薛東齊，許向陽，姜景彬，王竇逗，李景富*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

大蒜素對番茄葉霉菌不同生理小種的抑制作用

薛東齊1，許向陽1，姜景彬1，王竇逗2，李景富1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

研究大蒜素對番茄生產(chǎn)上葉霉菌主流生理小種1.2.3.4以及2014年新發(fā)現(xiàn)生理小種2.5、2.4.5和1.2.3.4.9的抑制作用，為開發(fā)安全、高效的植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。首先制備大蒜素抽提母液，采用定硫法對其中的大蒜素進(jìn)行定量測定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液中滴加4 mL濃硝酸、溶液pH值為2.0時能夠更為準(zhǔn)確地測得大蒜素的含量，試驗(yàn)測得大蒜素含量為0.52%。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了大蒜素對4個葉霉菌生理小種菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)，離體葉片上的病害預(yù)防試驗(yàn)以及苗期藥效試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)大蒜素劑量>25 μL/mL時，其對葉霉菌生理小種菌絲生長的抑制活性較高，其中對1.2.3.4的抑制率最高，對1.2.3.4.9的抑制率最低，對其他2個生理小種的抑制率差異不顯著。當(dāng)大蒜素劑量<7.5 μL/mL時，其對4個生理小種孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)存在差異，其中對1.2.3.4.9的孢子萌發(fā)抑制率最低，對1.2.3.4的孢子萌發(fā)抑制率最高。當(dāng)大蒜素劑量為125 μL/mL時，其對葉霉菌4個生理小種在離體葉片上的預(yù)防效果均超過95%。苗期藥效試驗(yàn)表明，在相等劑量下，大蒜素對葉霉菌的防治效果高于多菌靈和甲基托布津，說明大蒜素是一種可以替代化學(xué)藥劑防治葉霉病的有效抑菌物質(zhì)。

番茄葉霉??； 生理小種； 大蒜素； 抑制率； 防治效果； 抑菌物質(zhì)； 植物源農(nóng)藥

番茄是世界上的一種重要蔬菜作物，由番茄葉霉病菌[Cladosporiumfulvum(Cook) Ciferri]引起的番茄葉霉病是我國乃至世界番茄生產(chǎn)上的主要病害之一，其造成番茄嚴(yán)重減產(chǎn)、果實(shí)質(zhì)量降低，甚至植株死亡[1]。C.fulvum具有生理小種多、分化速度快等特點(diǎn)，這增加了病害防治的難度。普通的化學(xué)藥劑難以長期有效地防治葉霉病，控制該病暴發(fā)最有效的方法是培育抗病品種。目前，應(yīng)用于抗病育種的抗病基因主要有Cf-5和Cf-9[2]，但是這些基因已經(jīng)被一些生理小種克服。因此，尋找一種防治葉霉病更為有效的方法迫在眉睫。

近些年，大蒜(AlliumsativumL.)提取物的生防功效得到較多研究。大蒜酶酶解蒜氨酸生成的大蒜素等18種含硫化合物是有效的抗癌[3]、抗腫瘤[4]、抗菌生物活性物質(zhì)[5]，已被廣泛應(yīng)用于人體和動物的抗菌治療。大蒜素具有植物廣譜抗菌素特性，大蒜粗提液對黃瓜枯萎病菌(Fusarumoxysporumsp.cucumerinumOwen)[6]、黃瓜黑星病菌(CladosporiumcucumerinumEll.et Arthur)[7]、白菜黑斑病菌[Alternariabrassicae(Berk.) Sace.][8]、辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeonian)[9]、番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)[10]、番茄早疫病菌[Alternariasolani(Ellis er Martin) Jones et grout][11]，以及一些土傳病菌都具有明顯的抑菌效果。為此，本試驗(yàn)利用大蒜素的抑菌特性，研究大蒜素對番茄生產(chǎn)上的葉霉菌主流生理小種1.2.3.4[12]，以及對2014年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組新發(fā)現(xiàn)的生理小種2.5[13]、2.4.5[13]和1.2.3.4.9[14]的抑制作用，為開發(fā)安全、高效的植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)，也為番茄無公害生產(chǎn)提供安全保障。

