓濃縮回收氯仿，用甲醇分次溶解、洗滌，合并甲醇液，定容至10 mL，即得瑪咖總生物堿的供試品溶液〔7-9〕。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取氧化苦參堿對照品0.1 g，用甲醇溶解，定容至100 mL，即得濃度為1.0 mg∕mL的對照品溶液。

2.1.3 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑的配制 精密稱取溴麝香草酚藍(lán)0.125 g，溶于1 000 mL的磷酸緩沖溶液中（0.2 mol∕L Na2HPO4與0.2 mol∕L NaH2PO4溶液等量混合），混勻即得〔10-12〕。

2.2測量波長的選擇分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)的瑪咖總生物堿提取液1.0 mL和“2.1.2”項(xiàng)下得到的對照品溶液1.0 mL于10 mL量瓶中，分別加入溴麝香草酚藍(lán)6.0 mL，用甲醇定容，搖勻，靜置顯色15 min，即得樣品和對照品待測液，同法配制空白對照液。以空白對照液校正儀器，在400～700 nm范圍內(nèi)分別掃描對照品測定液和樣品測定液。

2.3單因素考察

2.3.1 pH值考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備好的瑪咖樣品溶液6份，每份1.0 mL，分別加入pH值為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的溴麝香草酚藍(lán)顯色劑6.0 mL，用甲醇定容，震蕩搖勻，靜置顯色15 min，在415 nm處測定吸光度。

2.3.2 顯色劑用量考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備好的瑪咖樣品溶6份，每份1.0 mL于10 mL量瓶中，分別加入pH為7.2的溴麝香草酚藍(lán)顯色劑2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用甲醇定容，震蕩搖勻，靜置顯色15 min，在415 nm處測定吸光度〔13-15〕。

2.3.3 提取方法的考察 精密稱取經(jīng)粉碎過2號篩的瑪咖粉末0.5 g，共稱取6份。置150 mL圓底燒瓶中，加20 mL甲醇，分別進(jìn)行超聲和回流提取，提取時(shí)間為40 min。按“2.1.1”項(xiàng)方法操作得樣品提取液，分別加入溴麝香草酚藍(lán)顯色劑6.0 mL，用甲醇定容，震蕩搖勻，靜置顯色15 min，于415 nm波長處掃描，測定〔11-13〕。

2.4樣品含量測定分別精密稱取來自不同產(chǎn)地的9批瑪咖樣品粉末各3份，每份0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下制備待測樣品溶液。各精密量取1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色，測其吸光度，計(jì)算樣品中總生物堿的含量。

3 結(jié)果

3.1提取方法按“2.3.3”項(xiàng)試驗(yàn)方法確定提取方法。見表1。結(jié)果表明，超聲提取法的瑪咖中總生物堿的平均含量為4.71 mg∕g，回流提取的瑪咖中總生物堿的平均含量為3.05 mg∕g。因此選擇超聲提取法作為瑪咖中總生物堿的提取方法。

表1 提取方式比較（n=3）

3.2測量波長的選擇按“2.2”項(xiàng)試驗(yàn)方法對樣品和對照品溶液進(jìn)行顯色測定。見圖1。結(jié)果表明，對照品和樣品在415 nm處均有最大吸收，故選擇415 nm為本實(shí)驗(yàn)測量波長。

3.3 pH值的選擇按“2.3.1”項(xiàng)試驗(yàn)方法確定實(shí)驗(yàn)過程中緩沖液pH值。見圖2。緩沖液pH值對瑪咖中總生物堿提取液吸光度的影響如圖2所示，當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH為7.2時(shí)所測得的吸光度值最大，表明此時(shí)顯色劑解離成的陰離子與瑪咖生物堿陽離子定量結(jié)合形成穩(wěn)定的有色離子對最多，故選擇緩沖溶液pH7.2。

3.4顯色劑用量考察按“2.3.2”項(xiàng)試驗(yàn)方法確定顯色劑的用量。見圖3。結(jié)果表明，顯色劑的最佳用量為6.0 mL。

圖2 pH考察

圖3 顯色劑用量考察

3.5樣品含量測定按“2.4”項(xiàng)測定不同產(chǎn)地瑪咖中總生物堿的含量。見表2。結(jié)果表明，秘魯產(chǎn)的瑪咖中生物堿的含量最高，麗江、迪慶兩個(gè)地區(qū)次之，東川、祿勸、賓川產(chǎn)的瑪咖生物堿含量較低。

表2 樣品測定（n=3）

3.6方法學(xué)考察

3.6.1 線性關(guān)系考察 精密移取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL量瓶中，加麝香草酚藍(lán)顯色劑6.0 mL，用甲醇定容，震蕩搖勻，靜置顯色15 min，于415 nm處測定吸光度，以氧化苦參堿對照品的濃度（C）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A= 12.874C-0.034 1（r=0.999 2），結(jié)果表明，氧化苦參堿在0.01～0.12 mg∕mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.6.2 精密度試驗(yàn) 精密移取苦參堿對照品溶液1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，顯色后于415 nm處重復(fù)測定吸光度5次，測定結(jié)果的RSD為0.8%（n= 5），表明儀器的精密度良好。

