梁曉龍，李巧云，牛吉山(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

小麥黑胚病籽粒黑變機(jī)制研究進(jìn)展

梁曉龍，李巧云，牛吉山*
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

綜述了小麥黑胚病病因及其黑變機(jī)制研究進(jìn)展。目前的研究結(jié)果表明，環(huán)境因素與病菌侵染引起酶促褐變，導(dǎo)致小麥黑胚病癥狀產(chǎn)生，而褐變是小麥籽粒中酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生氧化形成褐色物質(zhì)導(dǎo)致的。篩選不同的生理型與病理型感病材料是研究小麥黑胚病黑變機(jī)制的前提，采用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)研究方法能夠進(jìn)一步揭示小麥黑胚病的黑變機(jī)制。

小麥； 黑胚?。?病因； 黑變機(jī)制

依據(jù)我國(guó)2000年開(kāi)始實(shí)施的小麥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將小麥黑胚粒歸在不完善粒之中，三等以上小麥黑胚粒的最大允許含量為6.0%[1]。Li等[2]于2010—2012年連續(xù)3 a對(duì)鄭州地區(qū)種植的403份小麥材料進(jìn)行黑胚率調(diào)查,結(jié)果顯示，62.5%的材料黑胚率大于5%，這意味著目前黃淮麥區(qū)生產(chǎn)品種和區(qū)試中的新品系普遍感黑胚病，一旦小麥灌漿期遇到合適氣候條件，將會(huì)導(dǎo)致黑胚率超標(biāo)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于小麥黑胚病的癥狀、發(fā)病率、危害、影響因素、致病菌分離、品種抗病性、藥物防治等,國(guó)內(nèi)外已有大量的研究報(bào)道[3-17]，文中對(duì)小麥黑胚病籽粒的黑變機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為小麥黑胚病抗病機(jī)制研究及抗病育種提供參考。

1 小麥黑胚病的病因

1.1 環(huán)境因素

諸多的研究結(jié)果表明，小麥生育期尤其是灌漿期的降雨、土壤與大氣濕度、溫度、露水等環(huán)境因素影響黑胚的形成與發(fā)展[18-20]。在溫帶氣候條件下，小麥開(kāi)花期高溫高濕有利于黑胚的形成，氣溫越高、濕度越大，黑胚率越高；而在灌漿期間高濕、相對(duì)較低的溫度有利于黑胚的發(fā)生，高溫則相反，這可能是因?yàn)榈蜏匮舆t了小麥成熟從而延長(zhǎng)了病原菌侵染期，而高溫則縮短了病原菌侵染期[18,21-28]。而且，灌漿期降雨的時(shí)間與降雨量對(duì)黑胚病的影響也很大，間歇性的降雨比一次強(qiáng)降雨更能加重黑胚的發(fā)生，特別是乳熟期到面團(tuán)期的潮濕環(huán)境與較高的溫度會(huì)增加小麥的黑胚率[29-30]，黃淮麥區(qū)5月份降雨量超過(guò)90 mm，雨日在10～15 d，連陰雨2～3次，大氣濕度70%以上，麥田早晚結(jié)露，黑胚嚴(yán)重程度將顯著增加[24-25],干旱天氣黑胚率降低,可能是因?yàn)楦珊抵萍s了病菌孢子在空氣中的傳播與侵染[31]?？梢?jiàn)，潮濕的環(huán)境與適宜的溫度在黑胚形成中發(fā)揮著重要作用。