1 材料和方法

1.1 供試材料

主要包括紫皮大蒜(市售)，乙醚(分析純)，5%氯化鋇溶液，0.1%甲基橙溶液，有效成分60%多菌靈可濕性粉劑(市售)，有效成分70%甲基托布津可濕性粉劑(市售)，番茄葉霉菌生理小種1.2.3.4、2.5、2.4.5、1.2.3.4.9(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組保存)，PDA培養(yǎng)基，番茄品種Money maker。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜素抽提母液制備 選取新鮮的大蒜鱗莖，準(zhǔn)確稱量120 g，用無菌水洗凈后加石英砂置于研缽中研磨成漿，室溫放置30 min，加100 mL無菌水浸提5 min后，加30 mL乙醚萃取大蒜素，重復(fù)萃取3次，將3次萃取得到的乙醚層合并，30 ℃水浴除去乙醚，得到大蒜素抽提母液。0.2 μm濾膜過濾，將大蒜素抽提母液定容至10 mL，置于4 ℃保存。

1.2.2 大蒜素含量測定 取2 mL的大蒜素抽提母液，采用定硫法測定抽提母液中的大蒜素含量[15-16]。

1.2.3 大蒜素抑菌活性測定

1.2.3.1 大蒜素對葉霉菌不同生理小種菌絲生長的抑制作用測定 采用生長速率法[17]進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將滅菌后的PDA培養(yǎng)基冷卻至40 ℃，加入適量的大蒜提取液，配制成含量分別為5、10、15、20、25、30、35、40 μL/mL的帶藥培養(yǎng)基平板。分別將葉霉菌生理小種1.2.3.4、1.2.3.4.9、2.4.5、2.5的菌餅(直徑5 mm)置于冷卻的帶藥PDA培養(yǎng)基平板中央，每皿1片，3次重復(fù)，以無菌水處理為對照。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng)，3 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。菌落直徑(mm)=每處理菌落直徑-5；抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.3.2 大蒜素對葉霉菌不同生理小種孢子萌發(fā)的抑制作用測定 采用懸滴法[18]測定大蒜素對葉霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用。分別將葉霉菌不同生理小種在25 ℃下培養(yǎng)8～10 d，待其產(chǎn)孢，配制成106個/mL的孢懸液。將大蒜提取液配制成含量分別為1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20 μL/mL的溶液，然后與等體積的孢懸液充分混合，每處理重復(fù)3次，以無菌水處理為空白對照(CK)。于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)8 h，40倍物鏡下鏡檢各處理孢子萌發(fā)情況，孢子芽管長度超過孢子直徑的一半時視為萌發(fā)孢子[19]，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù))/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100%。

1.2.3.3 大蒜素在番茄離體葉片上的病害預(yù)防試驗(yàn) 挑取新鮮的4葉期Money maker番茄真葉，蒸餾水沖洗干凈，晾干后置于含量分別為25、50、75、100、125 μL/mL的大蒜素溶液中，浸透3 min。將浸透過大蒜素的番茄葉片置于底部鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，分別接種葉霉菌生理小種1.2.3.4、1.2.3.4.9、2.4.5、2.5的菌餅(直徑5 mm)，每葉1片，3次重復(fù)，以無菌水浸透為對照。將培養(yǎng)皿置于25 ℃、濕度為95%的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)，待對照充分發(fā)病后，測量病斑直徑，計(jì)算預(yù)防效果。預(yù)防效果=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100%。

1.2.3.4 大蒜素對葉霉菌的苗期藥效試驗(yàn) 將葉霉菌不同生理小種在25 ℃下培養(yǎng)8～10 d，待其產(chǎn)孢，將孢子混合后，配制成106個/mL的孢懸液。噴霧接種4葉期的Money maker，每5株為一組，接種后保濕24 h，置于溫度25 ℃、濕度95%的恒溫恒濕培養(yǎng)室中，7 d后分別單獨(dú)噴施含量為20、40、60、80、100、150、200 μL/mL的大蒜素溶液，以及質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500、800、1 000 μg/mL的多菌靈和甲基托布津溶液，以噴施蒸餾水為對照，每處理重復(fù)3次。待對照充分發(fā)病后，調(diào)查各處理每株的全部葉片，連續(xù)調(diào)查5 d(5次)，采用分級計(jì)數(shù)法[20]計(jì)算防治效果。病情指數(shù)=(各級病葉數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值)×100；防治效果=(對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對照區(qū)病情指數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

