張傳林，胡慶紅(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563003)

基質(zhì)固相分散-共振光散射法測(cè)定蔬果中的甲基毒死蜱

張傳林，胡慶紅*
(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563003)

建立測(cè)定蔬果中甲基毒死蜱殘留量的基質(zhì)固相分散-共振光散射新方法,為蔬果中甲基毒死蜱的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。以曲拉通X-100為穩(wěn)定劑，甲基毒死蜱與燦爛甲酚藍(lán)在pH值為10.00的Britton-Robinson緩沖液中相互作用，使體系共振光散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并在360 nm、544 nm處出現(xiàn)特征散射峰。甲基毒死蜱質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/mL與544 nm處的散射強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，其檢出限為0.029 μg/mL。各樣品經(jīng)基質(zhì)固相分散法處理后，測(cè)得甲基毒死蜱的平均回收率為91.5%～96.8%。該方法快速、靈敏，可用于蔬果中甲基毒死蜱的檢測(cè)。

共振光散射； 甲基毒死蜱； 燦爛甲酚藍(lán)； 基質(zhì)固相分散

甲基毒死蜱是一種廣譜、高效的有機(jī)磷酸酯類殺蟲(chóng)劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和衛(wèi)生殺蟲(chóng)。但其在體內(nèi)蓄積能引起一系列的中毒反應(yīng)[1]。我國(guó)在最新實(shí)施的《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，將多種食品中甲基毒死蜱的殘留限量暫定為5 mg/kg[2]。目前，檢測(cè)樣品中甲基毒死蜱殘留的前處理方法主要為固相萃取法[3]，檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[6-8]等?，F(xiàn)代食品安全需要發(fā)展更加快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)?；|(zhì)固相分散法是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型的樣品前處理技術(shù)，其以固相萃取填料為分散劑，將樣品與適量的分散劑充分研磨，制成均相裝入小柱后選擇合適的有機(jī)溶劑洗脫，除去基質(zhì)中的雜質(zhì)，同時(shí)完成對(duì)樣品待測(cè)組分的提取和凈化[9]。共振光散射法是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種操作簡(jiǎn)便、分析快速、靈敏度可達(dá)納克級(jí)的光譜新技術(shù)，在蛋白質(zhì)[10]、核酸[11-12]、免疫[13]、藥物[14-16]、無(wú)機(jī)離子[17]等分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本研究利用基質(zhì)固相分散法作為樣品前處理手段，通過(guò)研究甲基毒死蜱與燦爛甲酚藍(lán)相互作用產(chǎn)生的共振光散射光譜，建立了蔬果中甲基毒死蜱殘留量的檢測(cè)方法，以期為蔬果中甲基毒死蜱的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持，同時(shí)拓展共振光散射技術(shù)在分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蔬果樣品購(gòu)于遵義市某超市；甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；燦爛甲酚藍(lán)為分析純，購(gòu)自湘中精細(xì)化學(xué)品廠；丙酮、二氯甲烷、無(wú)水硫酸鎂均為分析純，曲拉通X-100、弗羅里硅土為化學(xué)純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。無(wú)水硫酸鎂、弗羅里硅土在650 ℃馬弗爐烘烤5 h，弗羅里硅土用3%的水脫活后貯存于密封干燥器中備用。用酸度計(jì)測(cè)定配制一系列不同pH值的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液。

儀器包括VARIAN Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)、TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、90Plus PALS高靈敏度Zeta電位及粒度分析儀(美國(guó)布魯克海文儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 精密稱取甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，用丙酮定容于100 mL的容量瓶中，配成200 μg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃保存，臨用時(shí)用水稀釋到20 μg/mL；精密稱取燦爛甲酚藍(lán)0.010 0 g，用水定容于100 mL的容量瓶中，備用。

1.2.2 樣品處理 將樣品洗凈，取10 g放入粉碎機(jī)中，勻漿。取1.0 g于研缽中，加入2 g無(wú)水硫酸鎂充分研磨后再與3 g弗羅里硅土研磨均勻。在層析柱底部裝1片濾紙，從下至上依次填入無(wú)水硫酸鎂0.5 g、研磨均勻的混合物、無(wú)水硫酸鎂0.5 g，每種填料填入后敲實(shí)，使填料均勻緊密地分布在柱中，柱上端再加1片濾紙。用10 mL二氯甲烷分2次洗滌研缽和淋洗層析柱，收集洗脫液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?.1 mL丙酮。