1.2 真菌感染

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從小麥黑胚病籽粒上分離的真菌有21個(gè)屬，分別是小支頂孢屬(Acremoniella)、 鏈格孢屬(Altemaria)、短梗霉屬(Aureobasidium)、殼二孢屬(Ascochyta)、曲霉屬(Aspergillus)、離蠕孢屬 (Bipolaris)、葡萄孢屬(Botrvtis)、毛殼菌屬(Chaetomium)、芽枝霉屬(Cladosporium)、彎孢霉屬(Curvularia)、束梗孢霉屬(Doratomyces)、德斯霉屬(Drechsleras)、附球霉屬(Epicoccum)、 鐮刀菌屬(Fusarium)、黑孢菌屬(Nigrospora)、青霉屬(Penicillium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、小菌核屬(Sclerotium)、針殼孢屬(Septoria)、匐柄霉屬(Stemphylium)、端孢屬(Trichotheciutn)[17-18,32-36]。由于黑胚病的發(fā)生受環(huán)境因素影響,不同地區(qū)報(bào)道的主要致病菌也不盡一致[6-7,9,21,37-41]。Nesterov[37]認(rèn)為小麥根腐長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporiumsativum)是哈薩克斯坦最主要的致病菌，而Kumar等[38]認(rèn)為小麥根腐離蠕孢(B.sorokiniana)是引起小麥黑胚病與根腐病的首要致病菌。近二十幾年來(lái)，我國(guó)學(xué)者在黑胚病病原菌的構(gòu)成及其分布比例上做了大量研究工作，結(jié)論差異也較大[9,17,21,37-41 ]。張?zhí)煊畹萚39]、白金鎧等[40]認(rèn)為，B.sorokiniana不僅是黑胚病的主要致病菌，還造成根腐和穗腐，對(duì)小麥的危害很大，鏈格孢(A.alternata)不是主要的病原菌；山東、河南、河北等地學(xué)者認(rèn)為Altemariaspp.是小麥黑胚病的主要致病菌[6,9,21]。新疆的研究大致認(rèn)同A.alternata是該病害的優(yōu)勢(shì)病原菌，同時(shí)B.sorokiniana也是重要致病菌[41]，郝敬喆等在吐魯番還分離到喙?fàn)钔荒毭?擬)(Exserohilumrostratum)[7]?？梢?jiàn)，在我國(guó)由鏈格孢與根腐離蠕孢引起的黑胚病最常見(jiàn)。

真菌導(dǎo)致黑胚病的原因可能是厚厚的菌絲體附著在小麥籽粒胚部使其變色，從而引起黑胚癥狀[42-43]，然而這與小麥籽粒尖端比胚部有更多菌絲體的研究結(jié)果相矛盾[44]，很多情況下，從病粒與健康籽粒上分離的真菌種類(lèi)相當(dāng)[17,23,45]，而且，從來(lái)源于澳大利亞的黑胚粒上分離到的真菌最多的是A.alternate，通過(guò)顯微鏡觀察到其在整個(gè)籽粒表面都能生長(zhǎng)，其侵染之處與變色的細(xì)胞并不關(guān)聯(lián)，用該菌人為侵染小麥穗也未能誘導(dǎo)黑胚癥狀[22]。Conner等[45]用層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)侵染生長(zhǎng)在加利福尼亞的小麥，產(chǎn)生黑胚癥狀，然而，在北美及加拿大等地區(qū)進(jìn)行的研究并未發(fā)現(xiàn)層出鐮刀菌與黑胚形成相關(guān)[30,23,46]，這表明真菌侵染不是黑胚形成的唯一原因。

1.3 酶促褐變

Williamson[22]把成熟小麥種子依次放在酚酸溶液與過(guò)氧化氫(H2O2)溶液中，能夠在離體條件下誘導(dǎo)黑胚癥狀產(chǎn)生，這表明引起反應(yīng)的酶在小麥種子中產(chǎn)生，而且需要H2O2參與才產(chǎn)生黑胚癥狀，其很可能是過(guò)氧化物酶(POD)。而且在試驗(yàn)中，感病與抗病小麥品種產(chǎn)生的癥狀沒(méi)有區(qū)別。這表明POD參與的酶促褐變也是黑胚形成的原因，然而也不排除其他氧化酶參與了黑胚的形成。另有研究表明，在黑胚病變籽粒組織中，酚酸含量比正常組織高得多[47]。

由以上研究結(jié)果可知，小麥黑胚病病因復(fù)雜，環(huán)境因素、真菌侵染、酶促褐變3個(gè)主要因素在不同品種病變中的作用可能不同，因此應(yīng)找出典型的小麥材料進(jìn)一步詳細(xì)研究。

2 小麥黑胚病籽粒黑變機(jī)制

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，無(wú)論是環(huán)境影響、病菌侵染還是不同品種特定的生理反應(yīng)，籽粒黑變機(jī)制都可能與酚類(lèi)物質(zhì)參與的酶促反應(yīng)有關(guān)[48-50]，酚酸類(lèi)物質(zhì)、H2O2、超氧化物歧化酶(SOD)、POD、多酚氧化酶(PPO)等多種酶與底物都可能參與了酶促褐變過(guò)程。