調(diào)查所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，柱狀圖由Origin 8.0和Excel 2007繪制，半最大效應(yīng)濃度(EC50)由GraPhpad Software計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 抽提母液中的大蒜素含量

采用定硫法對大蒜素進(jìn)行定量測定，在測定過程中對氧化劑濃硝酸的添加量、溶液酸堿度進(jìn)行摸索。由圖1a可知，大蒜素含量隨著濃硝酸用量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)?shù)渭?～6 mL濃硝酸時，所測得的大蒜素含量處于較高水平，且在滴加4 mL濃硝酸時，大蒜素含量最高，為0.52%。由圖1b可知，溶液的pH值變化也對大蒜素的測定結(jié)果影響較大，最佳溶液pH值為2.0；當(dāng)pH值大于3.0時，由于溶液的酸度減小，致使弱堿性陽離子發(fā)生水解，從而導(dǎo)致測定結(jié)果降低。因此，本試驗(yàn)采用滴加4 mL濃硝酸，在溶液pH值為2.0的條件下進(jìn)行大蒜素含量的測定，測得抽提母液中的大蒜素含量為0.52%。

圖1 氧化劑用量和溶液pH值對大蒜素測定結(jié)果的影響

2.2 大蒜素對葉霉菌不同生理小種菌絲生長的抑制作用

由表1可知，隨著不同處理大蒜素劑量的提高，大蒜素對葉霉菌4個生理小種的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)大蒜素劑量低于25 μL/mL(130 μg/mL)時，其對4個葉霉菌生理小種的抑制效果相對較差，抑制率低于75%；當(dāng)大蒜素劑量為30 μL/mL(156 μg/mL)時，其對4個葉霉菌生理小種的平均抑制率為90%左右；當(dāng)劑量達(dá)到35 μL/mL(182 μg/mL)時，抑制率大于95%，并與其他低劑量處理間存在顯著差異，但與40 μL/mL(208 μg/mL)處理差異不顯著，抑菌效果明顯。由大蒜素對不同葉霉菌菌絲生長的抑制率可知，在大蒜素劑量一定時，其對4個葉霉菌生理小種的抑制率存在一定的差異性，且這種差異性在大蒜素劑量低于20 μL/mL(104 μg/mL)時表現(xiàn)更明顯，而在高劑量時大蒜素對不同葉霉菌的抑制效果表現(xiàn)較高的一致性?？傮w來看，大蒜素對葉霉菌生理小種1.2.3.4抑制率最高，對其他3個生理小種的抑制率差異不顯著，說明葉霉菌生理小種1.2.3.4的生理活性以及抗藥性低于其他3個生理小種，從而也間接證實(shí)生理小種1.2.3.4.9、2.4.5、2.5可能是致病性更強(qiáng)的生理小種。

表1 大蒜素對葉霉菌不同生理小種菌絲生長的抑制效應(yīng)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表3同。

2.3 大蒜素對葉霉菌不同生理小種孢子萌發(fā)的抑制作用

利用不同劑量的大蒜素對葉霉菌4個生理小種的分生孢子進(jìn)行萌發(fā)抑制試驗(yàn)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率和大蒜素抑菌的EC50，結(jié)果見表2。從表2可以看出，4個生理小種的孢子萌發(fā)抑制率均隨大蒜素劑量的增加而增大。在各處理劑量下，大蒜素對生理小種1.2.3.4.9的孢子萌發(fā)抑制率最低，對生理小種1.2.3.4的孢子萌發(fā)抑制率最高，其對4個葉霉菌生理小種的孢子萌發(fā)抑制率呈現(xiàn)出與表1結(jié)果一致的趨勢。由EC50值可知，大蒜素對葉霉菌生理小種1.2.3.4.9的EC50最大，其后依次是2.4.5、2.5、1.2.3.4；生理小種2.4.5與2.5彼此間并無顯著性差異，而生理小種1.2.3.4.9與1.2.3.4之間存在顯著性差異，并分別與2.4.5、2.5存在顯著性差異。

表2 大蒜素對葉霉菌不同生理小種孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表4同。

2.4 大蒜素對番茄離體葉片上葉霉病的預(yù)防效果

將4個葉霉菌生理小種菌餅接種于不同大蒜素劑量處理的Money maker葉片上3 d后，觀察大蒜素對番茄離體葉片上葉霉病的預(yù)防作用。由圖2可知，隨著浸透葉片的大蒜素劑量的增高，葉霉菌在離體葉片上的病斑直徑均表現(xiàn)出明顯減小的趨勢，且葉霉菌生理小種1.2.3.4.9的菌絲體長勢強(qiáng)于1.2.3.4、2.4.5、2.5。