1.2.3 測(cè)定方法 在10 mL具塞比色管中依次加入1 mL pH值為10.00的緩沖液、1 mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL的甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的曲拉通X-100溶液、1 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的燦爛甲酚藍(lán)溶液，用水定容至刻度，搖勻、靜置5 min，在熒光分光光度計(jì)中保持狹縫為5 nm，低壓條件下，以 λex=λem同步掃描，得到共振光散射光譜。在最大散射波長(zhǎng)544 nm處測(cè)得散射強(qiáng)度值為I，不加入農(nóng)藥測(cè)得值為I0，則ΔI=I-I0。配制一系列不同質(zhì)量濃度的甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用粒度分析儀測(cè)定并記錄體系有效粒徑值；分別測(cè)定其散射強(qiáng)度，并根據(jù)ΔI和質(zhì)量濃度(c)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。測(cè)定樣品處理液和空白對(duì)照液在544 nm處的散射強(qiáng)度值，求出ΔI，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求出樣品處理液中甲基毒死蜱的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 共振光散射光譜與吸收光譜

由圖1可知，甲基毒死蜱和燦爛甲酚藍(lán)本身的散射強(qiáng)度較弱；而兩者在堿性條件下相互作用后，其散射強(qiáng)度顯著增大，并在360 nm、544 nm處出現(xiàn)特征散射峰，隨著甲基毒死蜱質(zhì)量濃度的增大體系在最大散射波長(zhǎng)處的散射強(qiáng)度值也明顯增加，表明能夠利用共振光散射法對(duì)甲基毒死蜱進(jìn)行定量檢測(cè)。由圖2可知，隨著甲基毒死蜱的加入，體系在550 ～750 nm出現(xiàn)減色效應(yīng)，在300 ～550 nm出現(xiàn)增色效應(yīng)，并在550 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn)。對(duì)比圖1和圖2可以看出，體系的最大散射峰位于其吸收帶內(nèi)，因此能夠產(chǎn)生共振增強(qiáng)的散射作用，使散射增強(qiáng)。

1.單獨(dú)的甲基毒死蜱溶液 (2.0 μg/mL); 2～7.不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL)與燦爛甲酚藍(lán)、曲拉通X-100作用后的體系圖1 甲基毒死蜱-燦爛甲酚藍(lán)體系的共振光散射光譜

1.單獨(dú)的甲基毒死蜱溶液(2.0 μg/mL); 2～4.不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(4.0、2.0、0 μg/mL)與燦爛甲酚藍(lán)、曲拉通X-100作用后的體系圖2 甲基毒死蜱-燦爛甲酚藍(lán)體系的的吸收光譜

2.2 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)粒度測(cè)量

1～3為不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(2.0、3.0、4.0 μg/mL)與燦爛甲酚藍(lán)、曲拉通X-100作用后的體系圖3 體系DLS粒度測(cè)量多分布圖

甲基毒死蜱質(zhì)量濃度/(μg/mL)有效粒徑/nm多分散系數(shù)2．0226．490．0033．0235．820．0494．0260．310．010

2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖液酸度的選擇 考察不同pH值的B-R緩沖液對(duì)體系散射值的影響，結(jié)果表明，pH值為10.00時(shí)，體系有較大的ΔI(圖4)，為最佳pH值。

圖4 pH值對(duì)體系散射值的影響

2.3.2 燦爛甲酚藍(lán)質(zhì)量濃度的選擇 考察燦爛甲酚藍(lán)質(zhì)量濃度對(duì)體系散射值的影響，結(jié)果表明，燦爛甲酚藍(lán)最終質(zhì)量濃度為10～18 μg/mL時(shí)，體系ΔI較大(圖5)，試驗(yàn)選擇燦爛甲酚藍(lán)的質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

圖5 燦爛甲酚藍(lán)質(zhì)量濃度對(duì)體系散射值的影響

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇 考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系散射值的影響，結(jié)果表明，體系在5～40 min有較大的ΔI(圖6)。本試驗(yàn)選擇室溫反應(yīng)5 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系散射值的影響

2.3.4 表面活性劑的選擇 為改善體系的穩(wěn)定性，考察了吐溫-80、曲拉通X-100、聚乙二醇-6000等表面活性劑對(duì)體系的增穩(wěn)作用，結(jié)果表明，曲拉通X-100可在一定程度上增加體系的穩(wěn)定性和散射值。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，曲拉通X-100最終質(zhì)量濃度為80～120 μg/mL時(shí)，體系ΔI較大(圖7)。本試驗(yàn)選擇加入100 μg/mL的曲拉通X-100。

圖7 曲拉通X-100質(zhì)量濃度對(duì)體系散射值的影響

2.3.5 樣品處理方法的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)[19]選擇弗羅里硅土作為固相分散劑，分散劑與樣品的質(zhì)量比為3∶1，考察其凈化效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分散劑與樣品直接研磨時(shí)，由于樣品中的水分較多，降低了弗羅里硅土的活性，致使洗脫液中有大量的色素；當(dāng)樣品與無(wú)水硫酸鎂充分研磨后再與分散劑一起研磨，此時(shí)洗脫液較為潔凈。

