陳曉英，馬金英，宋天增，唐建華，趙彥玲，任子利，朱彥賓，王良潤

（1.西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000；4.西藏牧樂農業(yè)科技有限公司，拉薩 850009）

紅景天多糖對藏豬精液4℃保存效果的研究

陳曉英1，馬金英1，宋天增1，唐建華2，趙彥玲3，任子利3，朱彥賓1，王良潤4

（1.西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000；4.西藏牧樂農業(yè)科技有限公司，拉薩 850009）

試驗旨在研究紅景天多糖對4℃藏豬精液品質和抗氧化保護作用影響，采用電刺激法采集健康藏豬精液，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加紅景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環(huán)境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價精液品質指標，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量為評價抗氧化保護作用指標，探討紅景天多糖對4℃藏豬精液品質影響。結果顯示：藏豬精液4℃保存到第5天時，9.0 mg/L紅景天多糖添加組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率這4個指標均極顯著好于其他組（P＜0.01）。7.0 mg/L和11.0 mg/L添加組除精子活力差異顯著外，其他指標差異不顯著（P＞0.05）。同時發(fā)現(xiàn)，9.0 mg/L紅景天多糖添加組精子超氧化物歧化酶活力最高，5.0 mg/L、7.0 mg/L和11.0 mg/L組間無差異；精子MDA含量以9.0 mg/L紅景天多糖添加組為最高，較7.0 mg/L和11.0 mg/L、5.0 mg/L、3.0 mg/L和對照組差異極顯著（P＜0.01），7.0 mg/L和11.0 mg/L添加組無差異?？傊诟倪M的豬精液稀釋液中添加9.0 mg/L的紅景天多糖可明顯改善4℃環(huán)境保存藏豬精液品質和抗氧化保護作用，該試驗研究為今后藏豬精液低溫保存的生產應用奠定了基礎。

紅景天多糖；藏豬；4℃環(huán)境；精液品質；抗氧化保護

糖類可以提高細胞外的滲透壓，使水分透過細胞膜向細胞外流失，引起細胞失水，因為糖類不能透過細胞膜進入細胞[1]。紅景天多糖作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有鎮(zhèn)靜[2]、提高免疫力的功能[3-11]，還可以促進三磷酸腺苷（ATP）的合成[12]，調節(jié)機體生理能量狀態(tài)[13]，抗衰老、抗氧化[14-22]。近年來，國內外相繼報道了一些糖類作為非滲透性冷凍保護劑對冷凍精子有較好保護作用，以致糖類在精液冷凍乃至低溫生物學領域成為研究熱點。

豬精液保存技術推廣應用的重要性在于通過擴大精液使用的時間和地域范圍，提高優(yōu)秀種公豬的利用效率，從而降低公豬飼養(yǎng)成本，加速豬的遺傳改良，避免通過交配傳播疾病，同時也在豬品種資源和原始資源及基因庫種質資源保存等方面起重要作用。豬精子結構對溫度變化特別敏感，豬精液更適合液態(tài)保存。公豬精液常溫保存在生產上具有較大的實用價值。常溫保存人工授精的效果好，且方便經濟，但受到保存時間的限制[23-26]，4℃的豬精液保存，溫度介于常溫和冷凍保存間，精子代謝活動水平低，脂質過氧化程度低，相較于常溫保存更久，較冷凍保存則更經濟、便利。隨著保存時間的延長公豬精液會引發(fā)脂質過氧化，超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力下降和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量降低[27-28]，最終引發(fā)脂質過氧化，降低線粒體膜電位，提高等離子體膜透性，最終影響受胎率。

隨著現(xiàn)代化藏豬養(yǎng)殖生產技術的提高，為有效控制疫病傳播、降低飼養(yǎng)公豬的費用、提高豬群品質，解決藏豬精液的妥善保存問題，人工授精技術服務于藏豬產業(yè)發(fā)展已迫在眉睫。任子利等[29]研究了維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響，李文燁等[30-38]研究主要集中在利用紅景天多糖對豬精液冷凍效果的影響。但是，截至目前，關于紅景天多糖對藏豬精液常溫或4℃保存效果如何，鮮有報道。本研究擬在此研究的基礎上，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加紅景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環(huán)境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價精液品質指標，以SOD活性和MDA含量為評價抗氧化保護作用指標，探討紅景天多糖對4℃藏豬精液品質的影響。以期為藏豬精液低溫保存的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與材料

