徐嫄，韓寧寧，于麗娜，戴青，趙暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

微生物濁度法與管碟法測定吉他霉素效價(jià)的比較研究

徐嫄，韓寧寧，于麗娜，戴青，趙暉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為比較微生物濁度法和管碟法測定吉他霉素效價(jià)，以《中國藥典》(2015年版)吉他霉素抗生素微生物檢定法濁度法和《中國獸藥典》(2010年版)吉他霉素抗生素微生物檢定法管碟法為依據(jù)測定一批吉他霉素效價(jià)。結(jié)果顯示：濁度法測定效價(jià)平均值為1691 U/mg，RSD為0.9%；管碟法測定效價(jià)平均值為1687 U/mg，RSD為1.0%，兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明，濁度法測定吉他霉素效價(jià)與管碟法相比更加快速、便捷，而且可避免吉他霉素多組分的影響因素。

濁度法；管碟法；吉他霉素；效價(jià)

抗生素微生物效價(jià)測定法包括管碟法和濁度法。《中國獸藥典》(2010年版)[1]收載吉他霉素及制劑的效價(jià)測定方法僅為管碟法。《中國藥典》(2010年版)[2]已收載吉他霉素效價(jià)測定的微生物濁度法。近些年相繼有利用濁度法測定吉他霉素和吉他霉素制劑效價(jià)的報(bào)道[3-5]。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)吉他霉素原料藥含量測定工作中，利用以上兩種方法測定吉他霉素含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了比較。

1 材料

1.1 藥品與試劑 吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)0357-9901)，含量：1462 U/mg；吉他霉素樣品，生產(chǎn)企業(yè)提供(批號(hào)KB-KT-1501003)；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)[加0.3%葡萄糖(pH8.0，批號(hào)160321)]、抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)(pH7.0，批號(hào)160329)、滅菌0.9%氯化鈉溶液(批號(hào)160321)、滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8，批號(hào)160321)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)160321)，北京中海動(dòng)物保健科技公司；甲醛溶液(批號(hào)1306192)，國藥集團(tuán)。

1.2 菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)26003，中國食品藥品檢定研究院。1.3 儀器 WBS-100微生物比濁法測定儀、WBS-100比濁儀專用比色皿、ZY-300G鋼管自動(dòng)放置器，北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司；CHB-1抗生素效價(jià)測量儀，北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司；HTY-HZ型培養(yǎng)基專用恒溫箱，杭州高得醫(yī)療器械有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

2.1.1 濁度法 取新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面(50 mL)，用5 mL滅菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，取1 mL菌液加入5 mL滅菌0.9%氯化鈉溶液得到稀釋后的菌液，取適量稀釋后的菌液加入抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)，搖勻，制備成含稀釋菌液2%的培養(yǎng)液，置于冰箱冷藏備用。

2.1.2 管碟法 取新鮮培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面，用5 mL滅菌0.9%氯化鈉溶液沖洗斜面，在65 ℃恒溫30 min，取適量菌液加入抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(加0.3%葡萄糖)，搖勻，制備成含菌液1.0%的培養(yǎng)液，置于水浴中備用。

2.2 抗生素溶液配制

2.2.1 濁度法 分別取吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品適量，精密稱定，按吉他霉素每2 mg加乙醇1 mL使溶解，用滅菌水定量制成每1 mL中含1000 U的溶液，照《中國藥典》(2015年版)[6]抗生素微生物檢定法濁度法，用滅菌磷酸鹽緩沖液進(jìn)一步稀釋得標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高低劑量分別為2.0 U/mL和1.0 U/mL的待測溶液。

2.2.2 管碟法 分別取吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品適量，精密稱定，按吉他霉素每2 mg加乙醇1 mL使溶解，用滅菌水定量制成每1 mL中含1000 U的溶液，照《中國獸藥典》(2010年版)[1]抗生素微生物檢定法管碟法，用滅菌磷酸鹽緩沖液進(jìn)一步稀釋得標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高低劑量分別為40 U/mL和20 U/mL的待測溶液。

2.3 培養(yǎng)與測定

2.3.1 濁度法 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各1.0 mL，加入對(duì)應(yīng)的滅菌比色皿中，每管加入9.0 mL培養(yǎng)液，每個(gè)濃度的抗生素溶液做4份平行。另取兩支比色皿，其中一支加入1.0 mL滅菌磷酸鹽緩沖液和9.0 mL培養(yǎng)液，并立即加入0.5 mL甲醛溶液，混勻，作為空白對(duì)照；另一支加入1.0 mL滅菌磷酸鹽緩沖液和9.0 mL培養(yǎng)液，作為陽性對(duì)照。將以上各比色皿置于微生物比濁法測定儀中，于37 ℃培養(yǎng)，儀器在線于530 nm波長處測定各支比色皿中金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)生長期內(nèi)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值進(jìn)行可靠性測驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。

