劉 芳，張 沖,，王寅彪，趙 樸，鄧瑞廣，李學伍*(.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 47003； .河南省農業(yè)科學院/河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 45000)

豬偽狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表達

劉 芳1，張 沖1,2，王寅彪2，趙 樸2，鄧瑞廣2，李學伍2*
(1.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003； 2.河南省農業(yè)科學院/河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

依據GenBank中豬偽狂犬病毒(PRV) BJ/YT株gD基因設計引物，擴增gD蛋白抗原表位，其設計擴增長度為702 bp，將擴增片段克隆到pMD19-T載體獲得pMD19-T-gD。 利用BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶雙酶切pMD19-T-gD質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切片段，將回收片段與原核表達載體pET-28a連接，成功構建了pET-28a-gD表達載體。將表達載體轉化感受態(tài)細胞Rosetta，IPTG誘導表達后，進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，在25 ku處出現(xiàn)特異性蛋白質條帶。Western blot分析結果表明，表達產物能夠被PRV的陽性血清識別。綜上，成功克隆并表達了gD蛋白抗原表位，且其表達產物具有較好的生物學活性。

豬偽狂犬病病毒;gD基因； 抗原表位; 蛋白質表達

豬偽狂犬病(PR)是嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病之一[1-3]。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖功能障礙和新生仔豬的體溫升高、腦脊髓炎及神經癥狀?；疾∽胸i的死亡率較高，有時甚至高達100%[4-7]。成年豬感染后多能耐過，無明顯臨床癥狀，但終生帶毒且成為最危險的潛在傳染源。豬群一旦感染豬偽狂犬病毒(PRV)將很難根除。因此，偽狂犬病被列為生豬產業(yè)的第三大疫病[8]。

PRV屬于孢疹病毒科，豬孢疹病毒屬，可在多種組織細胞如扁桃體、鼻黏膜、局部淋巴結和肺臟等組織中增殖[9]。PRV是線性雙股DNA病毒，基因組全長約150 kb，由長獨特區(qū)(UL)、短獨特區(qū)(US)及位于US兩端的末端重復序列(TR)和內部重復序列(IR)組成[10]，基因組中平均GC含量高達74%且結構復雜。目前已發(fā)現(xiàn)11種PRV糖蛋白[11]，其中gD糖蛋白是成熟的PRV粒子囊膜表面的主要生物學活性糖蛋白，也是PRV增殖所必需的糖蛋白,在病毒粒子與宿主細胞間的不可逆吸附過程中發(fā)揮著重要的作用[12]?，F(xiàn)已有多個PRV毒株的gD序列在GenBank登錄，其全長約為1 250 bp，GC含量為74.5%，能夠編碼約400個氨基酸的糖蛋白[13]。鑒于PRV gD蛋白的重要性，本研究表達了gD抗原表位，并測定了其生物學活性，旨在為豬偽狂犬病疫苗免疫效果檢測方法的建立奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根生物(北京)有限公司，pMD19-T 克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。表達載體pET-28a、Rosetta感受態(tài)細胞、PRV陽性血清及陰性血清、羊抗豬IgG、His單抗等均由河南省動物免疫學重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，LATaqDNA聚合酶，ExTap預混酶，限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ,dNTP及2×GC Buffer等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PRV 基因組DNA的制備 PK-15 細胞形成單層后，棄去生長液，接種 PRV病毒液200 μL，吸附2 h后加維持液，當70%細胞出現(xiàn)病變和脫落時，收集所有細胞培養(yǎng)物。取500 μL細胞培養(yǎng)物，加入94 μL 10%(m/V)SDS、6 μL蛋白酶K，顛倒混勻，55 ℃水浴加熱30 min；再加入等體積酚-氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，再加入等體積氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清加入2倍體積冷乙醇顛倒混勻，-20 ℃靜置10～20 min，12 000 r/min離心10 min；棄去上清，沉淀用70%酒精洗滌1次，置超凈臺揮發(fā)干凈；用25 μL含RNase (20 μg/mL) 的滅菌去離子水溶解，立即使用或置-20 ℃保存。

1.2.2 PRV基因組DNA的鑒定 根據文獻[14]的方法，在gD基因保守序列區(qū)域設計合成1對引物，用于鑒定偽狂犬病毒DNA，其引物序列如下為p1:5′-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′，p2:5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′，預期擴增片段的長度為217 bp。

以PRV病毒DNA作為模板，PCR反應體系為：ExTap預混酶10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為： 95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；取PCR產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結果。

1.2.3 gD蛋白抗原表位的擴增 依據GenBank中PRV 毒株(BJ/YT)gD蛋白的基因序列設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列為gD-1：5′-CCGGGATCCCCCCAGGTTCCCATACACTC-3′，gD-2：5′-CCCAAGCTTCTATTACGGCGTCAGGAATCGCATCAC-3′，預期擴增片段長度為702 bp。

以提取的PRV DNA為模板，用引物gD-1、gD-2進行PCR擴增。反應體系20 μL：LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 1 μL，模板DNA 1 μL，2×GC Buffer 10 μL，ddH2O 6.8 μL 。反應條件： 95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結果并進行回收。

