蒲超，張珊珊，李偉，吳青霞，吳輝

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院骨科；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000)

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犬骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)及分化鑒定

蒲超1，張珊珊2，李偉1，吳青霞1，吳輝1

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院骨科；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000)

目的：建立犬骨髓間質(zhì)干細胞(dog bone mesenehymal stem cells，dBMSCs)的體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定的方法。方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離dBMSCs，并通過不斷傳代進行純化和擴增培養(yǎng)。誘導(dǎo)dBMSCs向成骨、成脂細胞分化，并分別以礦化(鈣)結(jié)節(jié)茜素紅染色、油紅O染色鑒定。結(jié)果：dBMSCs 在體外分離培養(yǎng)擴增，形態(tài)呈長梭形成纖維細胞樣，通過成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定其為dBMSCs。結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法能有效的獲取dBMSCs，所分離培養(yǎng)的dBMSCs同時具有多向分化潛能，是組織工程研究中理想的種子細胞。

組織工程；骨髓間充質(zhì)干細胞；分離；培養(yǎng)；誘導(dǎo)；分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenehymal stem cells，BMSCs)具有較強的增殖能力，多向分化的潛能，而且取材方便、細胞移植后無明顯的移植物抗宿主反應(yīng)，體外基因轉(zhuǎn)染率高，能穩(wěn)定高效的表達轉(zhuǎn)染基因，被認為是理想的組織工程種子細胞[1-5]。但其在成熟的骨髓中占比例很小，僅占有核細胞的0.001%～0.606%[4]，體外培養(yǎng)不易獲得純化的BMSCs。本實驗建立一種操作簡便、費用低廉、高效分離培養(yǎng)BMSCs的方法，并成功誘導(dǎo)其向成骨、成脂細胞分化。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雜交犬3只，由川北醫(yī)學(xué)院動物中心提供，30～34周齡，雌雄不限，體重(18±2.2)kg，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

Percoll犬淋巴細胞分離液(密度1.073 g/mL)，天津TBD公司；低糖-DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)基，美國Sigma公司；胎牛血清，澳大利亞PAA公司；胰酶，美國Sigma公司；EDTA，美國Sigma公司；DMSO，美國Sigma公司。

1.3 dBMSCs的體外分離

以3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔內(nèi)麻醉雜交犬，用內(nèi)含1 mL肝素鈉(3 000 U/mL)的26號骨髓穿刺針刺入髂后上棘，分2～3點抽取骨髓5～8 mL。

1.4 dBMSCs原代培養(yǎng)

上述骨髓標(biāo)本沿離心管壁緩慢注入到已含4 mL淋巴細胞分離液的2個離心管中，3 000 r/min，離心30 min，緩慢小心吸取中間界面乳白色云霧狀單個核細胞層，加入37 ℃，10 mL PBS液洗2次(2 000 r/min，離心5 min)，加入含10%FBS L-DMEM培養(yǎng)基，以1×108/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2細胞孵育箱中培養(yǎng)，48 h 后半量換液，72 h后棄去培養(yǎng)基和未貼壁細胞，PBS清洗2次，全量換液，以后每3 d換液1次。

1.5 dBMSCs傳代擴增培養(yǎng)

原代細胞接近80%～90%匯合時，用0.25%胰蛋白酶(含0.03% EDTA )于37 ℃消化90 s，待細胞形態(tài)開始皺縮、細胞間隙開始增大時，加入含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液1.5～2 mL終止消化，并加入3～5 mL PBS，吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁，使細胞充分脫落，細胞懸液移入離心管，1 000 r/min，離心3 min，棄上清，沉淀含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，細胞匯合至80%～90%匯合時再次傳代培養(yǎng)。

1.6 dBMSCs形態(tài)學(xué)觀察

原代及傳代培養(yǎng)的細胞，用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長、增殖情況及形態(tài)特征。

1.7 dBMSCs的凍存與復(fù)蘇

取已匯合達80%～90%的第2代dBMSCs，經(jīng)消化、離心、收集，用含10%FBS的 L-DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為6×109/L。將細胞凍存液(DMSO∶FBS=1∶3)緩慢滴入同體積的含dBMSCs的上述細胞懸液中，搖勻，DMSO的終濃度為12.5%，dBMSCs的終密度為3×109/L。

dBMSCs的凍存及復(fù)蘇應(yīng)慢凍快融,置于-4 ℃冰箱2 h，置-30 ℃冰箱2 h，置-80 ℃冰箱過夜后取出凍存管直接放入液氮中保存；復(fù)蘇時將凍存管從液氮或-80 ℃冰箱中取出，立即置37 ℃水浴并輕輕搖動，1～2 min內(nèi)迅速解凍。復(fù)蘇后的dBMSCs用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察其存活情況及形態(tài)變化。

