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        糖尿病性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的體視學(xué)研究

        2016-02-07 00:35:31林菁艷陳靜黃三林靜馬丁彭彬
        關(guān)鍵詞:背角神經(jīng)痛切片

        林菁艷,陳靜,黃三,林靜,馬丁,彭彬

        (1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系;2.南充市中心醫(yī)院;3.川北醫(yī)學(xué)院細(xì)胞化學(xué)研究室,四川 南充 637000)

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        糖尿病性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的體視學(xué)研究

        林菁艷1,陳靜2,黃三1,林靜1,馬丁1,彭彬3

        (1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系;2.南充市中心醫(yī)院;3.川北醫(yī)學(xué)院細(xì)胞化學(xué)研究室,四川 南充 637000)

        目的:探討糖尿病性神經(jīng)痛(painful diabetic neuropathy,PDN)大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的變化。方法:10只健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為兩組(n=5):PDN組和對(duì)照組(C組)。PDN組采用腹腔注射6%STZ 60 mg/kg建立糖尿病大鼠模型,C組腹腔注射等容生理鹽水。注射后72 h測(cè)定空腹血糖(FBG),以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病建模成功。注射STZ前1 d及血糖升高后第4、7、14、28 天分別測(cè)定大鼠的機(jī)械痛閾。第28天測(cè)痛后取L5段脊髓,進(jìn)行突觸素免疫組織化學(xué)染色,采用光學(xué)體視框交替計(jì)數(shù)一側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸的數(shù)量。結(jié)果:PDN組大鼠FBG均達(dá)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),自FBG升高后 4 d開始痛閾降低,至28 d時(shí)未恢復(fù)。與C組比較,PDN組L5節(jié)段脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增加(P<0.05)。結(jié)論:PDN大鼠脊髓背角突觸數(shù)量增加,突觸數(shù)量增加可誘導(dǎo)PDN的發(fā)生。

        糖尿病性神經(jīng)痛;中樞敏化;突觸可塑性;骨髓背角

        糖尿病性神經(jīng)痛(painful diabetic neuropathy,PDN)是神經(jīng)病理性疼痛的一種類型,是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。其主要表現(xiàn)為感覺麻木,自發(fā)性疼痛,痛覺過(guò)敏和異常疼痛[1]等。文獻(xiàn)報(bào)道,其發(fā)病率為20%~47%[2-3],長(zhǎng)期慢性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活。由于目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制了解不多,故而臨床治療滿意度并不高。過(guò)去曾認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制主要為周圍神經(jīng)病變,外周神經(jīng)敏化。目前,越來(lái)越多的研究顯示,PDN的發(fā)生不僅存在周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性改變(中樞敏化)也是其可能機(jī)制[4-5]:PDN大鼠脊髓背角內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸后電位增強(qiáng)[6],N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體和γ-氨基丁酸B(GABAB)受體失衡[6],脊髓背角內(nèi)傷害感受性神經(jīng)元回路改變[7]及感覺神經(jīng)傳入纖維增多[8]。據(jù)此我們推測(cè):上述脊髓背角內(nèi)的可塑性變化,可能造成PDN大鼠脊髓背角內(nèi)感覺神經(jīng)元之間建立新的突觸聯(lián)系,導(dǎo)致突觸數(shù)量增加,從而導(dǎo)致脊髓背角內(nèi)感覺神經(jīng)元興奮性增強(qiáng),感受野擴(kuò)大,其相應(yīng)的外周感受野對(duì)同樣刺激的感受增強(qiáng),閾值降低,進(jìn)而引起自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏和異常疼痛,導(dǎo)致PDN的發(fā)生發(fā)展和維持。目前尚未見PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量的相關(guān)報(bào)道。因此,本研究擬采用體視學(xué)方法——光學(xué)體視框來(lái)觀測(cè)PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸和神經(jīng)元數(shù)量的變化,為PDN發(fā)生的中樞敏化機(jī)制增添新的解剖學(xué)資料。