酚酸類(lèi)物質(zhì)阿魏酸與對(duì)香豆酸是單子葉植物細(xì)胞壁中主要的酚類(lèi)化合物[51]。在小麥中，其主要分布在籽粒的種皮與糊粉層中[52]，分別由苯丙氨酸與酪氨酸通過(guò)一系列的反應(yīng)產(chǎn)生，起始步驟由苯丙氨酸解氨酶(PAL)或者酪氨酸解氨酶(TAL)催化[53]。作為酶促反應(yīng)的底物，其供應(yīng)可能是籽粒黑變的限速因素之一，所以PAL與TAL活性對(duì)黑胚形成的影響可能很大。有研究表明，感病硬粒小麥品種阿魏酸含量與PAL活性比抗病品種高,TAL活性低[51]。大麥感病籽粒外皮中阿魏酸與對(duì)香豆酸比健康籽粒高60倍[47]。

所有的植物都含有4類(lèi)POD (1-Cys POD、2-Cys POD、POD Ⅱ和POD Q)，該酶催化多種酚類(lèi)化合物的氧化反應(yīng)[54-55]。在小麥籽粒體外產(chǎn)生黑胚癥狀的試驗(yàn)中，黑胚癥狀嚴(yán)重程度隨酚溶液種類(lèi)不同而變化，用酪氨酸作為底物時(shí)僅僅胚周?chē)M織變色，而用兒茶酚時(shí)則胚與腹溝組織變色，表明不同POD同工酶在不同的組織中參與黑胚形成[22]。

H2O2的及時(shí)清除是黑胚形成的另一個(gè)重要機(jī)制。POD、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶都能夠清除H2O2[59]，這些酶活性的增加可能參與抗病品種的抗病機(jī)制。另外還有一些酶可能參與酶促褐變，如PPO把酚氧化為醌[54]，可能與POD協(xié)同作用參與酶促褐變反應(yīng)。研究表明，小麥和大麥穗部組織中存在PPO，籽粒中的PPO能使面粉變色[60]。脂氧合酶(LOX)直接催化不飽和脂肪酸與氧氣生成氫過(guò)氧化物，在種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)發(fā)育[61]、應(yīng)對(duì)傷害與真菌及衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用[62]，由此可認(rèn)為，LOX通過(guò)植物對(duì)脅迫或傷害的應(yīng)答反應(yīng)參與了黑胚的形成。

基于上述研究結(jié)果的報(bào)道，可以推測(cè)小麥籽粒黑變的系列反應(yīng)：由于不利的環(huán)境因素(如高濕環(huán)境引起的穗發(fā)芽、病菌侵染或者其他的傷害等等)存在，引起小麥籽粒細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)量的ROS，如果這些過(guò)量的ROS不能及時(shí)被清除，將引起氧化損傷，使本來(lái)分布于不同細(xì)胞器中的酚酸與POD或PPO結(jié)合，產(chǎn)生高活性的苯氧基，苯氧基能自發(fā)形成醌類(lèi)物質(zhì)，醌類(lèi)發(fā)生自聚合或與多種氨基酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)形成有色終產(chǎn)物[54]，當(dāng)然，植物也會(huì)通過(guò)其他途徑提高應(yīng)對(duì)脅迫的能力，如PAL/TAL、LOX活性升高等(圖1)。許多文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果支持這一黑變機(jī)制的推測(cè)。王璟等[63]對(duì)黑變籽粒的表皮分別用丙酮、5%HCl甲醇溶液和2%NaOH溶液進(jìn)行加熱提取，直至黑變籽粒種皮上黑斑褪去為止。所得提取液依次在210～290 nm處測(cè)定OD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液在220 nm處具有最大吸光值，與黑色素最大吸收值220 nm一致，推測(cè)病變籽粒表皮黑變與黑色素產(chǎn)生有關(guān)。

