劉書偉，王 燕，胡勁召

(1.瓊州學院 熱帶生物與農學院，海南 三亞 572022； 2.瓊州學院 熱帶生態(tài)環(huán)境保護學院，海南 三亞 572022)

檳榔鮮果對小鼠體質量、生精細胞凋亡及臟器系數(shù)的影響

劉書偉1，王 燕2*，胡勁召2

(1.瓊州學院 熱帶生物與農學院，海南 三亞 572022； 2.瓊州學院 熱帶生態(tài)環(huán)境保護學院，海南 三亞 572022)

為探索檳榔鮮果的毒性作用，將檳榔鮮果果皮、果仁和全檳榔的水提液及生理鹽水(對照)對KM小鼠每天進行1次灌胃處理，連續(xù)13 d，測定小鼠的體質量、存活率、生精細胞凋亡指數(shù)、Bcl-2與Bax蛋白表達量及臟器系數(shù)。結果表明，果仁處理和全檳榔處理的小鼠體質量隨著處理天數(shù)的增加呈下降趨勢，果皮處理無明顯影響；對照和果皮處理的小鼠存活率均為100%，全檳榔和果仁處理分別為55.56%和0；果仁和全檳榔處理的生精細胞凋亡指數(shù)分別為1.61%和0.96%，均極顯著高于果皮處理和對照；果仁處理的Bax蛋白的表達水平明顯增強,Bcl-2蛋白的表達水平明顯下降?？梢?，檳榔鮮果水提液對小鼠所產生的毒性效應主要來源于果仁，果皮對小鼠無明顯影響，全檳榔處理介于二者之間。

檳榔鮮果； 毒性； 小鼠； 細胞凋亡； 體質量； 臟器系數(shù)

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科(Palmaceae)檳榔屬(Areca)的熱帶常綠喬木，也是一種藥食同源植物[1]，檳榔果實位居我國四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟)之首，《得配本草》中記載：檳榔可“治瀉痢，破滯氣，攻堅積，止諸痛，消痰癖，殺三蟲，除水脹，療瘴瘧”[2]。檳榔除用于嚼食外，也是傳統(tǒng)驅蟲藥，臨床上可添加于飼料中治療犬、豬和牛絳蟲等[3-6]，犬、豬和雞蛔蟲等[4,7-8]，還可治療鉤蟲、蟯蟲、血吸蟲病等[9-10]。檳榔具有理氣消積之功，可治療牲畜的食積氣滯、腹痛脹滿便秘等[11-15]。此外，檳榔還有抑菌、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化等多種功能。但2003年國際癌癥研究中心(IARC)正式認定檳榔為一級致癌物[16]，檳榔使用的安全性受到質疑，國內外學者對檳榔的藥理、毒副作用機制及新產品開發(fā)等方面進行了一定研究，但研究大多集中在檳榔生物堿的藥理及毒性作用方面，對鮮果檳榔的原液提取物研究較少。為全面評價檳榔鮮果的毒性狀況，本研究通過分析檳榔鮮果不同部位的水提液對小鼠進行經口灌胃后其身體指標的變化狀況，初步探討檳榔鮮果水提液對小鼠的毒性作用，為檳榔在獸藥學領域的進一步開發(fā)、應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試動物

供試動物為SPF級KM小白鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，小鼠生產許可證號為SCXK(湘) 2013-0004。動物引入后，置于三亞市功能檳榔研究重點實驗室動物房養(yǎng)殖，喂養(yǎng)SPF級小鼠專用維持飼料，自由飲水采食，適應環(huán)境7 d，在小鼠適應的過程中，觀察小鼠的綜合狀況，選取表現(xiàn)正常和大小均勻一致的小鼠待用，體質量(40±1) g。室內溫度為(22±3)℃，相對濕度為60%～70%，光照為12 h/d。

1.2 檳榔材料及制備

檳榔果采摘于海南省三亞市吉陽區(qū)農民的檳榔種植園，莖部帶宿萼，剖開檳榔有未成熟瘦長形種子，其外形橢圓、勻稱，橫向直徑3～4 cm，光澤較好、顏色純正，縱向直徑5～6 cm。采摘后用保鮮膜包裹，及時運到實驗室冷藏待用。