1.1.1 試驗動物與試驗地點 試驗藏豬為3～5歲健康種公豬9頭。試驗時間為2016年6—9月，試驗地點為西藏工布江達縣錯高鄉(xiāng)某藏豬養(yǎng)殖專業(yè)合作社、西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所和西藏大學農牧學院動物科學學院。

1.1.2 主要設備與試劑 動物電刺激采精儀（MDW-1，成都華智開物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡（IX73，奧林巴斯），電熱恒溫水槽（DKB-450A，上海森信），變頻冰箱（BCD-649WDVC，海爾），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥榮事達三洋電器股份有限公司）。

考馬斯亮藍（國藥集團化學試劑有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亞衛(wèi)精液稀釋粉（丹麥）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司）、SOD試劑盒和MDA測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

新鮮藏豬精液由西藏工布江達縣錯高鄉(xiāng)某藏豬養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅景天多糖的提取 紅景天產自西藏，購于拉薩市場醫(yī)藥銷售公司。參照文獻[32]將紅景天粉碎后置于蒸餾水（80℃）并浸泡5 h，取上清液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮，凍干處理經粉碎獲得紅景天多糖粉末，密封后置室溫保存。

1.2.2 改進的低溫稀釋液配制 參照孫時軍等[39]的試驗結果，使用亞衛(wèi)牌精液稀釋劑作為基礎稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護劑。

1.2.3 精液采集及處理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌內注射麻醉健康藏豬種公豬，用動物電刺激采精儀于3 V、50 mA條件下電刺激法采集健康藏豬精液。

將藏豬精液（精子活力0.8以上）做4倍稀釋，用6層以上紗布包裹后放入培養(yǎng)箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.4 精子質量評價 精子活力和精子畸形率兩項精液常規(guī)性狀參照世界衛(wèi)生組織標準（WHO）[40]的方法測定，具體方法如下。

精子活力：精液過濾后立即在顯微鏡下觀察精子活力，采用百分制法，直線前進精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比為精子活力。

精子畸形率：采用龍膽紫酒精溶液染色法，將精子涂片染色，在400倍顯微鏡下觀察，計算不同視野500個精子中畸形精子占比例即為畸形率（取3次計算的平均值）。

精子頂體完整率和精子質膜完整率兩項精液性狀參照文獻[41]進行評價。精子頂體完整率：考馬斯亮藍R250染色法。精子質膜完整率：低滲腫脹試驗—HOST。

1.2.5 精液抗氧化指標的測定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的測定，使用SOD試劑盒和MDA測定試劑盒，采用比色法測定精漿和精子中總SOD的活性及MDA含量。具體方法參照文獻[42]進行。

1.3 試驗設計

1.3.1 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液品質的影響試驗分5組，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加紅景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃保存到第5天時以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，探討紅景天多糖對4℃保存藏豬精液品質的影響。試驗重復3次。

1.3.2 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響 試驗分組同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鮮精液于玻璃離心管中，在4 000 r/min離心分離15 min，取精漿分裝于2 mL塑料離心管，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诰珴{生化參數(shù)及抗氧化指標的測定。試驗重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得試驗數(shù)據(jù)用Excel進行前期處理，再用SPSS 11.5軟件進行One-Way ANOVA方差分析，并進行多重比較，試驗結果用平均數(shù)±標準差表示，檢驗誤差為5%和1%。

2 結果與分析

2.1 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液品質的影響

由表1可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，9.0 mg/L紅景天多糖添加組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率這4個指標均極顯著好于其他組（P＜0.01）。7.0 mg/L與11.0 mg/L添加組除精子活力差異顯著外（P＜0.05），其他指標差異不顯著。7.0 mg/L和11.0 mg/L添加組與其他添加組的精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率差異均極顯著（P＜0.01）；7.0 mg/L與5.0 mg/L添加組精子活力差異顯著，但11.0 mg/L與5.0 mg/L添加組精子活力差異不顯著。