3.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制得的瑪咖總生物堿提取液1.0 mL按“2.2”項(xiàng)下方法顯色，在415 nm處每隔20 min測1次其吸光度值，測得結(jié)果的RSD為0.58%（n=6），結(jié)果表明樣品液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批經(jīng)粉碎后過2號篩的瑪咖粉末5份，每份0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下制備樣品溶液，精密量取1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色，測定，計(jì)算得瑪咖中總生物堿的平均含量為4.11 mg∕g，RSD為0.7%（n=5），表明方法的重復(fù)性好。

3.6.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知總生物堿含量（4.11 mg∕g）的瑪咖樣品粉末9份，精密加入各加標(biāo)量對應(yīng)的苦參堿對照品，按“2.1.1”項(xiàng)制備樣品溶液。精密量取各待測樣品溶液1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)試驗(yàn)方法顯色，測定吸光度，計(jì)算回收率。見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

4 討論

試驗(yàn)對9個(gè)不同產(chǎn)地，不同顏色的瑪咖中總生物堿的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明種植在海拔為3 300～3 600 m，晝夜溫差20℃以上、水資源豐富的秘魯、麗江、迪慶這3個(gè)地區(qū)產(chǎn)的瑪咖中總生物堿的含量相對較高，品質(zhì)最好。種植在海拔在3 100 m左右，晝夜溫差為15℃左右、水資源相對豐富的四川阿壩、新疆塔什庫爾干兩個(gè)地區(qū)的瑪咖中總生物堿含量低于秘魯?shù)鹊貐^(qū)，其品質(zhì)一般。而種植在平均海拔為2 400 m左右，晝夜溫差10℃左右，水資源相對匱乏的曲靖會(huì)澤、東川因民、昆明祿勸、大理賓川4個(gè)地區(qū)的瑪咖中總生物堿的含量最低，品質(zhì)較差。該結(jié)果表明海拔和晝夜溫差的改變，土壤水分含量差異會(huì)對瑪咖中有效成分的積累有較大影響。

研究結(jié)果表明，瑪咖中生物堿的含量與顏色無關(guān)，而與生長環(huán)境關(guān)系緊密，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕不一致，有待進(jìn)一步增大樣本量進(jìn)行研究。

在本試驗(yàn)中，用2%的鹽酸洗滌浸膏3次〔14-16〕，使生物堿以生物堿鹽的形式存在于水中，其目的是去除酸性濾液中的脂肪酸、色素及鞣質(zhì)類等雜質(zhì)；再用10%NaOH調(diào)節(jié)pH值至10，在堿性條件下，生物堿鹽與堿作用轉(zhuǎn)化成游離的生物堿，它們較易溶于有機(jī)溶劑。由文獻(xiàn)資料可知，瑪咖中的生物堿主要為非水溶性生物堿〔7〕，因此可用有機(jī)溶劑氯仿對其萃取。

由于瑪咖總生物堿中成分較多，而各組分的研究相對缺乏，目前瑪咖中已知的幾種重要生物堿的含量都很低，無法得到其標(biāo)準(zhǔn)品，因此選擇結(jié)構(gòu)相似的氧化苦參堿作為對照品，掃描結(jié)果表明，氧化苦參堿與瑪咖生物堿的紫外-可見吸收光譜一致，在415 nm處均有最大吸收峰，因此可選擇氧化苦參堿做為對照品。

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Research on Determination of Total Alkaloids in Different Areas Maca

Fan Xiang1,Lin Miao2,Yang Yongshou2,Tian Kunlun1,Wang Guangming3*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali, Yunnan 671000,China;3.Clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:TodeterminatethecontentoftotalalkaloidsinMacafromdifferentoriginswithaciddyecolorimetryforevaluating thequality.Methods:Takingtheoxymatrineasreferencesubstance,UV-visiblespectrophotometrywasusedtodeterminatethecontentof total alkaloid Maca,and extraction method,the amount of coloring agent,pH value,determine wavelength were observed as well.Results: Ultrasonic extraction was used to extract for three times with 40 minutes each time and the amount of reagent was 6 mL,pH was 7.2,and measurement wavelengthλwas 415 nm.Maca produced in Peru,Lijiang and Diqing enjoy higher content of total alkaloids.Conclusion: Thismethodissimple,sensitive,andreproducible,whichcanbethemethodofdeterminingthecontentoftotalalkaloidsinMaca.

Maca;total alkaloids;UV-visible spectrophotometry;determination

R284

A

2096-2266（2016）12-0043-04

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.010

（責(zé)任編輯 李 楊）

2015-08-31

2015-10-09

范祥，碩士研究生，主要從事病理學(xué)研究. *通信作者：王光明，教授，博士.