游文忠，周發(fā)為,盧巧，黃華

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,1.小兒內(nèi)科;2.檢驗(yàn)科，湖北 恩施 445000)

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川崎病患兒T細(xì)胞免疫功能的變化及臨床意義

游文忠1，周發(fā)為2,盧巧1，黃華1

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,1.小兒內(nèi)科;2.檢驗(yàn)科，湖北 恩施 445000)

目的：觀察川崎病(kawasaki disease，KD)患兒體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，分析其在KD發(fā)病中的意義。方法：選取KD患兒55例設(shè)為KD組，同期住院的普通發(fā)熱非KD患兒47例設(shè)為非KD組，另選取同期門診體檢的健康兒童40例設(shè)為對照組。使用流式細(xì)胞儀檢測各組兒童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+比例，分析ROC曲線特征。使用ELISA法檢測各組兒童血清白介素6(IL-6)、IL-1β及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果：KD急性期患兒組外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD組及對照組；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例高于另兩組(P<0.01)。KD組患兒血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯高于非KD組及對照組(P<0.01)，非KD組IL-1β及IL-6水平高于對照組(P<0.01)。KD患兒CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+ROC曲線對KD的診斷界值分別為54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%。結(jié)論：KD患兒體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡，表現(xiàn)為CD4+CD25+、CD3+CD8+減少，CD3+CD4+、CD3+CD19+比例及CD4+/CD8+比值升高，且IL-6、TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子水平升高，可能參與了KD病理過程。

川崎病;兒童;T淋巴細(xì)胞;細(xì)胞因子;免疫功能;診斷界值

川崎病(kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(MCLS)，是臨床較為常見的血管炎性綜合征，發(fā)病機(jī)制至今不明，多發(fā)于5歲以下嬰幼兒且發(fā)病率逐年增加。臨床以持續(xù)性發(fā)熱、球結(jié)膜充血、口唇病變、皮疹、頸淋巴結(jié)腫大為主要表現(xiàn)，若治療不及時，易引起小兒后天性心臟病，嚴(yán)重影響患兒的健康發(fā)育及生活質(zhì)量[1]。KD的診斷缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，僅憑早期臨床表現(xiàn)難以確診，且該病不典型病例發(fā)生率高達(dá)10%～20%。研究表明遺傳易感性、微生物感染、血管基質(zhì)的代謝紊亂、T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答失調(diào)等因素在KD發(fā)病中具有重要作用[2]，其中免疫學(xué)異常在該病發(fā)病中具有十分重要的作用[3-4]。本研究檢測了KD患兒體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，分析其在KD發(fā)病中的意義，為該疾病的早期診斷提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2015年9月于湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院小兒內(nèi)科住院治療的KD患兒55例設(shè)為KD組，均符合2005年版《實(shí)用兒科學(xué)》制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中男性37例，女性28例；年齡6個月～7歲，平均(2.9±0.7)歲；病程5～10 d，平均(6.2±1.5)d。入組標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)熱5 d以上；②手足癥狀：末端梭形腫脹，熱退脫皮；③皮膚多形紅斑；④粘膜改變：口腔粘膜牛肉色，球結(jié)膜充血；⑤口唇干裂、楊梅舌；⑥非化膿性頸部淋巴結(jié)炎。排除入組前使用免疫功能調(diào)節(jié)藥物患兒、合并其他免疫系統(tǒng)疾病患兒。選取同時期住院的普通發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大非KD患兒47例設(shè)為非KD組，男性27例，女性20例，年齡6個月～6歲，平均(2.7±0.7)歲；病程1～6 d，平均(3.5±1.2)d。另選取同期門診體檢的健康兒童40例設(shè)為對照組，男性26例，女性14例；年齡6個月～6歲，平均(2.8±0.6)歲。3組嬰幼兒年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測方法

3組兒童入院后采集靜脈血5 mL置于肝素抗凝管內(nèi)，-70 ℃保存以備檢測。每份標(biāo)本分別取抗凝血100 μL，加FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體、PE標(biāo)記的CD8單克隆抗體、ProcP標(biāo)記的CD3+單克隆抗體(均購自美國賽默飛世爾公司)各20 μL，室溫避光孵育15～20 min。4 ℃ 0.01 mol/L的PBS洗滌二次，加1%多聚甲醛0.5 mL，使用Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)，激發(fā)光波長488 nm。每份樣本獲取細(xì)胞數(shù)10 000個，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以相應(yīng)血液標(biāo)本做各自同型陰性對照。

1.3 ELISA檢測方法

每份標(biāo)本分別取抗凝血清100 μL，使用ELISA法檢測血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察KD組患兒、非KD組患兒，及對照組兒童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+水平，以及IL-6、TNF-α及IL-1β水平，同時分析KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群ROC曲線特征。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3組兒童外周血各淋巴細(xì)胞比較

