李宇馳,徐 妍,楊永壽,肖培云*
(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000)
HPLC法測定肝龍膠囊中肌苷的含量
李宇馳1,徐 妍1,楊永壽2,肖培云1*
(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000)
目的:建立肝龍膠囊中肌苷的含量測定方法,為肝龍膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法:采用Gemini 5u C18110A(250 mm× 4.6 mm)色譜柱,流動相水(含0.05%TFA):乙腈(含0.05%TFA),采用梯度洗脫方式,流速0.8 mL∕min,柱溫30℃,DAD檢測器,檢測波長為214 nm,進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果:肌苷在0.202~2.020 μg范圍之間峰面積值與進(jìn)樣量(μg)線性關(guān)系良好,平均回收率(n=9)為96.9%,RSD為2.18%。結(jié)論:建立的肝龍膠囊中肌苷含量測定方法科學(xué)、簡便、結(jié)果準(zhǔn)確,可作為提高肝龍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項(xiàng)目。
肝龍膠囊;肌苷;含量測定
肝龍膠囊是由藥用昆蟲美洲大蠊(Periplaneta americana)的干燥蟲體經(jīng)提取得到的活性部位研制而成,是治療病毒性乙型肝炎和肝纖維化作用的中藥二類新藥,標(biāo)準(zhǔn)編號為YBZ04142005-2011Z,具有疏肝理脾,活血解毒的功效,并具有抗肝損傷作用〔1〕。該藥具有療效好,價格低,給藥方便等優(yōu)點(diǎn)。研究表明,肝龍膠囊不僅對防治乙肝病毒有較好的療效,還具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝損傷,提高機(jī)體免疫功能等作用〔2-8〕。由于肝龍膠囊的質(zhì)量控制方面的研究較少,目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定項(xiàng)以總氨基酸為測定指標(biāo),缺乏專屬性。研究表明,肌苷是肝龍膠囊活性部位中的已知成分〔9〕,為進(jìn)一步提高肝龍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性,本文采用高效液相法對肝龍膠囊中肌苷的含量測定方法進(jìn)行研究。
1.1儀器1100型高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器,美國安捷倫公司);超聲波清洗器(SK3200LH型,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);分析天平(AL240-IC型,梅特勒-托利多儀器有限公司)。
1.2材料肝龍膠囊(昆明賽諾制藥公司,批號:15122002、15101201、15091701、15082002、15062401、 15042202);肌苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:140669-201305,Mr=268);乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。
2.1色譜條件以及肌苷峰的確定采用Gemini 5u C18110A(250 mm×4.6 mm)色譜柱,流動相水(含0.05%三氟乙酸,以下簡稱含0.05%TFA):乙腈(含0.05%TFA),采用梯度洗脫方式,流速0.8 mL∕min,柱溫30℃,DAD檢測器,檢測波長為214 nm,進(jìn)樣量10 μL,按表1中的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫,色譜圖見圖1,可知供試品的S峰與肌苷保留時間一致,并利用DAD檢測器對其圖譜進(jìn)行二維檢測,光譜圖見圖2,結(jié)果顯示,供試品的S峰與肌苷峰的紫外吸收圖譜相同,進(jìn)一步確定S峰即為肌苷峰。
表1 梯度洗脫條件
圖1 肌苷色譜圖
圖2 對照品與供試品中肌苷峰掃描圖
2.2溶液的制備
2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取肌苷對照品適量,加蒸餾水制成每1 mL含0.202 mg的溶液,混勻,即得。
2.2.2 供試品溶液制備 取同一批次的膠囊20粒,傾出內(nèi)容物,計(jì)算平均粒重,充分研細(xì),混勻。精密稱取研細(xì)后的內(nèi)容物約70 mg于10 mL量瓶中,加適量蒸餾水超聲15 min溶解,定容至刻度,混勻,過濾。取續(xù)濾液適量,用0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。
2.3線性關(guān)系精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL注入色譜儀,按“2.1”色譜條件測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程為Y=2 050.7X-298.63,r=0.999 5,結(jié)果表明肌苷在0.202~2.020 μg范圍內(nèi)峰面積值與進(jìn)樣量(μg)呈良好的線性關(guān)系。
2.4精密度實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,以肌苷峰面積進(jìn)行計(jì)算,RSD為0.24%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。
2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊,按“2.2.2”項(xiàng)制備6份供試液,精密吸取各供試液10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定,以肌苷峰面積計(jì)算,RSD為0.56%,經(jīng)計(jì)算得樣品含量為14.07 mg∕g,結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。
