祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒定量檢測(cè)中的應(yīng)用

祖立闖1，李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病[1]，該病流行范圍廣、致死率高、危害性大，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)殺手[2]。近年來我國豬瘟發(fā)病趨勢(shì)出現(xiàn)了明顯的變化，發(fā)病率明顯降低的同時(shí)出現(xiàn)了所謂的非典型豬瘟、溫和型豬瘟和無名高熱綜合征等[3]，使豬瘟野毒感染的臨床診斷以及豬瘟強(qiáng)毒株與疫苗毒的鑒別診斷變得非常困難但又十分必要，亟待建立一種可以準(zhǔn)確鑒別診斷豬瘟病毒強(qiáng)毒株敏感而特異的檢測(cè)方法。同時(shí)，由于豬瘟病毒不產(chǎn)生細(xì)胞病變，《中華人民共和國獸藥典》中對(duì)豬瘟疫苗的疫苗效力檢驗(yàn)采用兔體定型熱反應(yīng)方法[4]，該方法利用試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，成本較高、周期較長(zhǎng)、操作繁瑣，動(dòng)物個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，亟待建立新型實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗效力檢驗(yàn)替代方法。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[5]。通過對(duì)PCR過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，可專一、靈敏、快速、重復(fù)地精確定量起始模板濃度，真正實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，擁有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[6]，成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，為豬瘟的臨床診斷以及鑒別診斷、豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)等提供了技術(shù)支持。本文就熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究、豬瘟病毒臨床診斷、豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)、豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷等豬瘟病毒定量檢測(cè)中的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為提高我國豬瘟防控水平提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究中的應(yīng)用

熒光定量PCR方法的敏感性高，能夠準(zhǔn)確定量，對(duì)分析病毒的組織定位及病毒刺激相關(guān)細(xì)胞免疫因子的定量檢測(cè)提供了技術(shù)支持。牛金鵬等[7]為分析急性感染期豬瘟病毒的組織定位，及豬瘟病毒感染導(dǎo)致豬急性死亡的致病機(jī)理，根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟病毒石門株強(qiáng)毒基因序列，選擇5'UTR相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物，經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬瘟病毒的熒光定量RTPCR檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法對(duì)人工感染豬瘟病毒死亡病例的心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物等臟器中的豬瘟病毒進(jìn)行了定量檢測(cè)，扁桃體中豬瘟病毒含量最高，脾臟和回腸次之，心、肺、血清中病毒含量也比較高，淋巴結(jié)、肝臟、腎、骨髓和腦中病毒含量較低，該SYBR熒光定量PCR方法揭示了豬瘟強(qiáng)毒在急性感染期死亡豬體內(nèi)的分布情況，為豬瘟致病機(jī)理及感染控制的研究奠定了基礎(chǔ)。汪志艷等[8]為從細(xì)胞免疫水平評(píng)價(jià)豬瘟病毒弱毒疫苗的免疫效果，針對(duì)GenBank中豬IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，建立了檢測(cè)這3種細(xì)胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法，應(yīng)用3種細(xì)胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法對(duì)豬瘟活疫苗進(jìn)行細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)，IFN-γ、IL-2、TNF-α mRNA表達(dá)量在豬瘟病毒弱毒疫苗免疫后3～10 d之間均顯著升高，而IFN-γ在14 d仍保持高水平表達(dá)，表明在豬瘟活疫苗免疫后3 d，豬只已經(jīng)啟動(dòng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，IFN-γ、IL-2、TNF-α的mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，機(jī)體開始發(fā)揮其細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，成功解釋了豬瘟疫苗免疫后2～3周才能夠監(jiān)測(cè)到中和抗體，但在疫苗免疫后2～4 d，豬只卻能夠?qū)?qiáng)毒攻擊產(chǎn)生一定抵抗力的原因。

2 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒臨床診斷中的應(yīng)用

目前，我國動(dòng)物疫病感染情況日益復(fù)雜，混合感染情況不斷增加，僅憑臨床癥狀很難對(duì)致病原進(jìn)行確診。一般確診豬瘟病毒主要依據(jù)病毒的分離鑒定、RT-PCR、ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)等，但這些檢測(cè)方法均有其不足，比如病毒分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)等血清學(xué)方法敏感性較低、不能早期檢測(cè)，普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能對(duì)病毒進(jìn)行定量。熒光定量PCR以其快速、高效、特異、靈敏、定量準(zhǔn)確等廣泛應(yīng)用到豬瘟病毒的臨床診斷中。2012年錦州市周邊一存欄200頭的豬場(chǎng)，突然暴發(fā)以肥育豬厭食、精神不振、體溫高熱達(dá)40℃、可視黏膜和皮膚有針尖大小密集出血點(diǎn)為主要特征的疫病，采集病死豬的組織病料，應(yīng)用豬瘟實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)證實(shí)此次疫病由豬瘟病毒感染所致[9]。熒光定量PCR技術(shù)特異、敏感，為臨床豬瘟病毒感染的診斷和制定科學(xué)合理的凈化方案提供了技術(shù)保障。