2.3.6 洗脫劑及其用量的選擇 考察了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脫效果，結(jié)果表明，乙腈和丙酮作為洗脫劑時(shí)洗脫液中有大量的色素，而使用極性較小的二氯甲烷作為洗脫劑時(shí)，洗脫液中色素含量較少。同時(shí)考察了二氯甲烷用量對(duì)農(nóng)藥回收率的影響，當(dāng)洗脫劑用量為10 mL時(shí)，農(nóng)藥的回收率在92.7%～99.4%，增加洗脫劑用量，農(nóng)藥回收率基本不變。因此選擇10 mL二氯甲烷作為洗脫劑。

2.4 共存物質(zhì)的影響

保持10 mL比色管中甲基毒死蜱含量為20 μg，同時(shí)加入一定量的共存物質(zhì)，按照1.2.3方法測(cè)定，考察共存物質(zhì)對(duì)體系散射值的影響。當(dāng)體系測(cè)定誤差小于±10%時(shí)，共存物質(zhì)的允許量(以質(zhì)量計(jì))為：淀粉、蔗糖、葡萄糖、Na2S、KBr、NaNO3、Na3PO4、KCl、KAc的允許量均大于2 000 μg，L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、AlCl3為500 μg，L-半胱氨酸為300 μg，BaCl2、ZnSO4、CaCl2、CuSO4為200 μg，F(xiàn)eSO4、FeCl3為80 μg，乙酰甲胺磷、咪唑啉大于600 μg，乙醇、丙酮為600 mg。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法靈敏度

配制一系列不同質(zhì)量濃度的甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)測(cè)定的ΔI和質(zhì)量濃度(c)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖8所示，其線性回歸方程為ΔI=14.881c+1.620 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2，線性范圍為0.1～5.0 μg/mL，檢出限為0.029 μg/mL。

圖8 甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

取各樣品1.0 g，按照方法1.2.2和1.2.3進(jìn)行處理和測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。4種樣品中均未檢出甲基毒死蜱殘留，平均加標(biāo)回收率為91.5%～96.8%，與高效液相色譜(HPLC)法[20]對(duì)比，結(jié)果基本一致。

表2 樣品測(cè)定及回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

注：ND表示未檢出。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種以共振光散射技術(shù)檢測(cè)樣品中甲基毒死蜱殘留量的分析方法，甲基毒死蜱質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/mL與544 nm處的散射強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.029 μg/mL，各樣品中甲基毒死蜱的回收率為91.5%～96.8%，能夠滿足對(duì)蔬果中甲基毒死蜱的檢測(cè)需求。與分光光度法相比，該方法具有更高的靈敏度；與色譜檢測(cè)技術(shù)相比，該方法對(duì)設(shè)備要求較低，利用普通熒光分光光度計(jì)就能完成檢測(cè)，并且分析快速，可在短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品的篩選，同時(shí)無(wú)須使用大量有機(jī)溶劑，節(jié)約試驗(yàn)成本。

鑒于蔬果樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，因此本研究對(duì)樣品前處理過(guò)程進(jìn)行了系列優(yōu)化。以基質(zhì)固相分散法作為前處理手段，考察了各填料的研磨順序?qū)艋Ч挠绊?，同時(shí)對(duì)比了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脫效果，并考察了洗脫劑的用量，最終選擇樣品與無(wú)水硫酸鎂充分研磨后再與分散劑研磨，并以10 mL二氯甲烷作為洗脫劑來(lái)提取、凈化蔬果樣品中的甲基毒死蜱，可以降低樣品基質(zhì)對(duì)試驗(yàn)測(cè)定的干擾，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

[1] Fortenberry G Z,Hu H,Turyk M,etal.Association between urinary 3,5,6-trichloro-2-pyridinol,a metabolite of chlorpyrifos and chlorpyrifos-methy,and serum T4 and TSH in NHANES 1999—2002[J].Science of the Total Environment,2012,424(1):351-355.

[2] 國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委,農(nóng)業(yè)部.食品中農(nóng)藥最大殘留限量:GB 2763—2014[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014.

[3] 王瑩,王顏紅,李波,等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定羊毛脂中13種農(nóng)藥多殘留[J].農(nóng)藥,2013,52(12):905-908.

[4] 周夢(mèng)春,何海,舒耀皋,等.分子印跡-基質(zhì)固相分散萃取-高效液相色譜法測(cè)定土壤中4種硫代磷酸酯類農(nóng)藥殘留量[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,17(1):83-88.