圖1 黑胚病癥狀形成示意圖

于巧麗[64]研究了接種A.alternata前后抗、感黑胚病品種小穗內(nèi)SOD、POD、PPO、PAL酶活性的變化和酚積累情況，接菌后抗病品種SOD與POD活性達(dá)到峰值的時(shí)間早而且活性高于感病品種，而感病品種PPO與PAL活性高于抗病品種?？?、感病品種的酚類(lèi)物質(zhì)含量沒(méi)有極顯著差異，但是總酚水平抗病品種高于感病品種，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)積累量與小麥品種黑胚病抗性呈正相關(guān)。接菌后抗病品種丙二醛(MDA)含量低于感病品種[49]，表明由于接菌脅迫引起ROS含量的增加，抗病品種抗氧化酶活性高，及時(shí)清理ROS減少其損傷，而感病品種由于未能及時(shí)清理引起氧化損傷，使膜的通透性增加，導(dǎo)致POD與底物發(fā)生酶促褐變產(chǎn)生黑胚癥狀。

Mak等[65]用雙向電泳比較了感黑胚病小麥品種的病粒與健康粒胚部和胚乳-外皮部分的蛋白質(zhì)組成。對(duì)胚部的354個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)和胚乳-外皮部分的303個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，沒(méi)有鑒定出真菌或細(xì)菌來(lái)源的蛋白質(zhì)，健粒與病粒間有許多差異蛋白，與酚類(lèi)代謝有關(guān)的酶和POD在胚與胚乳部分的表達(dá)量不同，最引人矚目的是，在12類(lèi)功能蛋白中差異最大的一類(lèi)是脅迫類(lèi)，包括脅迫、病害相關(guān)蛋白和防御基因產(chǎn)物。這些蛋白質(zhì)在健康粒中具有較高水平，提示黑胚可能是由于小麥籽粒缺乏在脅迫時(shí)的自我保護(hù)能力所致。黑胚粒中無(wú)真菌蛋白，表明在某些情況下黑胚與微生物活動(dòng)無(wú)關(guān)；脅迫、病害和防御相關(guān)蛋白減少，可以解釋抽穗前用殺真菌劑處理反而增加黑胚粒發(fā)生的現(xiàn)象，因?yàn)闅⒄婢鷦┨幚砜煞烙锩{迫，導(dǎo)致多數(shù)籽粒細(xì)胞中脅迫相關(guān)蛋白降低，增加了黑胚病發(fā)生機(jī)會(huì)[66]。

March等[67]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，感病大麥品種Sloop的病粒中POD Ⅱ表達(dá)量比健康粒更豐富，因此POD很可能參與了大麥中黑胚的形成。與大麥中籽粒色污病抗性相關(guān)的多個(gè)QTL被定為在2H染色體上，March等[68]運(yùn)用比較作圖的技術(shù)，比對(duì)了大麥2H染色體與水稻7號(hào)染色體以篩選與2H染色體QTL相關(guān)的基因，結(jié)果表明，POD基因、LOX基因、PAL基因、醌還原酶(QR)基因可以作為調(diào)控黑胚病的候選基因。

以上麥粒黑變機(jī)制中的一些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。例如，在籽粒發(fā)育過(guò)程中，什么因素使參與酶促反應(yīng)的酶與底物結(jié)合到一起？穗發(fā)芽可能是原因之一，Cochrane[50]發(fā)現(xiàn)在大麥籽粒發(fā)育過(guò)程中，高濕環(huán)境引起胚芽鞘的伸長(zhǎng)先于籽粒成熟，果皮細(xì)胞沒(méi)有破裂而胚部糊粉層與外種皮細(xì)胞破裂,并且以破裂邊緣變黑來(lái)應(yīng)對(duì)破裂引起的傷害，穗發(fā)芽提供了黑胚發(fā)生需要的細(xì)胞傷害，高濕環(huán)境引起穗發(fā)芽同時(shí)也引起黑胚就更易理解了。這表明由傷害啟動(dòng)的酶促褐變會(huì)導(dǎo)致黑胚形成。那么，哪些生理過(guò)程導(dǎo)致了籽粒發(fā)育過(guò)程的傷害，參與酶促褐變的酶與底物是由胚部產(chǎn)生還是其他部位產(chǎn)生后運(yùn)輸?shù)阶蚜５呐卟康冗@些問(wèn)題還需要研究。再如，在引起黑胚形成的環(huán)境中，酶促褐變機(jī)制中涉及的酶如SOD、POD、PPO、PAL/TAL等的基因表達(dá)量是否上調(diào)？其活性與基因表達(dá)量的變化是否一致？小麥籽粒中哪些組織產(chǎn)生酶促褐變的酶？

