杜寒春，馮德芬，葉賽芳，黃澤軍，艾晨昊，羅燕妮，譚學(xué)才

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，廣西 南寧 530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530008）

實(shí)驗(yàn)室與分析

基于玻碳電極/氧化蘇木精/青霉素酶的青霉素電化學(xué)傳感器

杜寒春1，馮德芬2，葉賽芳2，黃澤軍2，艾晨昊2，羅燕妮2，譚學(xué)才2

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，廣西 南寧 530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530008）

本文利用青霉素酶與青霉素發(fā)生水解反應(yīng)生成青霉噻唑酸，該酸電離出H+，促使溶液中的氧化蘇木精發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號(hào)。以玻碳電極為工作電極，建立一種檢測(cè)青霉素的電化學(xué)方法。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，青霉素濃度在10-9～10-5mol·L-1范圍內(nèi)與其相對(duì)電流強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系（r2=0.9973），最低檢出限（S/N=3）為1.661×10-8mol·L-1。連續(xù)平行測(cè)定1×10-6mol·L-1的青霉素溶液3次，相對(duì)電流強(qiáng)度的RSD為2.50%，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。將該方法用于牛奶樣品的實(shí)際測(cè)定，回收率為99.70%～102.69%，結(jié)果較為理想。

電化學(xué)傳感器；青霉素；青霉素酶；氧化蘇木精

青霉素（Penicillin）是抗菌素的一種，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactams），主要用于動(dòng)物，可治療由革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌引起的細(xì)菌感染，維持動(dòng)物的健康，促進(jìn)生長(zhǎng)[1]。目前，青霉素是治療牛乳腺炎的主要藥物之一，同時(shí)也是牛奶中常見(jiàn)的殘留抗生素。雖然國(guó)家已明令要求抗生素殘留超標(biāo)的牛奶不允許上市，但是仍有部分不法商販利用β-內(nèi)酰胺酶將牛乳制品中的抗生素水解為酶解代謝產(chǎn)物，從而達(dá)到掩蔽青霉素類抗生素的目的[2]。因此，建立一種對(duì)青霉素藥物及其主要酶解代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)確、靈敏、高效的檢測(cè)方法十分必要。

目前已有多種檢測(cè)方法用于青霉素的定性定量分析，如拉曼[3-4]、液相色譜/質(zhì)譜法[5]、紫外光譜法[6]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光[7]等。其中，電化學(xué)測(cè)定法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本文選用玻碳電極為工作電極，在摻入定量的氧化蘇木精和青霉素酶的青霉素溶液中研究青霉素的電化學(xué)行為，并為定量測(cè)定青霉素提供了一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站，三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE）φ=3.0mm，甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑柱電極為對(duì)電極；KQ218型超聲清洗儀，PHS?3E型pH計(jì)，H1850R型冷凍離心機(jī)。

pH=7.0、1×10-2mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液；青霉素鈉（≥1200U·mg-1，分析純）；青霉素酶（1mL可滅活120000U青霉素，分析純）；氧化蘇木精（分析純）。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 玻碳電極（GCE）的預(yù)處理

在特制的拋光布上依次用1.00、0.30、0.05μm的α-Al2O3粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行打磨后，再依次用超純水、硝酸水溶液（V∶V=1∶1）、無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗3min，經(jīng)鐵氰化鉀溶液檢測(cè)后，在室溫下氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將0.1mL青霉素酶（1mL可滅活120000U青霉素）溶液、50mmol·L-1氧化蘇木精溶液1mL、一定量的青霉素溶液、1mL的3mol·L-1的KCl加入10mL的容量瓶，以1×10-2mol·L-1、pH=7.0的磷酸緩沖溶液（PBS）定容到刻度線，制備待測(cè)溶液。以GCE為工作電極，SCE為參比電極，鉑柱電極為對(duì)電極組成三電極，在CHI660E電化學(xué)工作站上對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行測(cè)定，控制電位范圍為-0.4～0.6V，以100mV?s-1的掃描速率，進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描，記錄CV圖。控制電位范圍為0.6～-0.4V，進(jìn)行差分脈沖伏安（DPV）掃描，記錄DPV圖。