表1 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液品質的影響（n=27）

2.2 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響

由表2可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，精漿超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以9.0 mg/L紅景天多糖添加組為最高（P＜0.01）；同時發(fā)現(xiàn)，9.0 mg/L紅景天多糖添加組精子超氧化物歧化酶活力最高，5.0 mg/L、7.0 mg/L和11.0 mg/L組間無差異；精子MDA含量以9.0 mg/L紅景天多糖添加組為最高，較7.0 mg/L和11.0 mg/L、5.0 mg/L、3.0 mg/L和對照組差異極顯著（P＜0.01），7.0 mg/L和11.0 mg/L添加組無差異。

表2 紅景天多糖對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響（n=27）

3 討論

紅景天多糖抑制過氧化反應而提高對藏豬精子的保護效果。紅景天多糖具有抗氧化和抗細胞凋亡等多種生物活性[43-45]，且具有較強的清除超氧陰離子自由基（O2-）和抑制脂質過氧化作用的能力[46]，在溫度改變過程中抑制過氧化反應對精子的損傷。紅景天多糖的添加能有效提高精子內抗氧化酶的活力，對精子起到保護作用。

在4℃保存藏豬精液品質方面，添加紅景天多糖的各試驗組極顯著提高精子活力、精子頂體完整率、質膜完整率，降低了精子畸形率（P＜0.01）；與對照組相比，抗氧化保護方面精液中超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量均具有明顯的優(yōu)勢（P＜0.01）。

4 結論

本研究結果表明，在改進的豬精液稀釋液中添加9.0 mg/L紅景天多糖后將藏豬種公豬精液做4倍稀釋，可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，同時可明顯提高4℃保存對藏豬精液抗氧化保護作用。本試驗研究將為藏豬精液低溫保存的生產應用奠定基礎。

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（編輯：郭玉翠）

Effect of Rhodiola Polysaccharides on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
（1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co.,Ltd.,Lhasa 850009,China）

This study was conducted to investigate the effects of Rhodiola Polysaccharides on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add Rhodiola Polysaccharides 0 g,3.0 g,5.0 g,7.0 g,9.0 g,11.0 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity,sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of Rhodiola Polysaccharides on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase（SOD）and Maleic dialdehyde（MDA）were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,to the fifth days，Tibetan boar semen preserved at 4℃,sperm motility,sperm abnormality rate,sperm integrity rate and plasma membrane integrity rate with add group of Polysaccharide 9.0 mg/L from root of the root,these 4 indicators were significantly better than other groups（P＜0.01）.The sperm motility was significantly（P＜0.05）different between the 7.0 mg/L and 11.0 mg/L text groups,other indicators were not significant.Also,at the same time,we found that,addition of Polysaccharides from semen of low temperaturedilution liquid of Tibetan boar semen,9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides supplementation group sperm superoxide dismutase (SOD)activity is the highest,but there was no difference between 5 mg/L,7 mg/L and 11 mg/L groups.9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides supplementation group sperm MDA activity is the highest,compared with 7 mg/L and 11 mg/L,5 mg/L,3 mg/L and control group,the difference was very significant（P＜0.01）,7 mg/L and 11 mg/L add group no difference.In short adding 9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides to the improved pig semen diluent can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

RhodiolaPolysaccharides;Tibetanpig;environmentalscienceat4℃;semenquality;antioxidantprotection

S816.7

A

1002-1957(2016)06-0033-04

2016-10-31

西藏自治區(qū)自然科學基金（2016ZR-15-37）；西藏自治區(qū)2016年高校青年教師創(chuàng)新支持計劃項目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治區(qū)2016年農林業(yè)科技成果轉化與推廣（農牧業(yè)技術推廣）項目“特色畜禽（藏豬）營養(yǎng)調控研究”

陳曉英（1981-），女，甘肅武威人，助理研究員，碩士，主要從事高原畜禽繁殖技術研究工作.E-mail：chenxiaoying0891＠163.com

宋天增（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向為動物繁殖營養(yǎng)調控與遺傳育種.E-mail：songtianzeng123＠sina.com