        1 方法

        1.1 動(dòng)物選擇及分組

        健康成年SD雄性大鼠10只,體重220~250 g,由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(川)2008-18]提供。隨機(jī)分為兩組(n=5):PDN組和生理鹽水對(duì)照組 (C組)。所有動(dòng)物單籠喂養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,晝夜交替。適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均符合本院倫理委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

        1.2 糖尿病大鼠模型的制備

        所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后禁食12 h,分別經(jīng)腹腔注射6% STZ (sigma公司,美國(guó))60 mg/kg和等容積的生理鹽水。72 h后取尾靜脈血,以強(qiáng)生倍優(yōu)型血糖儀及配套試紙測(cè)定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG),以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病造模成功標(biāo)志[9-11]。

        1.3 機(jī)械痛閾測(cè)定

        分別于注射STZ前1 d、FBG升高后第1、7、14、28 天時(shí)采用動(dòng)態(tài)平板Von Frey測(cè)痛儀(Ugo Basil,37450,意大利)采用改良“up and down”法測(cè)定大鼠雙側(cè)后足的50%縮腿閾值[12-14](PWT):將大鼠放在一鐵絲網(wǎng)架上,用透明塑料觀察框罩住。待大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min,并處于清醒、安靜狀態(tài)(無(wú)走動(dòng),無(wú)洗臉、瘙癢等動(dòng)作),以測(cè)痛儀依次交替刺激大鼠一側(cè)后肢第4、5趾底,從低到高選擇刺激力度,刺激力度從10 g開始,若無(wú)反應(yīng),則以2 g的間距逐漸增加刺激力度。為避免對(duì)大鼠造成損傷,最大刺激力度為30 g,每個(gè)力度刺激6~8 s,重復(fù)4次,相鄰刺激位置間隔一定距離,以避免出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。4次刺激一旦有1次出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),則繼續(xù)該刺激2次,6次刺激中有3次陽(yáng)性反應(yīng)的刺激力度則為該側(cè)后足的50%縮腿閾值。

        1.4 切片制備

        FBG升高后第28天時(shí),測(cè)試痛閾后經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,開胸,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,剪開右心耳,以生理鹽水灌注沖洗血液。待右心耳流出液體變清亮后,以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流內(nèi)固定。待大鼠頸部及肝臟僵硬時(shí),灌注結(jié)束。分離脊髓,取L5節(jié)段石蠟包埋。沿垂直于脊髓長(zhǎng)軸的方向,從中連續(xù)切取30張14 μm厚的切片,按照等距隨機(jī)原則,每隔6張抽取一張切片,抽取的第一張切片在前6張切片中隨機(jī)選取,共抽取5張切片。按這種方法抽選出2套切片,分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)尼氏染色(顯示神經(jīng)元為主)和突觸素的免疫組織化學(xué)染色(顯示突觸前終末為主,其數(shù)量即突觸數(shù)量)[14-15]。

        1.5 突觸素免疫組織化學(xué)染色

        切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,經(jīng)0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)、3%H2O2去離子水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和山羊血清封閉非特異性抗原后,滴加小鼠抗大鼠突囊泡蛋白單克隆抗體(稀釋度1∶500,Millipore公司,美國(guó)) 4 ℃孵育24 h。依次加入生物素二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),每一操作步驟期間用0.01 mol/L的PBS液沖洗3 min×3次。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分色,常規(guī)脫水,透明,封片。另取相鄰切片,采用正常山羊血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

        1.6 尼氏染色

        切片常規(guī)脫蠟至水后,置入57 ℃的0.01%甲苯胺藍(lán)溶液中染色5 min,自來(lái)水終止,經(jīng)95%乙醇分色后,常規(guī)脫水,透明,封片。

        1.7 體視學(xué)估計(jì)

