張 勇，趙興緒(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

陜西省規(guī)模豬場副豬嗜血桿菌的分離鑒定及敏感藥物篩選

張 勇，趙興緒*
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

為了解陜西省部分規(guī)模豬場副豬嗜血桿菌株的血清型及耐藥特性，以指導(dǎo)臨床用藥，防控副豬嗜血桿菌病，對(duì)陜西省3個(gè)規(guī)?；i場共60頭表現(xiàn)副豬嗜血桿菌癥狀的病豬進(jìn)行病理剖檢，采集肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離到42株副豬嗜血桿菌，其中血清1型1株(2.38%)，4型8株(19.05%)，5型15株(35.71%)，12型3株(7.14%)，13型11株(26.19%)，其他型1株(2.38%)，未定型的有3株(7.14%)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)阿奇霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感，對(duì)左旋氧氟沙星、替米考星、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感，對(duì)頭孢噻呋鈉、鏈霉素、紅霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素不敏感。

副豬嗜血桿菌； 分離； 鑒定； 藥敏試驗(yàn)； 陜西省

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps) 病是由巴氏桿菌科的一種革蘭氏陰性多型性小桿菌引起豬的多發(fā)生性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及高死亡率為特征的一種傳染性疾病[1-4]。Hps主要危害2～25周齡的仔豬和生長豬，特別是對(duì)5～8周齡的斷奶仔豬危害最大，發(fā)病率為15%～90%，病死率高達(dá)50%～90%，臨床上以咳嗽、呼吸困難、跛行、被毛雜亂、母豬流產(chǎn)為特征[5-8]。近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，Hps病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，并且已成為影響仔豬生長最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一，成為世界性流行的疾病，危害性非常嚴(yán)重。Oliveira等[9]對(duì)該病進(jìn)行大量研究發(fā)現(xiàn)，該病的血清型比較復(fù)雜，至少有15個(gè)血清型，另外還有20%以上的分離株無法確定。研究發(fā)現(xiàn)，在美國、德國、日本、西班牙、加拿大等國家流行的Hps血清型主要是4、5、13型[10-11]。蔡旭旺等[12]研究表明，我國當(dāng)前流行的Hps血清型主要有4、5、12、13型。目前，Hps病的流行較為普遍，不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型均有所不同，毒力也存在一定差異，流行的致病菌株與疫苗株不同，豬群中每頭豬也至少存在1種菌株或血清型，并且缺乏交叉保護(hù)。此外，副豬嗜血桿菌病多采用藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，導(dǎo)致該菌的藥物敏感性多變，并發(fā)時(shí)間和地域不同，該菌的耐藥性也存在一定差異。因此，對(duì)Hps病的防控難度越來越大。為此，本試驗(yàn)對(duì)陜西省規(guī)模豬場采集臨床疑似感染Hps的病料進(jìn)行分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，以期指導(dǎo)臨床用藥，旨在為該地區(qū)Hps病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 2014年11—12月，對(duì)陜西省3家規(guī)模豬場共60頭35日齡疑似患Hps病的病豬進(jìn)行無菌采集病料。病料主要為肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、心包積液、關(guān)節(jié)液等。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 革蘭氏染色和HE染色試劑、NAD均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片等均購自杭州天和生物試劑有限公司，胰大豆瓊脂(TSA和TSB)培養(yǎng)基購自美國BD公司，PCR緩沖液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，犢牛血清購自杭州四季生物有限公司(使用前經(jīng)56 ℃滅活30 min)，金黃色葡萄球菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基(含1%NAD)及麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基等按照常規(guī)方法進(jìn)行制備。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 從疑似病豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、心包積液、關(guān)節(jié)液等病料中無菌取樣，將采集到的病料用酒精棉球點(diǎn)火迅速擦拭表面進(jìn)行消毒滅菌，然后用消毒的剪刀、鑷子取病變深層組織，接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2 染色鏡檢 將從病料中分離出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將鏡檢結(jié)果疑似為Hps的菌落劃線于添加50 mL小牛血清和0.1% NAD的TSA平板上，培養(yǎng)36 h后進(jìn)行下一步鑒定。