1.4 實(shí)驗(yàn)原理

青霉素酶與青霉素發(fā)生水解反應(yīng)生成青霉噻唑酸。青霉噻唑酸是一種強(qiáng)酸，該酸電離出H+，促使溶液中的氧化蘇木精被還原成蘇木精。

蘇木精是一種天然的有機(jī)染料，具有一定的電活性和選擇性，在堿性溶液中以氧化態(tài)形式（氧化蘇木精）存在。隨著溶液中H+濃度的增加，氧化蘇木精發(fā)生還原反應(yīng)，得到電子，生成蘇木精。

這是一個(gè)對(duì)pH敏感的氧化還原化合物，適合作為生物催化劑——酶的活性引起pH變化的分子探針[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化蘇木精/青霉素酶/青霉素在玻碳電極上的電化學(xué)行為研究

通過(guò)循環(huán)伏安法研究了氧化蘇木精/青霉素酶/青霉素在玻碳電極上的電化學(xué)行為研究。圖1分別展示了青霉素（a）、青霉素酶（b）、青霉素/青霉素酶（c）、氧化蘇木精（d）、氧化蘇木精/青霉素（e）、氧化蘇木精/青霉素酶（f）在0.01mol·L-1的PBS（pH=7.0）中的循環(huán)伏安圖。對(duì)比曲線a、b、c與d、e、f，發(fā)現(xiàn)青霉素和青霉素酶沒(méi)有明顯的氧化還原電流，氧化蘇木精可以顯著地提高反應(yīng)的氧化峰電流和還原峰電流。

圖1 在0.01 mol·L-1PBS中的循環(huán)伏安圖（pH=7.0）(a) penicillin; (b) penicillinase; (c) penicillin/ penicillinase; (d) hematein; (e) hematein/penicillin; (f) hematein/ penicillinaseFig.1 CVs in 0.01 mol·L-1PBS solution (pH=7.0)

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 pH

從圖2和圖3可知，反應(yīng)的電流信號(hào)先隨pH的增大而增大，當(dāng)pH=7.0時(shí)電流信號(hào)達(dá)到最大，然后隨pH的增大而減小。如圖4所示，pH與峰電位的線性關(guān)系良好，隨著pH的增加，峰電位負(fù)移。線性關(guān)系為Ep=-0.0542×pH+0.645，R2=0.9621。

圖2 不同pH時(shí)的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammetry curves at different pH

圖3 不同pH對(duì)于1.8×10-6mol·L-1青霉素溶液電流強(qiáng)度的影響Fig.3 effect of different pH on the current intensity of 1.8×10-6mol·L-1penicillin

圖4 pH與峰電位的關(guān)系Fig.4 relationship between pH and peak potentials

2.2.2 掃速

從圖5和圖6可知，還原反應(yīng)的電流信號(hào)在100mV·s-1時(shí)達(dá)到最大。掃速較低時(shí)，形成活性物質(zhì)較慢，不利于氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行，而掃速過(guò)高時(shí)，氧化蘇木精的氧化還原時(shí)間被大大縮短，導(dǎo)致強(qiáng)度降低。

圖5 不同掃速時(shí)的循環(huán)伏安曲線Fig.5 Cyclic voltammetry curves at different scan rate

圖6 不同掃速對(duì)于1.8×10-6mol·L-1的青霉素溶液電流強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of different scan rate on the current intensity of 1.8×10-6mol·L-1penicillin