圖2 大蒜素對番茄離體葉片上葉霉病的預(yù)防效果觀察

由表3可知，當(dāng)大蒜素劑量為75 μL/mL(390 μg/mL)時，其預(yù)防效果分別為83.62%(1.2.3.4)、72.25%(1.2.3.4.9)、77.18%(2.4.5)、73.81%(2.5)，與對照具有顯著差異；當(dāng)大蒜素劑量為100 μL/mL

表3 大蒜素對番茄離體葉片上葉霉病的預(yù)防效果 %

(520 μg/mL)時，其對生理小種1.2.3.4、2.4.5、2.5的預(yù)防效果均達(dá)到90%以上，對1.2.3.4.9的預(yù)防效果為87.92%；當(dāng)大蒜素劑量為125 μL/mL(650 μg/mL)時，其對4種葉霉菌生理小種的預(yù)防效果均超過95%。由此可見，低劑量的大蒜素處理番茄葉片后，對葉霉菌不同生理小種的預(yù)防效果存在差異性，而高劑量(≥100 μL/mL或520 μg/mL)的大蒜素處理后，對不同葉霉菌生理小種均起到較好的預(yù)防效果。

2.5 大蒜素對葉霉菌的苗期藥效試驗(yàn)結(jié)果

對不同劑量梯度的大蒜素、多菌靈、甲基托布津分別進(jìn)行葉霉菌藥效試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，在近相等劑量下，大蒜素對葉霉病的防治效果高于多菌靈和甲基托布津；低劑量(<300 μg/mL)的藥劑處理對葉霉病的防治效果不理想，但在劑量達(dá)到1 000 μg/mL后，三者對葉霉病的防治效果均超過95%。多菌靈與甲基托布津的EC50值相等，說明二者對葉霉病的防治效果相當(dāng)。對3種藥劑效果進(jìn)行方差分析可知，在95%的置信度下，多菌靈與甲基托布津?qū)θ~霉病的防治效果沒有顯著差異，但兩者均顯著低于大蒜素的防治效果，說明大蒜素是一種可以替代化學(xué)藥劑防治葉霉病的有效抑菌物質(zhì)。

表4 大蒜素、多菌靈、甲基托布津?qū)θ~霉菌的苗期藥效試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近幾年，番茄葉霉病對番茄的安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害，其生理小種分化強(qiáng)烈，目前番茄葉霉菌主流生理小種為1.2.3.4，生產(chǎn)上主要應(yīng)用含葉霉菌抗性基因Cf-5、Cf-9的番茄品種來抵御該生理小種的侵染。但2014年本課題組首次在國內(nèi)分離到番茄葉霉菌生理小種2.5、2.4.5和1.2.3.4.9，這3個生理小種能夠攻克抗病基因Cf-5、Cf-9。如何有效地防治這3個葉霉菌生理小種成為急需解決的難題。目前大蒜素在蔬菜作物病害防治方面的作用已受到重視。研究表明，大蒜素能夠抑制番茄早疫病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，并對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌造成的田間病害起到防治作用[21]。因此，利用大蒜素這種安全無污染的抑菌物質(zhì)防治葉霉菌成為本研究主要探討的問題。

大蒜素(C6H10S2O)微溶于水，卻極易溶于乙醚，它是蒜氨酸酶酶解蒜氨酸的產(chǎn)物，常溫下極不穩(wěn)定，易降解為阿霍烯、烯丙基次磺酸等硫氧化物。目前多采用有機(jī)溶劑萃取法提取大蒜素。宋衛(wèi)國等[22]、尹曉東等[20]、劉瑩[16]通過對乙醇、乙酸乙酯、乙醚等萃取劑的比較分析發(fā)現(xiàn)，乙醚能夠最大量地萃取蒜泥中的大蒜素。與GC-MS、HPLC方法測定大蒜素含量相比，定硫法因其靈敏、簡單、快捷也被廣泛應(yīng)用，但由于測定過程中氧化劑以及溶液酸度的不同，極易使測定結(jié)果產(chǎn)生較大差異[23]。本試驗(yàn)采用定硫法對大蒜素進(jìn)行定量測定，通過對氧化劑用量、溶液酸堿度進(jìn)行摸索，優(yōu)化出定硫法測定大蒜素含量的最適條件，即在溶液中滴加4 mL濃硝酸、溶液pH值為2.0的條件下能夠更為準(zhǔn)確地測得其含量，試驗(yàn)測得抽提母液的大蒜素含量為0.52%。