1.2.3 衛(wèi)星試驗(yàn) 將分離的疑似菌純化后，劃線接種至鮮血瓊脂平板上，然后垂直接種金黃色葡萄球菌，置培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h，然后觀察其是否具有衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.4 微量生化反應(yīng) 首先將分離的疑似菌株分別接種于添加有10 μL NAD的葡萄糖、蔗糖、脲酶、乳糖、麥芽糖、β-半乳糖、木糖、核糖等的生化培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，以觀察其生化反應(yīng)情況。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片法測定分離菌株對(duì)頭孢噻呋鈉、阿奇霉素、替米考星、慶大霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、磺胺甲氧嘧啶、氟苯尼考、洛美沙星、左旋氧氟沙星、諾氟沙星、林可霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、鏈霉素15種藥物的耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離純化結(jié)果

從疑似病料中分離出42株疑似Hps株，培養(yǎng)后可見針尖大小、圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊無色透明或灰白色半透明的菌落。革蘭氏染色后，可見革蘭氏陰性短小桿菌，無芽孢，細(xì)菌為明顯的多形性，個(gè)別為兩極濃染的球桿菌或長而彎曲的絲狀菌。在鮮血瓊脂平板上則可見到表皮葡萄球菌劃線兩側(cè)均有灰白色、透明的不溶血菌落，而且越遠(yuǎn)離葡萄球菌菌苔的菌落越小，符合Hps培養(yǎng)的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

2.2 Hps生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的42株Hps生化特性完全相同，即果糖、蔗糖、葡萄糖、觸酶、麥芽糖、β-半乳糖、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)均呈陽性，而酯酶、尿素酶、吲哚、硫化氫、堿性磷酸酶、脯氨酸芳胺酶、苯丙氨酸反應(yīng)均呈陰性(表1)。

2.3 Hps血清學(xué)鑒定

對(duì)分離的42株Hps進(jìn)行血清分型(表2)發(fā)現(xiàn)，中血清1型1株(2.38%)，4型8株(19.05%)，5型15株(35.71%)，12型3株(7.14%)，13型11株(26.19%)，其他型占1株(2.38%)，未定型的有3株(7.14%)。

表1 Hps的生化反應(yīng)結(jié)果

項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果果糖+硫化氫-蔗糖+麥芽糖+葡萄糖+酯酶-尿素酶-β-半乳糖+吲哚-堿性磷酸酶-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶+脯氨酸芳胺酶-觸酶+苯丙氨酸-

注：-為陰性；+為陽性。

表2 Hps的血清分型結(jié)果

血清型分離株數(shù)占總分離菌株數(shù)比例/%1型12．384型819．055型1535．7112型37．1413型1126．19其他型12．38未定型37．14共計(jì)42

2.4 Hps的藥物敏感試驗(yàn)

由表3可知，分離到的42株Hps存在不同程度的耐藥性，其中對(duì)阿奇霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感；對(duì)左旋氧氟沙星、替米考星、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感；對(duì)頭孢噻呋鈉、鏈霉素、紅霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素不敏感。

表3 Hps的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥名抑菌圈直徑/mm敏感程度左旋氧氟沙星23中度敏感復(fù)方新諾明33高度敏感林可霉素15不敏感紅霉素16不敏感洛美沙星31高度敏感頭孢噻呋鈉15不敏感替米考星24中度敏感環(huán)丙沙星17不敏感諾氧沙星25中度敏感強(qiáng)力霉素14不敏感磺胺甲嘧啶23中度敏感氟苯尼考32高度敏感鏈霉素15不敏感慶大霉素22中度敏感阿奇霉素32高度敏感

3 結(jié)論與討論

Hps是廣泛存在于豬呼吸道的一種常在菌，當(dāng)受到斷奶、運(yùn)輸、環(huán)境衛(wèi)生差等應(yīng)激因素影響時(shí)會(huì)引起發(fā)病，同時(shí)還伴隨著其他細(xì)菌性和病毒性疾病的發(fā)生。尹秀鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豬群在暴發(fā)藍(lán)耳病期間也可引起豬發(fā)生Hps病；米丁丹等[14]研究表明，圓環(huán)病毒2型普遍存在于豬場，Hps感染由于常繼發(fā)豬圓環(huán)病毒2型感染，從而導(dǎo)致千萬保育仔豬的死亡率不斷增高，危害性非常嚴(yán)重。近年來，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，Hps病的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，甚至不同地區(qū)流行的血清型也有一定差異，目前已經(jīng)引起了科研人員的高度重視。本試驗(yàn)分離出的菌株形態(tài)、鏡檢特征、生化特性及衛(wèi)星現(xiàn)象等均符合Hps的生物學(xué)特性，可見分離菌株為Hps，表明該病在陜西地區(qū)呈一定的流行性。