挑選均勻一致的檳榔鮮果清洗干凈后晾干，取部分檳榔沿中軸縱向切開，將果皮和果仁分開待用，并留適量完整檳榔做全檳榔處理，將果仁、果皮和全檳榔分別稱質量。將檳榔果皮切小塊并加等質量的蒸餾水，用研磨機粉碎研磨5 min，靜置水提待用，全檳榔采用同樣方法處理；檳榔果仁機械壓碎(不可用粉碎機粉碎，粉碎后呈糊狀，不易過濾)，然后加入等質量的蒸餾水靜置。全部水提4 h后用雙層紗布過濾，將濾液分別置于經消毒后的離心管中，以5 000 r/min離心10 min，然后采用0.22 μm除菌過濾膜過濾，濾液即為供試水提液，3種水提液分別為：全檳榔水提液、果仁水提液和果皮水提液。水提液現(xiàn)用現(xiàn)制，2 h內處理完畢。

1.3 試驗設計

按照食品毒理學實驗室操作規(guī)范(GB 15193—2014)進行試驗，選取36只健康小白鼠，隨機分為4個處理，即全檳榔處理、果仁處理、果皮處理和生理鹽水處理(對照，CK)。小鼠禁食8 h后稱其體質量，按體質量大小灌胃給藥，灌胃劑量為15 mL/kg，給藥后禁食1 h，自由采食和飲水，連續(xù)灌胃13 d。為防止小鼠相互傷害，小鼠均為單籠飼養(yǎng)。

1.4 測定指標

1.4.1 體質量 試驗期間，每天測量小鼠灌胃前體質量，觀察記錄存活狀況。

1.4.2 生精細胞凋亡檢測 試驗期滿，麻醉脫頸椎處死小鼠，迅速摘取雄性雙側睪丸，采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測。在熒光顯微鏡下觀察小鼠睪丸組織切片，細胞核中有棕黃色顆粒且背景清晰者為陽性細胞，每張切片選取20個視野計數(shù)總的生精細胞凋亡數(shù)，并計算生精細胞凋亡指數(shù)。

1.4.3 免疫組織化學檢測睪丸組織Bax和Bcl-2蛋白的表達 檢測參照姜卓等[17]的方法。采用10%的中性甲醛固定小鼠睪丸組織，鉻明礬處理切片，石蠟包埋、切片、展片、烘片、脫蠟等處理后分別用武漢博士德生物工程有限公司的Bax、Bcl-2蛋白檢測試劑盒進行一系列操作，采用JD-801形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.4.4 臟器系數(shù) 測定小鼠肺臟、肝臟、脾臟、睪丸、心臟和腎臟的質量以及體質量，各臟器與體質量的比值即為各臟器的臟器系數(shù)。

1.5 數(shù)據處理

使用SPSS 19.0軟件進行差異性統(tǒng)計分析，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理對小鼠體質量和存活率的影響

從表1可看出，4個處理供試小鼠初始體質量差異不顯著；隨著灌胃天數(shù)的持續(xù)，全檳榔處理和果仁處理小鼠的體質量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，從第3天開始全檳榔處理與果仁處理達到顯著差異水平，與CK和果皮處理也均達到顯著差異水平；果皮處理和CK體質量均呈增加的趨勢，且兩者差異不顯著。不同處理小鼠存活狀況不同，果仁處理小鼠死亡情況最為嚴重，在灌胃的第2天、第3天、第4天，小鼠分別死亡2只、4只、2只，第5天灌胃后2 h該處理小鼠全部死亡，其存活率為0；全檳榔處理在灌胃的第9天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至試驗期滿死亡4只，存活率為55.56%；CK和果皮處理小鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，即存活率均為100%。可見，果仁處理會急劇降低小鼠的體質量并可將其全部致死，全檳榔處理會導致小鼠體質量逐漸降低且出現(xiàn)部分死亡現(xiàn)象，果皮處理對小鼠體質量無不良影響且無小鼠死亡。