1.8 dBMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)分化及鑒定

取第3代狀態(tài)良好的dBMSCs，以1×104/cm2

接種于24孔板，培養(yǎng)1 d后將培養(yǎng)液更換成含成骨誘導(dǎo)劑的L-DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含100 nM地塞米松，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、維生素C 50 μg/mL)培養(yǎng)，每3天換液， 21 d后行培養(yǎng)板的礦化(鈣)結(jié)節(jié)茜素紅染色：PBS緩沖液洗2遍，4 ℃95%乙醇固定10 min，PBS洗3次后，加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液(pH8.3)1 mL，于37 ℃染色30 min，再用PBS洗3次，自然干燥后肉眼及鏡下觀察。

1.9 dBMSCs向成脂肪細胞誘導(dǎo)分化及鑒定

將第3代dBMSCs以1×104/cm2接種于24孔板，待細胞貼壁生長、融合達90%時，加入用成脂誘導(dǎo)液(5%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基，100 nM地塞米松,0.5 mM IBMX,50 mM吲哚美辛，0.01 mg/mL胰島素，50 μg/mL抗壞血酸)誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，每4 d換液1次。兩周后倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況，2.5%戊二醛固定15 min后行油紅O染色,倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 dBMSCs原代及傳代培養(yǎng)

犬dBMSCs原代培養(yǎng)細胞48 h，倒置顯微鏡下觀察，在絕大多數(shù)圓形細胞的背景中出現(xiàn)出現(xiàn)少許變形細胞，呈橢圓形伴有胞質(zhì)突起(圖1)。培養(yǎng)第72 h，鏡下見稀疏的略呈梭形細胞、多角形，胞體變大，視野內(nèi)單個核細胞漂浮生長，密度減小(圖2)。培養(yǎng)第5天，鏡下見形態(tài)一致的長梭形細胞，呈群落狀生長(圖3)。培養(yǎng)第7天，可見細胞開始增殖呈集落生長，漩渦狀排列明顯，細胞群落增大，群落中央細胞排列整齊，外圍逐漸稀疏(圖4)。培養(yǎng)第11天，整個培養(yǎng)瓶底見形態(tài)一致的長梭形細胞，可觀測到多個漩渦(圖5)。傳代培養(yǎng)后1 d，細胞多數(shù)呈梭形，少數(shù)呈多角形生長，分布一致，均勻鋪滿瓶底(圖6)，未見原代細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)的集落樣生長，傳代后細胞增殖速度明顯加快，匯合達80%～90%需5～6 d。懸浮生長的單個核細胞、血細胞隨多次換液而逐漸被去除。

2.2 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后行培養(yǎng)板的礦化(鈣)結(jié)節(jié)茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后行培養(yǎng)板的礦化(鈣)結(jié)節(jié)茜素紅染色，鏡下顯示深紅色礦化結(jié)節(jié)(圖7)。

2.3 成脂誘導(dǎo)后行油紅O染色

鏡下細胞形態(tài)呈類圓形，體積變大，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)圓形橘紅色脂肪小滴，淺藍色胞核被擠于細胞一側(cè)或中央(圖8)。