3 進(jìn)一步研究小麥籽粒黑變機(jī)制的思路

3.1 確定不同發(fā)病類(lèi)型的研究材料

明確感病品種高黑胚率的主要原因，將其分為病理型黑胚病(主要由致病菌引起)、生理型黑胚病(主要病因?yàn)樾←溩蚜９酀{后期高濕低溫氣候因子)2種類(lèi)型，根據(jù)不同類(lèi)型黑胚病材料制定研究路線，使小麥黑胚病黑變機(jī)制與抗病機(jī)制的研究更有針對(duì)性。

3.2 確定不同的研究方法

病理型黑胚病研究路線：分離致病菌，明確適宜該菌致病的環(huán)境因素，在適宜的人工環(huán)境下進(jìn)行研究。生理型黑胚?。河玫湫偷目垢衅贩N進(jìn)行多年多點(diǎn)種植，將發(fā)病率與環(huán)境因素進(jìn)行互作分析，探究環(huán)境變化對(duì)黑胚病的影響；運(yùn)用典型抗感病材料，在籽粒病變的不同時(shí)期取樣，并對(duì)籽粒的胚、種皮、胚乳等不同部位取樣，測(cè)定發(fā)育過(guò)程中POD、CAT、SOD、GSH-Px等多種抗氧化酶的活性，H2O2等活性氧含量以及MDA、羥基(-OH)、電導(dǎo)率等反映細(xì)胞被氧化程度的指標(biāo)，進(jìn)行小麥黑胚發(fā)生機(jī)制研究。

3.3 采用組學(xué)研究手段

從黑胚產(chǎn)生的機(jī)制可以看出，酚類(lèi)與H2O2的供應(yīng)、ROS的清除等生化過(guò)程都可能參與，這意味著大量的基因與黑胚形成和小麥品種的敏感性有關(guān)。鑒于此，對(duì)黑胚形成的生化機(jī)制研究需要用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等有廣泛基礎(chǔ)的研究方法進(jìn)行全基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組的分析，明確小麥籽粒黑變機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與黑胚病抗性關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因片段(標(biāo)簽)，將這些基因片段(標(biāo)簽)在遺傳群體中進(jìn)行驗(yàn)證或者通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)與黑胚病抗性密切連鎖的分子標(biāo)記，運(yùn)用于小麥抗黑胚病常規(guī)育種的輔助選擇或者關(guān)鍵基因克隆。需要注意的是，前人采用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)籽粒黑變機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)，僅僅用了成熟種子作為試驗(yàn)材料，研究抗感病品系或者同一品種病粒與健粒蛋白質(zhì)組成的差異，這不能直接反映黑胚形成過(guò)程中的物質(zhì)變化，需要在黑變的不同時(shí)期取樣，研究黑胚形成過(guò)程中物質(zhì)的變化，才能更好地揭示小麥籽粒黑變機(jī)制。

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Research Advance in Blacking Mechanism of Wheat Grain with Black Point

LIANG Xiaolong,LI Qiaoyun,NIU Jishan*
(National Centre of Engineering and Technological Research for Wheat,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In this paper,we summarized the causing factors and the grain blacking mechanisms of wheat black point.Up to now,most reports indicate that the black point symptoms are developed from some chemical changes catalyzed by enzymes,and the products are black.Pathogen infection and environmental factors significantly affect the black point development.Blacking is considered as the oxidation of some phenolic substances in wheat grains.To screen wheat germplasms susceptible to physiological black point and pathological black point is the prerequisite for the study of grain blacking.Study on the mechanism of blacking of the wheat black point grains will be advanced by new techniques such as genomics,proteomics,transcriptomics and metabolomics.

wheat; black point; causing factor; blacking mechanism

2015-12-08

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD26B01)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101105)

梁曉龍(1990-)，男，河南許昌人，在讀碩士研究生，研究方向：小麥抗病遺傳及分子育種。 E-mail:longa0374@163.com

*通訊作者：牛吉山(1965-)，男，山西陽(yáng)城人，研究員，博士，主要從事小麥抗病遺傳及分子育種研究。 E-mail:jsniu@263.net

S512.1；S435.121

A

1004-3268(2016)08-0001-06