表1 不同處理對小鼠體質量的影響

注：同列數(shù)據不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表中空白表示該處理小鼠已全部死亡。

2.2 不同處理對小鼠睪丸曲細精管中生精細胞凋亡的影響

圖1顯示，與對照組相比，3個檳榔處理的小鼠生精細胞陽性表達細胞增多，其中果仁處理生精細胞凋亡指數(shù)最高且極顯著高于其他處理，是CK凋亡指數(shù)的12.38倍；全檳榔處理凋亡指數(shù)為0.96%，極顯著高于果皮處理和CK，是CK的7.38倍；果皮處理與CK差異不顯著，其凋亡指數(shù)僅高于CK 0.02個百分點。說明果仁和全檳榔處理特別是果仁處理對小鼠生殖器官損傷較大，為維持小鼠內環(huán)境的穩(wěn)定，生精細胞凋亡較多，這可能會使小鼠體內缺少精子；果皮處理對小鼠生殖器官損傷較小。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著圖1 不同處理對小鼠睪丸生精細胞凋亡指數(shù)的影響

2.3 不同處理對小鼠睪丸生精細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

研究表明，Bax蛋白和Bcl-2蛋白均參與了生精細胞凋亡的過程[18-19]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白在功能上相互對立，Bax蛋白促凋亡，Bcl-2蛋白抗凋亡， Bcl-2/Bax是決定細胞是否發(fā)生凋亡的重要指標。

由表2可看出，Bax蛋白和Bcl-2蛋白在各處理小鼠睪丸組織中均有不同程度的表達。果仁處理Bax蛋白表達陽性率最大且顯著高于全檳榔處理、極顯著高于果皮處理和CK；全檳榔處理Bax蛋白表達陽性率極顯著高于果皮處理和CK；果皮處理Bax蛋白表達陽性率略高于CK，二者差異不顯著。4個處理的Bcl-2蛋白表達陽性率也不同，其趨勢與Bax蛋白相反。果仁處理Bcl-2/Bax最小，顯著低于全檳榔處理，極顯著低于果皮處理和CK，全檳榔、果皮處理和CK的值分別是果仁處理1.76倍、2.49倍和2.78倍。綜上，在誘導小鼠睪丸細胞凋亡方面，果仁處理能顯著增強凋亡蛋白Bax的表達，極顯著地降低抗凋亡蛋白的表達，說明果仁處理具有較強的誘導細胞凋亡作用，全檳榔處理次之，果皮處理誘導作用不明顯。

表2 不同處理對小鼠睪丸組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達的影響

注：同列數(shù)據不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

2.4 不同處理對小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)又稱臟體比，正常動物各臟器與體質量的比值比較恒定，染毒后受損臟器的臟器系數(shù)發(fā)生變化，臟器系數(shù)增大說明臟器充血、水腫或增生肥大，臟器系數(shù)減小說明臟器萎縮或退行性改變。由表3可以看出，3個檳榔處理對小鼠肝臟、脾臟、睪丸和心臟影響不明顯，臟器系數(shù)與CK差異均不顯著；果皮處理對小鼠臟器系數(shù)影響最小，所有臟器系數(shù)與CK相比差異均不顯著；全檳榔處理和果仁處理對小鼠肺臟和腎臟影響較大，其臟器系數(shù)與CK和果皮處理差異均顯著，其中，果仁處理的臟器系數(shù)增加或減小的幅度最大。