3 討論

目前對BMSCs的分離純化和擴增方法有：(1)全骨髓貼壁篩選法：根據(jù)BMSCs在塑料培養(yǎng)材質(zhì)上貼壁生長的特性，通過定期換液除去不貼壁細胞，實現(xiàn)BMSCs的分離、純化；(2)密度梯度離心法：根據(jù)骨髓中各細胞成分比重的不同，使用淋巴細胞分離液提取單個核細胞，再進行貼壁培養(yǎng)而分離、純化BMSCs；(3)流式細胞儀分選法：根據(jù)BMSCs的細胞表面標(biāo)記，利用相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體進行篩選；(4)免疫磁珠法：利用BMSCs的細胞表面抗原與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在磁場作用下分離細胞；(5)細胞篩選法：即根據(jù)細胞大小從骨髓中篩選BMSCs。目前比較公認的BMSCs鑒定標(biāo)識是不表達造血細胞系的表面抗原，如CD14、CD34 CD38 CD45 等，也不表達淋巴細胞的表面抗原，如CD11a、CD11b等，而在不同的生長階段表現(xiàn)出不同的基質(zhì)細胞表面抗原及細胞因子受體，如SH2、SH3、CD29、CD44、CD166。但由于目前仍未找到BMSCs特異性的細胞表面標(biāo)記，故利用流式細胞儀分選法以及免疫磁珠法分離鑒定BMSCs缺乏特異性，鑒定困難，且這兩種方法存在對細胞活性影響大，甚至可以導(dǎo)致細胞完全失活，存在純化后培養(yǎng)困難，實驗條件要求高、費用貴、需要骨髓量大等缺點，目前應(yīng)用較少。BMSCs在全骨髓中比例很低，細胞篩選法效率低。貼壁法是BMSCs最初的分離培養(yǎng)方法，是由Friedenstein在19世紀(jì)70年代中期建立的，至今該方法仍是一種得到廣泛應(yīng)用的經(jīng)典途徑[6]。密度梯度離心法不影響細胞活性，但不能排除混雜的成纖維細胞、單核/巨噬細胞等非目的細胞。密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法，以密度梯度離心有效地除去絕大部分造血細胞，獲得純度較高的單個核細胞，然后根據(jù)BMSCs與血系細胞貼壁性能的差異，培養(yǎng)過程中多次更換培養(yǎng)液可去除懸浮生長的血細胞等雜質(zhì)，最終得到貼壁生長的BMSCs[7-8]。此法操作簡便、費用低廉、效果切實可靠，為一種高效的分離培養(yǎng)BMSCs選擇，在BMSCs的分離、純化過程中被廣泛采用。試驗表明密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得的BMSCs可傳十多代，仍能保持旺盛的生長和增殖能力。吳勝東等[9]報道采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)的方法分離BMSCs純度可達97.7%。

目前BMSCs鑒定方法主要是通過在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)分化表型，然后逆推得知是否為BMSCs。多向分化潛能被認為是BMSCs最重要的生物學(xué)特征，而決定分化方向的關(guān)鍵就是誘導(dǎo)分化的條件，在不同的誘導(dǎo)條件下可向骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞和內(nèi)皮細胞等多種細胞系轉(zhuǎn)化[10]。誘導(dǎo)分化的機制和條件目前尚未明確，多數(shù)觀點認為，BMSCs分化方向與微環(huán)境密切相關(guān)，不同組織的細胞微環(huán)境具有不同的誘導(dǎo)因子，這可能是進入不同組織的BMSCs獲得靶組織的表型，向不同細胞譜系分化的主要原因之一[11-13]。目前，BMSCs體外分化誘導(dǎo)的方法主要有兩種：一是用抗氧化劑作為誘導(dǎo)劑如一巰基乙醇、二甲基亞砜、丁羥醚等[14-15]；二是用生長因子作為誘導(dǎo)劑，如血小板衍生生長因子、表皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子等[16-17]。BMSCs具有強大的分化潛能，通過體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的方法，由BMSCs可以獲得大量的組織工程種子細胞，滿足臨床治療需要的干細胞來源。

BMSCs有著廣泛的應(yīng)用前景，但是目前還存在著有待解決的問題：(1)進一步改進BMSCs的分離提取方法，以提高其純度[18]；(2)BMSCs在不同的生長階段變現(xiàn)出不同的標(biāo)志性抗原，缺乏特異性，鑒定困難；(3)因為BMSCs具有三系分化潛能，其應(yīng)用需實現(xiàn)精確、高效的誘導(dǎo)分化；(4)BMSCs隨著傳代次數(shù)的增多易于失去分化潛能；(5)隨著細胞傳代次數(shù)的增加，細胞分化增值潛能下降。因此，建立高效、精確的BMSCs體外分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化方法，以及延緩細胞衰老是今后的研究重點。

[1] Hagmann S，Moradi B，F(xiàn)rank S，etal．Different culture media affect growth characteristics，surface marker distribution and ehondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J]．Bmc Musculoskelet Disord，2013，14(1)：1-11.

[2] Kar S,Mitra S,Banerjee ER.Isolation and Culture of Embryonic Stem Cells,Mesenchymal Stem Cells,and Dendritic Cells from Humans and Mice[J].Methods Mol Biol，2016，1516：145-152.