通過測定大蒜素對葉霉菌生理小種1.2.3.4、1.2.3.4.9、2.4.5、2.5菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制效果，本研究首次報道了大蒜素對葉霉菌不同生理小種具有抑制作用，明確了大蒜素對4個葉霉菌生理小種抑制率的差異性，表現(xiàn)為1.2.3.4>2.5>2.4.5>1.2.3.4.9，說明葉霉菌生理小種1.2.3.4.9的生理活性以及抗藥性強(qiáng)于其他3個生理小種，不同葉霉菌生理小種間表現(xiàn)出的這種差異性可能與其所含有的無毒基因的差異性有關(guān)[24]。低劑量的大蒜素處理離體番茄葉片，對葉霉菌不同生理小種的預(yù)防效果具有差異性，這可能是由于不同生理小種對大蒜素劑量的忍耐范圍不同引起的；而高劑量的大蒜素處理離體番茄葉片，對葉霉菌的預(yù)防效果表現(xiàn)基本一致，這與尉婷婷等[19]、程智慧等[6]對大蒜素抑菌作用研究的結(jié)果相同。苗期藥效試驗(yàn)表明，多菌靈、甲基托布津?qū)θ~霉病的防治效果均低于大蒜素，說明大蒜素是一種可以替代化學(xué)藥劑防治葉霉病的有效抑菌物質(zhì)，本研究為開發(fā)高效、安全的植物源農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)，也為番茄無公害安全生產(chǎn)提供了保障。

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Inhibition of Allicin on Different Races of Tomato Leaf Mold

XUE Dongqi1,XU Xiangyang1,JIANG Jingbin1,WANG Doudou2,LI Jingfu1*

(1.College of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This experiment studied the inhibition effect of allicin on the leaf mold mainstream physiological race in tomato production(1.2.3.4),and the newly discovered physiological races in 2014(2.5,2.4.5 and 1.2.3.4.9),to lay a foundation for the development of safe,effective botanical pesticides.At first,allicin extract was prepared and the allicin content was quantitatively determinated using sulphur test method.The result showed that when 4 mL of concentrated nitric acid was dropped and pH was 2.0,the content of allicin could be measured more accurately.In this study the allicin content was 0.52%.Based on this,we studied the inhibition effect on mycelial growth and spore germination,preventive effect on isolate leaves and control efficacy at seedling stage of allicin with the four races as control targets.The results showed that when the concentration of allicin was more than 25 μL/mL,its inhibition effect on mycelial growth was higher.The highest mycelium inhibition rate was determined on race 1.2.3.4,the lowest mycelium inhibition rate was on race 1.2.3.4.9,and the inhibition rate between the other two physiological races had no significant difference.When the allicin concentration was less than 7.5 μL/mL,its inhibition effects on spore germination showed difference among the four races,with the highest spore germination inhibition rate on race 1.2.3.4,and the lowest spore germination inhibition rate on race 1.2.3.4.9.When the concentration of allicin was 125 μL/mL,the preventive effects on the four races on isolate lea-ves were all more than 95%.Seedling efficacy trials showed that under the condition of equal concentration,the control efficacy of allicin was better than carbendazim and thiophanate-methyl on tomato leaf mold,indicating that allicin is an effective antimicrobial substance,and it can substitute for chemicals to control tomato leaf mold.

tomato leaf mold; race; allicin; inhibitory rate; control effect; antimicrobial substance; plant-derived pesticides

2015-07-08

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD02B02-7)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NSFC 31272171)

薛東齊(1987-)，男，河南開封人，在讀博士研究生，研究方向：番茄遺傳育種。 E-mail:xuedongqi2009@hotmail.com

*通訊作者：李景富(1943-)，男，黑龍江綏化人，教授，主要從事番茄遺傳育種研究。E-mail:lijf_2005@126.com

S436.412.1

A

1004-3268(2016)02-0071-06