表3 不同處理對小鼠臟器系數(shù)的影響

注：同列數(shù)據不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

3 結論與討論

本研究結果表明：(1)果仁和全檳榔處理特別是果仁處理對小鼠的體質量和存活率影響較大，果仁和全檳榔處理組小鼠體質量隨處理天數(shù)增加均呈降低的趨勢；在灌胃的第5天，果仁處理小鼠全部死亡，全檳榔處理在灌胃的第9天小鼠開始死亡，至試驗期滿死亡4只；而果皮處理和CK小鼠的體質量均呈增加的趨勢，且兩者差異不顯著，小鼠無死亡現(xiàn)象。說明較高劑量的果仁提取液毒性較大，導致小鼠死亡。(2)檳榔鮮果水提液可誘導小鼠生精細胞凋亡，其中檳榔果仁處理的小鼠睪丸曲細精管中的生精細胞凋亡指數(shù)最高，全檳榔處理次之，并與其他處理達到極顯著差異水平；果皮處理與CK差異不顯著。說明檳榔特別是檳榔果仁誘導小鼠生精細胞凋亡指數(shù)增高，使生精過程發(fā)生障礙，從而影響其生殖功能，其具體機制還有待進一步探討。(3)果仁和全檳榔處理對小鼠肺臟和腎臟影響較大，均使小鼠肺臟的臟器系數(shù)增加，使腎臟的臟器系數(shù)減小，與CK差異均顯著，其中果仁處理增加或減小的幅度更大，說明這2個處理使小鼠肺部充血或水腫，使小鼠腎臟發(fā)生萎縮或退行性改變。提示檳榔果仁和全檳榔可能對免疫器官和呼吸器官有一定影響。綜上所述，檳榔鮮果不同部位的水提液對小鼠毒害作用最嚴重的是檳榔果仁，其次為全檳榔(由果仁和果皮組成)，而果皮處理對小鼠的影響非常小?？梢?，檳榔毒性主要來源于果仁，果皮的毒性極微。

目前，普遍認為檳榔產生毒性作用的成分是檳榔生物堿，研究表明，生物堿大部分存在于檳榔種子中[20]，這與本研究結果一致。但其毒副作用機制并不清楚，因為檳榔含有多種生物堿，其生物學作用也較復雜。同時檳榔對雄性小鼠生精細胞、肺臟及腎臟的毒性作用應引起人們的注意，在臨床的應用中，若使用檳榔制品添加于飼料中，應進一步研究其效果、最佳有效劑量及毒性等。本次試驗研究得到的結果，僅提示在本試驗條件下檳榔提取液對受試動物有一定的影響，至于其劑量-反應關系、作用機制均有待進一步探討。

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Effects of Fresh Betelnut on Spermatogenic Cell Apoptosis,Viscera Coefficients and Body Weight of Mice

LIU Shuwei1,WANG Yan2*,HU Jinzhao2

(1.College of Tropical Biology and Agronomy,Qiongzhou University,Sanya 572022,China;2.College of Tropical Ecological Environmental Protection,Qiongzhou University,Sanya 572022,China)

To research the toxic effects of fresh betelnut,the mice were intragastricly administered with water extract solution from betelnut,peels and seeds of fresh betelnut once a day and observed for 13 d.Body weight,survival rate,spermatogenic cell index,Bcl-2,Bax and viscera coefficients of mice were measured.The results showed that the mice’s body weight of betelnut and seeds treatments decreased with the increase of days,and the treatment of peels had no bad effect on the mice.The survival rate of control(saline water) and peels treatments were 100%,betelnut and seeds treatments were 55.56% and 0.Spermatogenic cell apoptosis index of betelnut and seeds treatments were 0.96% and 1.61%,and had very significant difference with other treatments.The expression level of Bax protein of the seeds treatment was up regulated,but Bcl-2 protein was down regulated significantly.Therefore,toxic effects in mice mainly came from betelnut’seeds while peels almost had no effects,and the toxic effect of betelnut was between peels and betelnut’s seeds.

fresh betelnut; toxicity; mice; cell apoptosis; body weight; viscera coefficients

2015-07-01

海南省中藥現(xiàn)代化專項項目(ZY201417)；三亞市功能檳榔研究重點實驗室項目(L1411)；三亞市農業(yè)科技創(chuàng)新項目(2014NK28)；三亞市院地科技合作項目(2014YD16,2015YD29)

劉書偉(1978-)，男，河南平輿人，副教授，碩士，主要從事南藥毒理、農產品加工研究及教學工作。 E-mail:hnlsw@163.com

*通訊作者：王 燕(1979-)，女，河南太康人，副教授，碩士，主要從事檳榔加工研究及相關教學工作。 E-mail:wysw119@163.com

時間：2016-02-02 17:36:14

S859.3

A

1004-3268(2016)02-0142-05

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20160202.1736.001.html