[3] Kim N，Cho SG．Clinical applications of mesenchymal stem cells[J]．Korean J intern Med，2013，28(4)：387-402.

[4] Boregowda SV,Krishnappa V,Phinney DG.Isolation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells[J].Methods Mol Biol，2016，1416:205-223.

[5] Li H,Ghazanfari R,Zacharaki D,etal.Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells[J].Ann N Y Acad Sci,2016，1370(1):109-118.

[6] 劉康，白亦光，陳竹，等.兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，28(2)：103-106.

[7] 王英慧，鄭瑞，陳莉．密度梯度離心及貼壁分離篩選相結(jié)合分離培養(yǎng)大鼠骨髓問充質(zhì)干細胞[J].中國組織工程研究，2014，18(28)：4463-4468.

[8] 閏峰，張越林，劉寧，等．全骨髓貼壁法分離骨髓間充質(zhì)干細胞并誘導(dǎo)其定向神經(jīng)元樣細胞的分化[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30(11)：1162-1165.

[9] 吳勝東,葛建軍.犬骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,18(1):15-19.

[10]Martin TJ．Bone biology and anabolic therapies for bone：Current status and future prospects[J].Bone Metab，2014，21(1)：8-20.

[11]Brien CA,Nakasima T,Takayanagi H.Osteocytecontrol of osteoclas togenesis[J].Bone,2013,54(2):258-263.

[12]Rossini M， Gatti D，Adami S．Involvement of WNT/be-ta-catenin signaling in the treatment of osteoporosis[J]．Calcif Tissue Int，2013，93(2)：121-132.

[13]Zhang R，Oyajobi BO，Harris SE，etal．Wnt/β-catenin signaling activates bone morphogenetic protein 2 expression inosteoblasts[J]．Bone，2013，52(1)：145-156.

[14]Coaes Y，Ojeda M，Araya D，etal.Isolation and multilineage differentiation of bone marrow mesenchymal stem ceils from abattoirderived bovine fetuses[J].BMC Vet Res，2013，9(1)：133-146.

[15]Aliborzi G,Vahdati A,Mehrabani D,etal．Isolation,Characterization and Growth Kinetic Comparison of Bone Marrow and Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells of Guinea Pig[J].Int J Stem Cells，2016，9(1):115-123.

[16]Lin Z，Wang JS，Lin L，etal．Effects of BMP2 and VEGF165 on the osteogenic differentiation of rat bone marrowderived mesencbymal stem cells[J]．Exp Ther Med，2014，7(3)：625-629．

[17]Kwon SH，Lee TJ，Park J，etal．Modulation of BMP-2 induced chondrogenic versus osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by cell-specific extracellular matrices[J].Tissue Eng Part A，2013，19(1/2)：49-58．

[18]Gardner OF,Alini M,Stoddart MJ.Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Bone Marrow[J].Methods Mol Biol,2015,1340:41-52.

(學(xué)術(shù)編輯：敬保遷)

Isolation,culture,differentiation and identification of dog mesenehymal stem cells in vivo

PU Chao1,ZHANG Shan-shan2,LI Wei1,WU Qing-xia1,WU Hui1

(1.DepartmentofOrthopaedics；2.DepartmentofNeurology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalMedscalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To establish a method for isolation，culture，differentiation and identification of bone mallow mesenchymal stem cells(BMSCs) from dog. Methods：dBMSCs were isolated by combination of gradient centrifugation and adherent wall culture，and induced their differentiation into osteoblasts and adipocytes which were identified by histoehemistry staining and oil red staining.Results：The cultured adherent cells showed spindle and polygonal shape.The identification of dBMSCs was carried out by alizarin red staining after induction of osteoblasts and alkaline phosphatase staining after induction of adipocytes.Conclusion：dBMSCs were isolated and cultured successfully from dog ilium bone marrow by combination of gradient centrifugation and adherent wallculture,which possess multi-directional differentiation potential,is the ideal seed cells in tissue engineering research.

Tissue engineering;Bone mesenehymal stem cells;Isolation;Culture;Induce;Differentiation

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.001

川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計劃項目(CBY11-A-QN09)

2016-08-13

蒲超(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：puchao3310@sina.com

李偉，E-mail: subjwdice@126.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.002.html

1005-3697(2016)06-0782-04

R332

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