[6] Radford S A,Panuwet P,Hunter R E,etal.HPLC-MS/MS method for the measurement of insecticide degradates in baby food[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(29):7085-7091.

[7] Yang Z,Liu Y,Liu D,etal.Determination of organophosphorus pesticides in soil by dispersive liquid-liquid microextraction and gas chromatography[J].Journal of Chromatographic Science,2012,50(1): 15-20.

[8] 邱偉芬,張昌娟,文良,等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合QuEChERS法快速篩查大米中多種農(nóng)藥殘留[J].食品科學(xué),2015,36(12):221-225.

[9] Barker S A,Long A R,Short C R.Isolation of drug residues from tissues by solid phase dispersion[J].Journal of Chromatography A,1989,475(1):353-361.

[10] Yan S,Zhang L,Tang Y,etal.Synthesis of water-soluble Ag2Se QDs as a novel resonance rayleigh scattering sensor for highly sensitive and selective ConA detection[J].Analyst,2014,139(17):4210-4215.

[11] 徐紅,劉紹璞,羅紅群.鹽酸吖啶黃-脫氧核糖核酸反應(yīng)體系的共振瑞利散射及其應(yīng)用[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)),2010,46(1):5-7.

[12] Wang Y,Bi S Y,Zhou H F,etal.Resonance light scattering spectroscopy of procyanidin-CPB-DNA ternary system and its potential application[J].Spectrochimica Acta Part A(Molecular and Biomolecular Spectroscopy),2015,146(1):255-260.

[13] 江波,蔣治良.抗凝血酶Ⅲ的免疫共振散射光譜分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(5):1145-1148.

[14] 胡慶紅,江波,孔存杰,等.曲利本藍(lán)與阿米卡星相互作用的共振瑞利散射光譜及其應(yīng)用[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2008,20(8):1043-1046.

[15] Parham H,Pourreza N,Marahel F.Determination of thiram using gold nanoparticles and Resonance Rayleigh scattering method[J].Talanta,2015,141(1):143-149.

[16] 龐向東,譚建紅,江虹.共振瑞利散射法測(cè)定藥物及生物樣品中的頭孢硫脒[J].化學(xué)世界,2015,56(6): 340-342.

[17] 盛麗,米瑩,陶彩虹.銻(Ⅲ)-碘化鉀-若丹明B體系共振瑞利散射光譜法測(cè)定痕量銻[J].化學(xué)通報(bào),2014,77(5): 474-476.

[18] 印永嘉,李大珍.物理化學(xué)簡(jiǎn)明教程：下冊(cè)[M].北京:人民教育出版社,1980:132.

[19] 鐘冬蓮,湯富彬,沈丹玉,等.基質(zhì)固相分散凈化-氣相色譜法測(cè)定竹筍中7種農(nóng)藥多殘留[J].分析試驗(yàn)室,2013,32(1):64-68.

[20] 張超,楊紅.水、土壤和蔬菜中毒死蜱、甲基毒死蜱殘留檢測(cè)前處理方法[J].農(nóng)藥,2010,49(5):367-370.

Determination of Chlorpyrifos-methyl in Vegetables and Fruit by Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction and Resonance Light Scattering Method

ZHANG Chuanlin,HU Qinghong*
(School of Pharmacy,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China)

This study aimed to establish a new resonance light scattering(RLS) method for determination of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit,providing technical support for rapid detection of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit.In Britton-Robinson buffer (pH=10.00),with Triton X-100 as a stabilizer,the RLS intensity of chlorpyrifos-methyl greatly enhanced when brilliant cresyl blue was added.The scattering peaks were located at 360 nm and 544 nm.The RLS intensity was linear to the concentration of chlorpyrifors-methyl in the range of 0.1—5.0 μg/mL at 544 nm with a detection limit of 0.029 μg/mL.Several samples were purified by matrix solid-phase dispersion(MSPD) and then determined.The average recoveries of chlorpyrifos-methyl in these samples ranged from 91.5% to 96.8%.This method was quick and sensitive for determination of chlorpyrifos-methyl residues in vegetables and fruit.

resonance light scattering; chlorpyrifos-methyl; brilliant cresyl blue; matrix solid-phase dispersion

2015-12-30

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[黔科合J字LKZ(2011)44]

張傳林(1990-)，男，江蘇鹽城人，在讀碩士研究生，研究方向：分子光譜的分析應(yīng)用。 E-mail：zhangcl1215@163.com

*通訊作者：胡慶紅(1963-)，男，貴州遵義人，教授，主要從事分子光譜的分析應(yīng)用研究。 E-mail:huqinghong1963@126.com

S481+.8

A

1004-3268(2016)08-0081-05