吳三橋，代惠萍,,3*，賈根良，李新生，裴金金(.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 漢中 7300； .陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 7300； 3.蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復(fù)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊凌 700)

EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿生長和Zn積累特性的影響

吳三橋1，代惠萍1,2,3*，賈根良4，李新生2，裴金金2
(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 漢中 723001； 2.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001； 3.蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復(fù)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以紫花苜蓿為材料，采用盆栽法，研究了EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿生長和Zn積累特性的影響, 為螯合劑誘導(dǎo)植物修復(fù)Zn污染土壤提供理論指導(dǎo)依據(jù)。結(jié)果表明，與CK(不施加Zn和EDTA)相比，單一Zn脅迫(250 μg/kg Zn)下紫花苜蓿的株高、葉片干質(zhì)量、根系干質(zhì)量、葉片相對生長量、葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素a/b增加，但與CK差異不顯著；而Zn+EDTA復(fù)合處理(250 μg/kg Zn+10 μg/kg EDTA)的紫花苜蓿葉片干質(zhì)量、葉片相對生長量、根系相對生長量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉片Zn含量、耐性指數(shù)較單一Zn脅迫處理分別顯著增加了24.9%、35.7倍、2.3倍、13.0%、11.8%、27.2%、18.6%?？梢?，EDTA 有助于提高Zn脅迫下紫花苜蓿的葉綠素含量，從而增加生物量、轉(zhuǎn)運指數(shù)和耐性指數(shù)。因此，紫花苜蓿可作為重金屬Zn污染土壤的修復(fù)植物，而EDTA則能有效地促進(jìn)紫花苜蓿對Zn的吸收。

Zn脅迫； EDTA； 紫花苜蓿； 生物量； 積累特性

礦區(qū)開采和冶煉產(chǎn)生的廢水、廢氣及固體廢物所導(dǎo)致的重金屬污染對生態(tài)系統(tǒng)的破壞極為嚴(yán)重[1-4]。由于金屬采礦所產(chǎn)生的尾礦砂顆粒較小，植物養(yǎng)分含量低，保水、保肥性能較差，重金屬含量較高，故對其進(jìn)行植被恢復(fù)非常困難[5-7]。植物修復(fù)是治理土壤重金屬污染常用技術(shù)，具有治理成本的低廉性、治理過程的原位性以及治理效果的永久性等優(yōu)點[8-12]。施加螯合劑可以促進(jìn)土壤固相中重金屬的釋放，提高重金屬的生物有效性[13-14]。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加乙二胺四乙酸(EDTA)使金盞菊土壤Cd的修復(fù)效率提高217%。Cui等[16]研究表明，施加螯合劑EDTA后植物中Pb的累積濃度增加了2.5倍。Sun等[17]研究認(rèn)為，EDTA能提高根際土壤Pb的植物有效性，促進(jìn)Pb從根系向地上部的運輸，顯著提高植物對Pb的富集能力。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科苜蓿屬多年生植物，能同時積累 Cd、Zn、Cu等多種重金屬元素，因此成為治理污染土壤的首選植物材料[7-8]。然而，關(guān)于EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿生長發(fā)育的影響研究尚未見報道。鑒于此，通過添加外源EDTA，初步探討EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿葉、根Zn積累量和生長的影響，解析紫花苜蓿在Zn脅迫下的耐受機制，為螯合劑誘導(dǎo)植物修復(fù)Zn污染土壤提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試驗地概況

紫花苜蓿品種為大葉苜蓿，種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供，供試土壤為草炭土、蛭石、農(nóng)田表層土壤以質(zhì)量比3∶1∶1混合。土壤性質(zhì)：pH值為6.5，全氮含量為3.71 g/kg、有機質(zhì)含量為76.8 g/kg、有效鉀含量為28.2 mg/kg、有效磷含量為18.8 mg/kg，土壤陽離子交換量為0.033 mmol/kg。盆栽試驗在陜西省資源生物重點實驗室生物修復(fù)實驗室溫室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用盆栽法，塑料盆直徑25 cm、高16 cm，每盆土壤質(zhì)量約 2 kg。2014年3月播種，選飽滿、無病蟲害苜蓿種子，用0.1%的HgCl2消毒10 min，將HgCl2沖洗干凈后，每盤播種20粒，在自然光照條件下培養(yǎng)，苜蓿生長期間用自來水澆灌，苜蓿幼苗生長3個月后，選生長一致的幼苗進(jìn)行以下處理。