        對(duì)各組內(nèi)切片脊髓背角的左右側(cè)交替進(jìn)行觀測(cè),以消除動(dòng)物自身因素可能造成的誤差。采用現(xiàn)代體視學(xué)設(shè)備NewCAST系統(tǒng)(Visiopharm公司,丹麥)及BX51型光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本),在電腦上進(jìn)行觀測(cè)。先在低倍物鏡下勾勒出所選定側(cè)脊髓背角區(qū)域[12-13]并測(cè)定其面積(A)。UPlanSApo油鏡(×100, 數(shù)值孔徑1.40)下進(jìn)行計(jì)數(shù)。組織圖像的最終放大倍數(shù)為2 240。

        1.7.1 突觸的計(jì)數(shù) 參照文獻(xiàn)[14-16]介紹的方法進(jìn)行計(jì)數(shù):首先在勾選區(qū)域的最左上角隨機(jī)確定第一個(gè)測(cè)試視野,然后按照0.2 μm的間距利用電動(dòng)載物臺(tái)在勾選區(qū)域內(nèi)由系統(tǒng)自動(dòng)等距抽選視野。油鏡下,每個(gè)視野疊加2個(gè)面積為57.02 μm2的長(zhǎng)方形測(cè)試框。

        從切片上表面向下0.5 μm的光學(xué)切片平面開始,手動(dòng)調(diào)節(jié)向下連續(xù)聚焦觀察3 μm厚的切片組織,根據(jù)光學(xué)體視框計(jì)數(shù)法則[9-11,14]計(jì)數(shù)體視框(每個(gè)體視框的體積為57.02 μm2×3 μm=171.06 μm3)內(nèi)的突觸素顆粒的數(shù)量。

        所計(jì)數(shù)的突觸素顆粒的總數(shù)除以用于計(jì)數(shù)的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內(nèi)的突觸的數(shù)量(Nv,即數(shù)密度)。將所得突觸數(shù)量乘以1 mm長(zhǎng)脊髓節(jié)段內(nèi)脊髓背角的體積(A×1 mm),即得每1 mm長(zhǎng)脊髓內(nèi)所測(cè)突觸的數(shù)量(不考慮切片壓縮)。

        1.7.2 神經(jīng)元計(jì)數(shù) 系統(tǒng)自動(dòng)的等距隨機(jī)抽選一定的脊髓背角區(qū)域,在每個(gè)視野上隨機(jī)疊加一個(gè)面積為2 074.22 μm2的長(zhǎng)方形光學(xué)體視框。脊髓背角區(qū)域內(nèi)的測(cè)試總面積設(shè)定為脊髓背角橫切面積的5%。從切片上表面向下0.5 μm的光學(xué)切片平面開始,向下連續(xù)聚焦觀察7 μm厚的切片組織,根據(jù)光學(xué)體視框計(jì)數(shù)法則計(jì)數(shù)體視框(體視框的體積為2 074.22 μm2×7 μm=14 519.54 μm3)內(nèi)的神經(jīng)元核仁數(shù)。所計(jì)數(shù)的核仁總數(shù)除以用于計(jì)數(shù)的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內(nèi)的核仁數(shù)量。脊髓背角內(nèi)每個(gè)神經(jīng)元的細(xì)胞核內(nèi)通常都有且只有1個(gè)核仁,很少有2~3個(gè)核仁,因此我們估計(jì)的核仁數(shù)等于神經(jīng)元數(shù)。將所得神經(jīng)元數(shù)量乘以1 mm長(zhǎng)脊髓節(jié)段內(nèi)脊髓背角的體積,即得每1 mm長(zhǎng)脊髓內(nèi)所測(cè)神經(jīng)元的數(shù)量(不考慮切片壓縮)。

        1.7.3 突觸/神經(jīng)元比值 以單位長(zhǎng)度脊髓背角內(nèi)的突觸數(shù)量除以神經(jīng)元數(shù)量,即得突觸/神經(jīng)元比值。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠血糖及機(jī)械痛閾