2.3.2 管碟法 取平底雙碟10塊，分別加入20 mL加熱融化的培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(加0.3%葡萄糖)，置水平臺(tái)面，均勻攤布，待凝固，作為底層。另取水浴中的培養(yǎng)液，每碟加入5 mL。使在底層攤布均勻，待凝固，作為菌層。培養(yǎng)基冷卻后，在雙碟中加入不銹鋼小管，用陶瓦蓋覆蓋，靜置約15 min；在每碟中對(duì)角的2個(gè)鋼管中，分別滴加高低劑量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余2個(gè)鋼管分別滴加高低劑量的供試品溶液。將雙碟置37 ℃溫室，加蓋陶瓦蓋，培養(yǎng)16～18 h后，測量各個(gè)抑菌圈直徑，進(jìn)行可靠性測驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。

2.4 效價(jià)測定 利用濁度法與管碟法分別測定，各得到5組數(shù)據(jù)，見表1。兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異，t=0.35，t0.05,8=2.306，t0.05)。

表1 濁度法與管碟法測定吉他霉素效價(jià)結(jié)果

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用濁度法與管碟法測定吉他霉素原料藥含量，可信限率均在5%以內(nèi)。在抗生素生物效價(jià)測定方法中，微生物管碟法是傳統(tǒng)測定方法，該方法操作較為復(fù)雜，影響因素較多，且耗時(shí)長，通常培養(yǎng)16～18 h后測定結(jié)果；濁度法較前者，操作簡單，影響因素少，用時(shí)短，培養(yǎng)時(shí)間在3～4 h，并且測定結(jié)果精密度較高。因吉他霉素的多組分性質(zhì)，在管碟法測定中易出現(xiàn)抑菌圈邊緣模糊和抑菌圈雙圈現(xiàn)象，從而導(dǎo)致測定結(jié)果的可信限率和重現(xiàn)性不理想，濁度法通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長的抑制作用，測定細(xì)菌濁度值的大小，通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長的一致程度，以測定效價(jià)值，從而克服管碟法測定吉他霉素易出現(xiàn)的問題。本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法測定吉他霉素效價(jià)并進(jìn)行比較，結(jié)果無顯著差異。因此認(rèn)為，獸藥檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用濁度法測定吉他霉素效價(jià)會(huì)更加快速、便捷，提高工作效率。

[1] 中國獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國獸藥典[S]. 2010年版. 一部.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：71-72，附錄121-128.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S]. 2010年版. 二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄93.

[3] 高艷霞，姜建國，韓彬. 吉他霉素制劑的濁度法考察評(píng)價(jià)[J]. 中國藥事，2009，23(9)：872-871.

[4] 馮向東，高光偉. 濁度法測定吉他霉素的效價(jià)[J]. 西北藥學(xué)雜志，2008，23(5)：270-271.

[5] 霍天鳳. 微生物濁度法測定吉他霉素片的效價(jià)[J]. 中外醫(yī)療，2012，12：117-118.

[6] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].2015年版. 四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：160-165.

(編輯：李文平)

Comparison of the Antibiotic Potency of Kitasamycin by Turbidimetric Method and Diffusion Method

XU Yuan, HAN Ning-ning, YU Li-na, DAI Qing, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

In order to compare turbidimetric method with diffusion method for measuring of antibiotic potency of kitasamycin, a bath of kitasamycin potency was measured by turbidimetric method according to quality standards in Chinese Pharmacopoeia 2015 version and diffusion method according to quality standards in Chinese Veterinary Pharmacopoeia 2010 version.Results of potency average were 1691U/mg by turbidimetric method withRSDof 0.9% and 1687U/mg by diffusion method withRSDof 1.0%.There was no significant difference as compared (P>0.05). Results showed that compared with diffusion method, turbidimetric method is not only more rapid and convenient, but also could avoid cross-influence of the ingredients in kitasamycin.

turbidimetric method；diffusion method；kitasamycin；potency

徐嫄，碩士，從事抗生素檢驗(yàn)工作。

2016-07-31

A

1002-1280 (2016) 11-0031-03

S859.796