在去離子水中分別加入ZnSO4·7H2O母液和EDTA配成不同質(zhì)量濃度的處理液，施入土壤中，形成對照(CK，不施加Zn和EDTA)、250 μg/kg Zn、250 μg/kg Zn+10 μg/kg EDTA 3個處理。每處理重復(fù)6次，共18盆。培養(yǎng)期間，采用稱質(zhì)量法補充消耗的水分。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生物量 Zn脅迫后50 d時取樣，每個處理取12株，測量每株苜蓿的株高，分葉片和根系采收，并用去離子水沖洗。根系在20 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 溶液中浸泡交換10 min，以去除根系表面粘附的金屬離子。然后烘箱內(nèi)100 ℃殺青15 min，80 ℃下烘至恒質(zhì)量。之后用萬分之一天平稱量苜蓿葉片和根系的干質(zhì)量。按照如下方法計算相對生長量：相對生長量=(脅迫后生物量-脅迫前生物量)/脅迫前生物量。

1.3.2 Zn含量 將1.3.1中測定過干質(zhì)量的葉片和根系的樣品，粉碎成粉末，65%HNO3消解，用原子吸收分光度計測定Zn含量[17]。

1.3.3 轉(zhuǎn)運指數(shù)、耐性指數(shù)和積累量 根據(jù)Dai等[12]的方法計算轉(zhuǎn)運指數(shù)。轉(zhuǎn)運指數(shù)=地上部Zn含量/根部Zn含量；耐性指數(shù)=Zn脅迫處理植物干質(zhì)量/對照植物干質(zhì)量[12]；Zn積累量=植物地上(或根系)Zn含量×植物地上(或根系)生物量。

1.3.4 葉綠素含量 Zn脅迫后50 d取樣，每個處理取12株，將葉片混合，利用分析天平準(zhǔn)確稱取0.02 g剪碎的樣品(設(shè)3次重復(fù))，置于10 mL具塞刻度試管(各管先分別加入約0.5 mL純丙酮)，再加入80%丙酮浸提葉綠素，樣品完全褪色后，以80%丙酮作為空白調(diào)零，分別在645、663 nm波長下測定提取液的光密度，計算葉綠素a、葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析， 采用one-way ANOVA方差分析比較不同處理間各項指標(biāo)的差異，通過LSD法進(jìn)行差異顯著性(P<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿生長的影響

由表1可見，與CK相比，單一Zn脅迫處理紫花苜蓿株高、葉片干質(zhì)量、根系干質(zhì)量均增加，但差異不顯著；而Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿株高、葉片干質(zhì)量、根系干質(zhì)量均較CK顯著增加。Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿的株高、葉片干質(zhì)量、根系干質(zhì)量分別比單一Zn脅迫處理提高了13.3%、24.9%、10.8%。

表1 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿生長的影響

處理株高/cm干質(zhì)量/g葉片根系CK30．18±2．23b0．901±0．04b0．591±0．002bZn31．13±3．10ab0．907±0．05b0．620±0．001abZn+EDTA35．26±3．17a1．133±0．08a0．687±0．001a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿相對生長量的影響

由圖1可知，與CK相比，單一Zn脅迫處理紫花苜蓿葉片和根系的相對生長量均稍有增加，Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿葉片和根系相對生長量均有明顯增加。Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿的葉片、根系的相對生長量分別較單一Zn脅迫處理提高了35.7倍和2.3倍(P<0.05)。可見，EDTA可顯著提高Zn脅迫下紫花苜蓿葉片和根系的相對生長量。

不同字母表示同一部位不同處理間差異達(dá)0.05顯著水平圖1 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿相對生長量的影響

2.3 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響

表2顯示，與CK相比，單一Zn脅迫處理和Zn+EDTA復(fù)合處理下紫花苜蓿葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b值均增加，且Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b分別比單一Zn脅迫處理提高了13.0%、11.8%、12.6%和3.6%?？梢?，EDTA可以提高Zn脅迫紫花苜蓿葉片葉綠素含量。

表2 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響

2.4 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿積累特性的影響

表3表明，與CK相比，單一Zn脅迫處理和Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿Zn含量、轉(zhuǎn)運指數(shù)、耐性指數(shù)和 Zn積累量均提高，而且Zn+EDTA復(fù)合處理紫花苜蓿葉片Zn含量、根系Zn含量、轉(zhuǎn)運指數(shù)、耐性指數(shù)、葉片積累量、根系積累量別比單一Zn脅迫處理高了27.2%、15.5%、9.9%、18.6%、2.0%、4.2%。可見，EDTA提高了紫花苜蓿的富Zn能力。

表3 EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿體內(nèi)積累和分布的影響

處理Zn含量/(mg/kg)葉片根系轉(zhuǎn)運指數(shù)耐性指數(shù)Zn積累量/(μg/株)葉片根系CK2．0±0．3c3．9±0．02c0．51±0．01b2．2±0．31b6．6±0．4bZn32．4±2．2b40．1±0．35a0．81±0．01a1．02±0．01b35．7±3．11a64．7±6．7aZn+EDTA41．2±2．9a46．3±0．42a0．89±0．02a1．21±0．02a36．4±3．26a67．4±7．8a