        PDN組大鼠在注射STZ72h后FBG均>11.1mmol/L,且不隨時(shí)間推移而下降,同時(shí)還伴隨皮毛光澤度下降、色黃,精神萎靡等癥狀。

        與造模前及C組相比,PDN組大鼠在FBG升高后4d開始出現(xiàn)痛閾降低,至術(shù)后28d時(shí)未恢復(fù)(P<0.05,表1)。

        表1 空腹血糖升高前后各時(shí)間點(diǎn)大鼠50%縮爪閾值的變化(n=5)

        組別升高前1d升高后4d升高后7d升高后14d升高后28dPDN組18.8±0.613.8±0.4*#10.6±0.7*#11.8±1.4*#11.0±0.6*#C組19.2±0.817.6±1.717.6±0.718.0±0.517.8±0.5

        *P<0.05,與血糖升高前相比;#P<0.05,與C組相比。

        2.2 L5節(jié)段脊髓背角內(nèi)體視學(xué)測(cè)量

        與C組相比,PDN組大鼠在FBG升高后28 d時(shí)單位長(zhǎng)度脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量及突觸/神經(jīng)元比值明顯升高(P<0.05),而神經(jīng)元數(shù)量及兩組大鼠脊髓背角面積無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2,圖1)。

        表2 血糖升高后第28 d時(shí)各組大鼠的L5段脊髓背角內(nèi)體視學(xué)結(jié)果(n=5)

        PDN組C組脊髓背角面積(mm2)0.56±0.060.51±0.08突觸數(shù)量(106/mm長(zhǎng)脊髓)16.05±2.72*11.82±2.69神經(jīng)元數(shù)量(103/mm長(zhǎng)脊髓)71.98±12.4968.07±9.54突觸/神經(jīng)元比值224.08±22.30*172.20±18.20

        *P<0.05,與C組相比。

        3 討論

        STZ通過(guò)直接破壞大鼠胰島β細(xì)胞而誘發(fā)糖尿病,廣泛用于糖尿病動(dòng)物模型的制備[20-21]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取STZ 60 mg/kg用于建立糖尿病大鼠模型。PDN組大鼠在注射STZ后72h的FBG均達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。在FBG升高后第4d出現(xiàn)機(jī)械痛閾明顯降低,至28 d時(shí)未恢復(fù)。說(shuō)明PDN建模成功并持續(xù)發(fā)展。

        體視學(xué)(stereology)是始于20世紀(jì)60年代的一門學(xué)科,是利用所測(cè)結(jié)構(gòu)的圖像的幾何特征來(lái)定量研究所測(cè)結(jié)構(gòu)本身的幾何特征(包括體積、表面積、長(zhǎng)度、數(shù)目等)的方法學(xué)[19]。體視學(xué)方法中的系統(tǒng)抽樣和體視框的運(yùn)用,提供了較高水平的解剖分辨力,在粒子定量研究方面較傳統(tǒng)的基于對(duì)灰度值、光密度的比較等方法有著更為客觀和準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)[22]。

        采用體視學(xué)的新工具——光學(xué)體視框,我們前期實(shí)驗(yàn)[14-15]已經(jīng)證明,坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性痛大鼠其脊髓背角的可塑性改變主要發(fā)生在L5節(jié)段,因此本研究中主要觀測(cè)了L5節(jié)段突觸和神經(jīng)元數(shù)量的變化。

        研究表明:PDN的發(fā)生機(jī)制不僅僅是周圍神經(jīng)病變,中樞敏化也在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級(jí)中樞。PDN的外周神經(jīng)病變導(dǎo)致傷害性傳入沖動(dòng)增加,可導(dǎo)致初級(jí)感覺神經(jīng)元過(guò)度興奮,進(jìn)而引發(fā)脊髓背角傷害感受性神經(jīng)元興奮性增高,突觸聯(lián)系發(fā)生功能性或質(zhì)的變化,進(jìn)而發(fā)生中樞敏化,導(dǎo)致痛覺過(guò)敏或自發(fā)痛。PDN大鼠脊髓背角內(nèi)神經(jīng)回路發(fā)生重組,感覺神經(jīng)纖維傳入增多[8],因此可能建立新的突觸聯(lián)系,導(dǎo)致PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增多。本研究采用現(xiàn)代體視學(xué)方法,證明了PDN大鼠L5節(jié)段單位體積脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量明顯增多而神經(jīng)元數(shù)量無(wú)顯著性改變。同時(shí),考慮到脊髓在組織學(xué)處理過(guò)程中可能產(chǎn)生的變化,我們還計(jì)算了突觸/神經(jīng)元比值。這一比值不受參照空間(脊髓背角)體積改變的影響,其結(jié)果與突觸數(shù)量的變化具有一致性,說(shuō)明單個(gè)神經(jīng)元所擁有的突觸數(shù)量增加。