國外學(xué)者對(duì)Hps進(jìn)行了大量研究發(fā)現(xiàn)，Hps的血清型比較復(fù)雜，按擴(kuò)散血清分型方法來進(jìn)行區(qū)分，至少可以將Hps分為15個(gè)血清型，另有20%以上的分離菌株無法定型，Cai 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，美國、加拿大、英國、德國、西班牙等歐美發(fā)達(dá)國家Hps流行的血清型，主要以4型、5型和13型為主；蔡旭旺[15]研究指出，我國的Hps的血清型流行規(guī)律與歐美國家基本相似，但是由于Hps血清型較多，各型間抗原交叉保護(hù)力又比較低，不同地區(qū)流行的血清型可能不同，甚至一個(gè)豬場就存在幾種血清型的情況，這給免疫帶來一定困難。因此，在血清未分型的條件下應(yīng)用地方分離株制備的滅活疫苗是較好的預(yù)防措施。同時(shí)，要及時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，可篩選出高度敏感的藥物進(jìn)行治療，本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)阿奇霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感；對(duì)左旋氧氟沙星、替米考星、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感；對(duì)頭孢噻呋鈉、鏈霉素、紅霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素不敏感。

以上結(jié)果與李富祥等[16]調(diào)查結(jié)果有一定差異，特別是本研究中對(duì)抗菌較好的頭孢噻呋鈉不敏感。這可能是菌株對(duì)同一種抗生素的敏感性存在一定差異及豬場是否合理用藥有關(guān)。劉俊偉等[17]指出，若養(yǎng)豬場經(jīng)常使用某種抗生素藥物對(duì)母豬進(jìn)行定期群體預(yù)防性混飼給藥，從而導(dǎo)致其攜帶的耐藥細(xì)菌通過哺乳傳給仔豬，使豬群耐藥性更嚴(yán)重。因此，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中，臨床治療時(shí)應(yīng)盡量避免盲目用藥，特別是群體治療時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以篩選出最敏感的藥物，在發(fā)病早期及時(shí)進(jìn)行防治，以達(dá)到科學(xué)的防治效果。

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Isolation,Identification and Medicine Sensitivity Test ofHaemophilusparasuisin Scale Pig Farm

ZHANG Yong，ZHAO Xingxu*
(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

In order to investigate the serotype and drug resistance ofHaemophilusparasuisin some large scale pig farms in Shaanxi province,as well as to provide basis for prevention and control measures,this test carried out a pathological examination of 60 sick pigs from three large scale farms.The bacteria isolated from liver,lung,lymph node and joint fluid were collected and cultivated for further drug resistance test.The results showed that 42 strains wereisolated,and among them one strain belonged to type 1(2.38%),eight strains belonged to type 4(19.05%),fifteen strains belonged to type 5(35.71%),three strains belonged to type 12(7.14%),thirteen strains belonged to type 11(26.19%),one strain belonged to other type(2.38%) and three strains belonged to uncertain type(7.14%).Susceptibility test results showed that the isolated strains were highly sensitive to azithromycin,sulfamethoxazole,triimethoprim florfenicol and lomefloxacin,moderatelly sensitive to levofloxacin,tilmicosin,gentamicin,norfloxacin and sulfamonomethoxine,insensitive to ceftiofur sodium,streptomycin,erythromycin, lincomycin,ciprofloxacin and doxycycline.

Haemophilusparasuis； isolation； identification； medicine sensitivity test; Shaanxi province

2015-10-24

張 勇(1981-)，男，陜西安康人，獸醫(yī)師,博士，主要從事動(dòng)物疾病預(yù)防控制方面工作。 E-mail:ylsfzxzhangyong@163.com

*通訊作者：趙興緒(1962-)，男，甘肅漳縣人，教授，博士，主要從事動(dòng)物生殖生理學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究。

S855.1

A

1004-3268(2016)04-0126-04