3 結(jié)論與討論

逆境條件下，植株相對生長量的大小反映其抗逆性的強弱，相對生長量愈大,抗逆能力愈強[18]。本試驗中，Zn+EDTA復(fù)合處理下紫花苜蓿相對生長量分別高于單一Zn脅迫處理相對生長量。由此可見， EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿的生長具有一定的促進(jìn)作用。

EDTA能增加土壤中重金屬的生物有效性，促進(jìn)植物對重金屬的吸收，降低重金屬對土壤和植物的毒性[19-20]。添加EDTA能夠使Cu、Cd、Pb和Zn在燈心草和龍須草體內(nèi)的積累量顯著增加[15]。本研究證實，與單一Zn脅迫比較，添加EDTA提高了紫花苜蓿的株高、葉片干質(zhì)量、根系干質(zhì)量及其對Zn的吸收、積累量和轉(zhuǎn)運指數(shù)，與王紅新等[8]和邱莉萍等[14]的研究結(jié)果相似。這可能是由于向土壤中施加螯合劑EDTA，活化了土壤中的重金屬，提高重金屬的生物有效性，促進(jìn)植物對重金屬的吸收。

葉片葉綠素含量作為植物的重要功能性狀指標(biāo)可以較好地反映其對非生物脅迫的生理響應(yīng)[18]。王學(xué)鋒等[21]研究表明，添加EDTA促進(jìn)了茼蒿的生長，使茼蒿中的葉綠素含量增加。本試驗也驗證了這一點。Zn+EDTA復(fù)合處理苜蓿的葉綠素a、葉綠素b含量較單一Zn脅迫處理顯著增加。說明添加EDTA對紫花苜蓿未產(chǎn)生毒害且使土壤中Zn受EDTA絡(luò)合，更易被苜蓿吸收，而Zn對葉綠素合成有重要的影響。

EDTA通過提高Zn脅迫下葉綠素的含量增強光合作用，進(jìn)而促進(jìn)Zn脅迫下紫花苜蓿的生物量積累。同時，EDTA促進(jìn)了紫花苜蓿根系和葉片對Zn的吸收、轉(zhuǎn)運及積累。因此，EDTA 對Zn 污染土壤中的重金屬元素有較好的絡(luò)合作用，對紫花苜蓿修復(fù)Zn污染土壤有較好的促進(jìn)作用。

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Effects of ETDA on Growth and Zn Accumulation ofMedicagosativaL.under Zn Stress

WU Sanqiao1,DAI Huiping1,2,3*,JIA Genliang4,LI Xinsheng2,PEI Jinjin2
(1.College of Biological Science & Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China; 2.Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-resources/Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China; 3.School of Life Sciences,Lanzhou University/Gansu Province Key Laboratory of Biomonitoring and Bioremediation for Environmental Pollution,Lanzhou 730000,China; 4.College of Science, Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

The effects of EDTA on Zn accumulation and growth ofMedicagesativaL. under Zn stress were studied by pot experiment,so as to provide theoretical basis for the chelator induced remediation of Zn contaminated soils by alfalfa.The results showed that there were no significant differences in dry weight of leaves and roots,relative growth yield of leaves,chlorophyll a content,chlorophyll b content and chlorophyll a/b between Zn stress treatment and control without Zn and EDTA.Compared with Zn stress treatment,dry weight of leaves,relative growth yield of leaves and root,contents of chlorophyll a,chlorophyll b,Zn contents of leaves,tolerance factor of the treatment with Zn and EDTA were increased by 24.9%,35.7 times,2.3 times,13.0%,11.8%,27.2%,18.6%.Above all,EDTA could alleviate the injuries induced by Zn stress by increasing the contents of chorophyll a,and chorophyll b,biomass translocation factor and tolerance factor of alfalfa.So,alfalfa can be the remediation plant for Zn contaminated soils,and EDTA can promote the absorbtion of Zn for alfalfa.

Zn stress; EDTA;MedicagesativaL.; biomass; accumulation character

2016-01-06

陜西省教育廳重點實驗室項目(15JS019)；陜西省自然科學(xué)基金項目(2015JM3086)；甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復(fù)重點實驗室開放基金項目(GBBL2015006)；國家大學(xué)生創(chuàng)新項目(201510720570)；陜西省科技廳項目(SZS-15-05)

吳三橋(1962-)，男，湖北鄖縣人，教授，本科，主要從事植物生理生化研究。E-mail:wsq800318@126.com

*通訊作者：代惠萍(1972-)，女，陜西武功人，副教授，博士，主要從事植物逆境生理學(xué)研究。E-mail:daihp72@aliyun.com

S963.22+3.3;X53

A

1004-3268(2016)08-0049-04