        突觸數(shù)量的增加可能導(dǎo)致神經(jīng)元的一系列功能變化:谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸后電位增強(qiáng)[6],突觸內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的合成與釋放增加,感覺神經(jīng)元沖動(dòng)的發(fā)放和傳導(dǎo)頻率增加、速度增快,從而導(dǎo)致糖尿病性神經(jīng)痛患者自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏和異常疼痛的發(fā)生。而增加的突觸中興奮性或抑制性突觸的比例,以及其他脊髓階段內(nèi)甚至更高一級(jí)中樞——大腦中相關(guān)區(qū)域是否有相應(yīng)的突觸可塑性改變尚有待進(jìn)一步研究。

        綜上所述,PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增多,可能導(dǎo)致感覺神經(jīng)元興奮性增加,其相應(yīng)的外周感受野對(duì)同樣刺激的感受增強(qiáng),閾值降低,感受野擴(kuò)大,進(jìn)而引起自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏和異常疼痛,導(dǎo)致PDN的發(fā)生發(fā)展和維持。本研究為闡明PDN發(fā)生的中樞機(jī)制增添了新的解剖學(xué)證據(jù),提示脊髓背角突觸數(shù)量的增加可能是導(dǎo)致糖尿病性神經(jīng)痛患者中樞敏化和自發(fā)痛、痛覺過(guò)敏及異常疼痛的解剖學(xué)基礎(chǔ)。也為糖尿病性神經(jīng)痛的治療提供了新的思路:抑制脊髓背角內(nèi)感覺傳入纖維的增加和突觸數(shù)量的增多。

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        (學(xué)術(shù)編輯:文曉紅)

        Stereological study on the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy

        LIN Jing-Yan1,CHEN Jing2,HUANG San1,LIN Jing1,MA Ding1,PENG Bin3

        (1.DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege;2.NanchongCentralHospital;3.CytochemicalResearchLaboratory,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

        Objective:To investigate the plasticity change of the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy.Methods:10 healthy adult male SD rats were randomly divided into 2 groups (n=5): the PDN group and the control group.Rats in the two groups were intraperitoneally injected with 6%STZ 60mg/kg or normal saline respectively.72 hours after injection,fasting blood glucose (FBG) were measured,FBG>11.1 mmol/L were considered a successful diabetes mellitus model.1day before injection and4,7,14,28 days after increasing of FBG,the mechanical pain threshold were measured.28 days after increasing of FBG,the L5 segment of spinal cord were separated and stained with synaptophysin immunohistochemisty.The numerical density of synapses in the spinal dorsal horn was estimated respectively.Results:In the PDN group,FBG rose after injection of STZ,and the pain threshold decreased 4 days after increasing of FBG.Compared to control group,numerical density of synapses increased significantly in the spinal dorsal horn in the PDN group (P<0.05).Conclusion:The rat model of PDN is associated with increase of the synaptic numbers in the spinal dorsal horn of L5 segment.

        Painful diabetic neuropathy;Central sensitization;Synaptic plasticity;Spinal dorsal horn

        10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.008

        四川省科技廳項(xiàng)目(2013JY0161);四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(16ZA0238,15ZA0214)

        2016-08-28

        林菁艷(1979-),女,博士,副教授。

        彭彬,E-mail: 340255492@qq.com

        時(shí)間:2017-1-3 22∶01

        http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.016.html

        1005-3697(2016)06-0809-04

        R741

        A

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