2.3 方法的評(píng)估

2.3.1 線性方程和檢出限

在優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用電化學(xué)工作站測(cè)定含有一定量青霉素酶和氧化蘇木精的溶液中多組不同濃度的青霉素在玻碳電極上的DPV曲線，用相對(duì)電流強(qiáng)度對(duì)青霉素濃度指數(shù)進(jìn)行回歸方程的建立。從圖7可知，在1.0×10-9～ 1.0×10-5mol·L-1范圍內(nèi)，青霉素溶液濃度指數(shù)與相對(duì)電流強(qiáng)度有很好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.3001×lgC+6.1313（mol·L-1），相關(guān)系數(shù)R2為0.9973，檢出限（S/N=3）為1.661×10-8mol·L-1。與表1中的其他檢測(cè)方法對(duì)比，本方法具有更寬的線性范圍或者更低的檢出限。

圖7 不同青霉素的DPV標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curve of DPV intensity to logarithmic penicillin concentration

2.3.2 穩(wěn)定性和抗干擾能力

由圖8可知，在優(yōu)化條件下，制備3根電極來(lái)測(cè)定溶液，其電流強(qiáng)度的RSD為2.50%，該方法具有比較好的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)考察了牛奶中常含有的其他共存物質(zhì)，從圖9中可以看出，1000倍的Na+、Cl-、K+、NH4+，500倍的Ca2+、Mg2+、CO32-、SO42-以及100倍的抗壞血酸均不產(chǎn)生影響。

表1 不同分析方法檢測(cè)青霉素的比較Table1 Comparison of analytical of various analytical methods for the determination of penicillin

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)和回收率

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，取200mL牛奶樣品（當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買）置于燒杯中，加入硫酸銨60g進(jìn)行鹽析，然后將混合物離心（10000r·min-1，25℃）20min，以除去蛋白質(zhì)和脂肪[9]，收集上清液。上清液用0.22μm微膜過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液將上清液調(diào)至pH=7，待用。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)牛奶中的青霉素含量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。該方法的回收率為99.70%～102.69%，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于玻碳電極/氧化蘇木精/青霉素酶的青霉素傳感器，該方法具有靈敏度較高、線性范圍寬（10-9～10-5mol·L-1）、檢出限低（1.661×10-8mol·L-1）、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)。

圖8 電極的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of electrode

圖9 多種干擾物質(zhì)的相對(duì)電流強(qiáng)度Fig.9 relative current strength of various interfering substances

表2 樣品的測(cè)定以及回收率（n=5）Table2 Determination of penicillin in milk and its recovery (n=5)

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A Novel Electrochemical Sensor for Penicillin with Glassy Carbon Electrode/Hematein/ Penicillinase

DU Hanchun1，F(xiàn)ENG Defen2，YE Saifang2，HUANG Zejun2，AI Chenhao2，LUO Yanni2，TAN Xuecai2
(1.Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for analysis and Test Research，Nanning 530022, China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Key Laboratory of Guangxi Colleges and Universities for Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry, Nanning 530008, China）

The penicillinase catalyzed the hydrolysis of penicillin to penicilloic acid, which H+was liberated. H+promoted the reduction reaction of hematein, thereby generated a current signal. Based on the principle, a new electrochemical method was established for the determination of penicillin at the glass carbon electrode. Under the optimum conditions, the GCE/hematein/ penicillinase exhibited excellent performance for penicillin in PBS with a wide range of 10-9～10-5mol/L and the detect limit was 1.661×10-8mol/L(S/N=3). The RSD for 1×10-6mol/L penicillin was 2.50%, which indicated that the method had good stability. The detection of penicillin concentration in real sample (milk) had acceptable accuracy with the assay system, which the recovery was 99.70%～102.69%.

electrochemical sensor; penicillin; penicillinase; hematein

O 646

A

1671-9905(2016)12-0030-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21365004）；廣西直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目(2013ACZ04）

杜寒春（1980-），女，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與檢測(cè)，E-mail: 25832102@qq.com

譚學(xué)才（1964-），男，博士，教授，研究方向?yàn)殡姺治龌瘜W(xué)、食品藥品分析檢測(cè)，E-mail: gxunxctan@126.com

2016-10-18