KD急性期患兒組外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD組及對照組；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例顯著高于后兩組兒童，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。非KD組患兒與對照組兒童淋巴細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較±s)

*P<0.01，與非KD組比較； #P<0.01，與對照組比較。

2.2 KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群ROC曲線特征分析

KD患兒CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+亞細(xì)胞群對KD的診斷界值分別為54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%，相應(yīng)特征見表3。

表2 KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群ROC曲線特征(%)

2.3 3組兒童血清細(xì)胞因子水平比較

KD組患兒血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯高于非KD組及對照組(P<0.01)，非KD組IL-1β及IL-6水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表3 3組兒童血清細(xì)胞因子水平比較±s，pg/mL)

*P<0.01，與非KD組比較； #P<0.01，與對照組比較。

3 討論

KD是一種病因不明、急性自限性血管炎性綜合征，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頸淋巴結(jié)腫大、一過性皮疹、球結(jié)膜充血等，若未經(jīng)及時治療，可并發(fā)冠脈損傷、心肌梗死，甚至心源性猝死，是引發(fā)兒童后天獲得性心臟病的原因之一[6-7]。

臨床研究表明KD患兒體內(nèi)存在免疫系統(tǒng)過度激活，T淋巴細(xì)胞亞群失衡，即抑制性/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞群(CD4+CD25+、CD3+CD8+)減少，輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞群(CD3+CD4+、CD3+CD19+)數(shù)目增加，CD4+/CD8+比值升高[8-9]。過度活化的CD4+細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等，可能是引起本病急性發(fā)熱反應(yīng)的原因[10-11]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目減少，對T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的抑制作用減弱，導(dǎo)致機(jī)體抗體分泌增加。本研究結(jié)果顯示KD組患兒體內(nèi)存在免疫異?；罨?，且CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的敏感度、特異度相對較高，其診斷界值與KD的診斷結(jié)果具有較高符合度，與郭曉軍等[12]研究一致，表明淋巴細(xì)胞亞群含量檢測及ROC曲線特征可作為KD簡便的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，有助于KD早期診斷。

研究[13]發(fā)現(xiàn)，KD患兒急性期血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，這可能與冠狀動脈血管炎、腦部血管炎癥等，以及深層次的免疫損傷機(jī)制相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)KD組患兒上述3項(xiàng)指標(biāo)均明顯增高。有助于KD的臨床診斷。而韓云坤等[14]研究發(fā)現(xiàn)KD急性期患兒的IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，而在亞急性期有所下降，但I(xiàn)L-6水平仍高于對照組，TNF-α、IL-1β與熱性對照組間無顯著性差異，表明KD亞急性期炎癥因子水平檢測對疾病診斷的假陽性可能性較大，在細(xì)胞因子檢測方面不及淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果可信度高。

綜上所述，KD患兒體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡及炎癥介質(zhì)異常，可能參與了KD病理進(jìn)程。KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測，有助于早期診斷KD患兒，評價疾病狀態(tài)，指導(dǎo)治療。

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(學(xué)術(shù)編輯：皮光環(huán))

Changes of T cell immune function and the clinical significance in infants with kawasaki disease

YOU Wen-zhong1,ZHOU Fa-wei2,LU Qiao1,HUANG Hua1

(1.InternalMedicineDepartmentofPediatrics;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,MindaHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,Hubei,China)

Objective：To observe the changes of T lymphocyte subsets and relative cytokines in infants with kawasaki disease (KD) and to observe their significance in process of KD.Methods：A total of 55 infants with KD were selected as KD group,while 47 infants with non-KD in corresponding period served as non-KD group,and another 40 healthy infants undergoing physical examinations as control group.Flow cytometer (FCM) was used to detect the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ in all groups and analyze the curve characters of receiver operating characteristic (ROC).Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the levels of serum interleukin 6 (IL-6),IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in all groups.Results：KD group was evidently lower in the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD8+ and CD4+CD25+,but markedly higher in the ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ than other two groups (P<0.01).KD group was notably higher in levels of serum TNF-α,IL-1β and IL-6 than other two groups (P<0.01),whereas non-KD groups was significantly higher in levels of IL-1β and IL-6 than control group (P<0.01).The diagnostic critical values of ROC curves of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ were 54.5%,28.6%,20.4%,26.1%,1.8% and 6.0% respectively.Conclusion：Infants with KD have imbalance of T lymphocyte subsets marked by reduced CD4+CD25+ and CD3+CD8+,increased ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ as well as levels of IL-6,TNF-α and IL-1β,which may participate in the pathological process of KD.

Kawasaki disease;Children;T lymphocyte;Cytokine;Immune function;Diagnostic critical value

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.031

2016-06-22

游文忠(1964-)，男，主任醫(yī)師。

黃華，E-mail：hhyjxx@sohu.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.062.html

1005-3697(2016)06-0888-03

R725.4

A