3 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗在豬瘟防控中起著重要的作用，但豬瘟弱毒疫苗的抗原效價(jià)或疫苗效力檢驗(yàn)主要采用兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法受試驗(yàn)操作、試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、環(huán)境因素及原材料等多方面原因限制了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。鑒于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，最主要的是能夠?qū)Σ《竞窟M(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，已被廣泛地應(yīng)用于豬瘟疫苗的檢驗(yàn)中。范斌等[10]在豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒基因組5'非編碼區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品引物、1對(duì)特異性引物和1條探針，建立了評(píng)價(jià)豬瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測(cè)的敏感度達(dá)1.2×105拷貝/mL，應(yīng)用該方法對(duì)6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的7種豬瘟兔化弱毒活疫苗的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，不同廠家疫苗的效價(jià)差異明顯，最高可相差3個(gè)數(shù)量級(jí)，建議在選擇豬瘟疫苗免疫接種前應(yīng)該先定量檢測(cè)疫苗中病毒含量，根據(jù)病毒含量進(jìn)行免疫接種。章秋月等[11]收集福建省內(nèi)使用的10個(gè)不同廠家生產(chǎn)的23個(gè)批次豬瘟弱毒疫苗，應(yīng)用熒光定量RTPCR方法檢測(cè)疫苗中病毒核酸的含量，抽檢23個(gè)豬瘟疫苗樣品合格率僅為69.56%，其中傳代細(xì)胞苗的病毒含量相對(duì)較高，脾淋苗病毒含量?jī)?yōu)于細(xì)胞苗，不同廠家生產(chǎn)的同類型疫苗病毒含量差異大，同一廠家生產(chǎn)的同類疫苗存在批間差異。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟疫苗病毒含量是一種便捷、高效的方法，為豬瘟疫苗的檢驗(yàn)提供了科學(xué)、有效的指導(dǎo)依據(jù)。

4 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用對(duì)控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用，但由于該疫苗為活疫苗，且沒有分子標(biāo)記，使豬瘟疫苗免疫豬與豬瘟病毒強(qiáng)毒株感染豬難以區(qū)分，給豬瘟病毒強(qiáng)毒株的鑒別診斷帶來很大困難。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、兔體定型熱反應(yīng)法、動(dòng)物接種試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光試驗(yàn)、膠體金試紙條等檢測(cè)技術(shù)均不能對(duì)疫苗株和強(qiáng)毒株進(jìn)行區(qū)分，RT-PCR方法雖可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)毒株與疫苗株的鑒別診斷，但常規(guī)RT-PCR方法敏感性較低，容易漏檢。熒光定量RT-PCR方法的敏感性較常規(guī)RTPCR高，且可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，可以作為豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株的鑒別診斷技術(shù)在臨床中推廣應(yīng)用。杜冬華等[12]為建立豬瘟病毒野毒株和疫苗株快速定量鑒別檢測(cè)方法，分別根據(jù)野毒株和疫苗株E2基因序列差異設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物及1條TaqMan探針，建立了能同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒野毒株和疫苗株的雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測(cè)方法，該雙重TaqMan real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與1×101～1×106拷貝/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)10拷貝/μL，且特異性和重復(fù)性很好。豬瘟病毒野毒株與疫苗株熒光定量鑒別檢測(cè)方法可用于豬瘟病毒野毒株和疫苗株的鑒別診斷及病原定量分析，將為我國豬瘟病毒野毒株感染及疫苗免疫情況的調(diào)查與分析提供高效、快速的檢測(cè)手段，為更好地防控豬瘟的發(fā)生與流行奠定了基礎(chǔ)。

5 小結(jié)與展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是結(jié)合常規(guī)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)定量檢測(cè)技術(shù)，與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、特異性更強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)、自動(dòng)化檢測(cè)、不需核酸電泳檢測(cè)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，成為目前豬瘟病毒檢測(cè)中最準(zhǔn)確的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨完善，其在豬瘟病毒的定量檢測(cè)中將會(huì)得到進(jìn)一步完善和應(yīng)用，將逐步成為豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的替代評(píng)價(jià)方法、豬瘟病毒臨床診斷尤其是豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷的主要方法，以及豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究必不可少的重要方法。雖然該技術(shù)需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備、試劑，但隨著國家對(duì)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室建設(shè)資金投入的不斷增加，熒光定量PCR技術(shù)將逐步成為豬瘟病毒檢測(cè)中最準(zhǔn)確、適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的方法，不斷為我國豬瘟的綜合防控事業(yè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

[1]魏鳳，張文通，李峰，等.一起豬瘟的診治[J].養(yǎng)豬，2016（4）：108-109.

[2]任寶忠.豬瘟防控存在的問題與對(duì)策[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（3）：153.

[3]馬萍，李達(dá)，湯德元，等.鑒別豬瘟野毒與疫苗毒的單一與二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（9）：2230-2239.

[4]王豐，馮志新，還紅華，等.自動(dòng)測(cè)溫技術(shù)用于豬瘟活疫苗兔體熱型判定研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（10）：1668-1673.

[5]歐陽松應(yīng)，楊冬，歐陽紅生，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2004，24（1）：742-761.

[6]王季秋，趙欣，王照，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及其在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國地方病防治雜志，2016，31（5）：517-519.

[7]牛金鵬，韓雪英，郝華芳，等.SYBR熒光定量PCR方法分析豬瘟石門強(qiáng)毒的組織分布[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（12）：1798-1801.

[8]汪志艷，劉永剛，王剛，等.豬全血中IFN-γ、IL-2、TNF-α Taq Man定量RT-PCR方法的建立及對(duì)豬瘟疫苗的免疫評(píng)價(jià)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：164-168.

[9]李霞.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例豬瘟的診斷報(bào)告[J].中國動(dòng)物保健，2012，14（10）：61.

[10]范斌，許文花，韓建強(qiáng)，等.豬瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：56-61.

[11]章秋月，馬華魁，鄭新平，等.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量[J].福建畜牧獸醫(yī)，2016，38（4）：3-6.

[12]杜冬華，薛擁志，王愛華，等.豬瘟病毒野毒株與疫苗株E2基因雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測(cè)方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（12）：1898-1902.

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0119-02

2016-10-13

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)任務(wù)（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com