2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊制備的供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL,肌苷峰面積的RSD值為0.89%,表明供試品溶液中肌苷在室溫下放置12 h穩(wěn)定。
2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取“15062401”批次樣品適量于5 mL量瓶中,平行稱取9份,根據(jù)樣品中所含肌苷的平均含量(14.07 mg∕g),按含量的高、中、低加入對照品,依“2.2.2”項(xiàng)制備供試液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。見表2。
表2 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)
2.8樣品含量測定取不同批次的樣品,按“2.2.1”項(xiàng)制備供試液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。見表3。
表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3)
實(shí)驗(yàn)考察了phenomenex Gemini 5u C18110A(4.60mm×250mm)、AglientZORBAXSB-C18(4.60mm× 250 mm,5 μm)及Waters Symmetry ShieldTMRP18(4.60 mm×250 mm,5 μm)的C18色譜柱,結(jié)果表明,采用phenomenex Gemini 5u C18110A(4.60 mm×250 mm)色譜柱時,色譜峰分離效果最好,且基線平穩(wěn)。在流動相選擇時,分別考察了乙腈(0.05%TFA)-水(0.05%TFA)、乙腈-水(0.05%TFA)、乙腈-水3種洗脫體系對樣品分離的影響,結(jié)果表明,采用乙腈(0.05%TFA)-水(0.05%TFA)為流動相時,色譜峰分離度和對稱性良好。實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測器對檢測波長進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)在214 nm波長下色譜圖的基線平穩(wěn),且相鄰色譜峰無干擾,故選擇214 nm作為檢測波長。同時,在確定上述條件的基礎(chǔ)上,分別對流速(0.7、0.8、0.9 mL∕min)和溫度(25、30、35℃)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,樣品在柱溫為30℃、流速在0.8 mL∕min時分離效果最好,且基線漂移較小。
本研究建立了肝龍膠囊中肌苷含量的測定方法,并測定了6批肝龍膠囊中肌苷含量,該方法回收率高、精密性良好、方便快捷??蔀橥晟聘锡埬z囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查提供參考。
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〔4〕杜一民,陳鴻珊,李樹楠,等.治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2006,17(8):1369-1371.
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HPLC Method for Determination of the Inosine Content in Ganlong Capsule
Li Yuchi1,Xu Yan1,Yang Yongshou2,Xiao Peiyun1*
(1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China)
Objective:To establish a determination method of the content of inosine in Ganlong capsule for providing the basis for Ganlong capsule quality control.Methods:Gemini 5u C18110A(250 mm×4.6 mm)chromatographic column,mobile phase water(0.05%TFA):acetonitrile(0.05%TFA),gradient elution,0.8 mL∕min flow,30℃column temperature,DAD detector,214 nm detection wavelength,10 μL sample quantity were used in the study.Results:Peak area of inosine between 0.202-2.020 μg range and injection volume(μg)showed a linear relationship.The average recoveries(n=9)was 96.9%,RSD=2.18%.Conclusion:The established method of determination Ganlong capsules is scientific,simple and accurate,which can be used to improve Ganlong capsule quality standard test project.
Ganlong capsule;inosine;determination
R917
A
2096-2266(2016)12-0040-03
10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.009
(責(zé)任編輯 李 楊)
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360634;81560634);云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目(2015FA025)
2016-08-26
2016-09-08
李宇馳,碩士研究生,主要從事美洲大蠊活性提取物研究. *通信作者:肖培云,教授.