1.2.4 gD蛋白抗原表位的克隆 將回收的DNA片段與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將10 μL連接產物加入DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，迅速置冰上1～2 min，隨后加入1 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL LB培養(yǎng)液懸浮細胞沉淀，涂布LB平板(含100 μg/mL Ampicillin、24 μg/mL IPTG、40 μg/mL X-gal)，37 ℃過夜培養(yǎng)至藍白菌落出現(xiàn)，挑取白色菌落進行PCR及雙酶切鑒定pMD19-T-gD質粒。

1.2.5 gD蛋白抗原表位表達載體的構建 利用BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切pMD19-T-gD質粒和pET-28a表達載體，用連接酶連接回收的目的片段和表達載體。將連接產物轉化Rosetta感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行PCR及雙酶切鑒定pET-28a-gD質粒，并對其進行序列測定。

1.2.6 gD蛋白抗原表位的誘導表達 挑取陽性菌落過夜培養(yǎng)后，取100 μL菌液接種于100 mL LB培養(yǎng)液中(含100 μg/mL Ampicillin)，37 ℃、230 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導表達8 h。收集1 mL菌液分裝于1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，沉淀用100 μL PBS緩沖液重懸，加入25 μL 5×SDS上樣Buffer，煮沸8 min。將未誘導的重組菌作為對照進行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 gD蛋白抗原表位表達產物SDS-PAGE電泳 配制15%的分離膠，取上述誘導表達菌液200～300 μL于1.5 mL eppendorf 管中，8 000 r/min離心1～2 min，棄去上清，用20 μL PBS緩沖液重懸，加入5 μL 5×Buffer(用前加熱)。放入浮漂中，煮沸8～10 min。12 000 r/min離心2 min，取上清上樣?？捡R斯藍染色，脫色后觀察。

1.2.8 gD蛋白抗原表位Western blot檢測 取硝酸纖維素膜(NC膜)，依據所切下蛋白質膠的大小，小心裁剪。將膜、蛋白質膠、濾紙分別用甲醇、轉膜緩沖液浸泡處理好之后按照濾紙、NC膜、SDS-PAGE膠、濾紙的順序放入電轉儀，15 V電轉1 h。取出樣品，SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍繼續(xù)染色，NC膜用5%的脫脂奶封閉過夜，依次加入一抗(His單抗、PRV陽性血清及陰性血清)、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體及羊抗豬IgG抗體)進行處理，并用AEC顯色方法進行顯色。

2 結果與分析

2.1 gD蛋白抗原表位的PCR擴增及克隆

以PRV病毒培養(yǎng)物的總DNA為模板，用引物p1、p2進行PCR擴增獲得與預期大小一致的特異性目的條帶,證明了模板DNA中PRV DNA的存在(圖1)，為目的序列的擴增奠定了基礎。

M.DNA Marker DL2000； 1.正常細胞DNA模板擴增產物； 2—4.病毒培養(yǎng)物DNA模板擴增產物圖1 PRV DNA模板PCR擴增

以上述鑒定正確的DNA為模板，利用引物gD-1、gD-2進行擴增獲得與預期大小一致的特異性目的條帶(圖2)，成功擴增了gD蛋白的抗原表位。回收擴增產物并將其克隆于pMD19-T載體，成功構建了pMD19T-gD重組質粒。

M.DNA Marker DL2000； 1.gD 抗原表位圖2 gD抗原表位擴增結果

2.2 pET-28a-gD表達載體鑒定

2.2.1 酶切鑒定結果 培養(yǎng)重組工程菌，提取制備pET-28a-gD重組質粒，經限制性內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見702 bp的目的條帶和5 900 bp的載體條帶，與預期片段的大小一致(圖3)。

M.DNA Marker DL2000； 1.pET-28a-gD 雙酶切產物圖3 pET-28a-gD 表達載體雙酶切鑒定

2.2.2 PCR鑒定結果 以pET-28a-gD表達載體質粒為模板，利用引物gD-1、gD-2進行PCR擴增， 擴增產物經瓊脂糖電泳，結果顯示擴增出了約702 bp大小的特異條帶，與預期片段的大小一致(圖4)。

以上結果表明，目的片段已插入表達載體。

M.DNA Marker DL2000； 1.pET-28a-gD PCR 擴增產物圖4 pET-28a-gD質粒PCR鑒定

2.3 gD蛋白抗原表位片段序列測定結果

對pET-28a-gD表達載體進行序列測定分析，結果顯示，所插入的目片段的序列完整，在表達載體的閱讀框內能夠獲得正確的閱讀，其編碼的氨基酸序列與天然gD抗原表位氨基酸序列一致。結果表明，成功的構建了pET-28a-gD表達載體。

2.4 gD蛋白抗原表位SDS-PAGE鑒定結果

重組陽性菌用IPTG于37 ℃誘導培養(yǎng)后，經SDS-PAGE電泳，結果顯示，誘導重組菌比未誘導重組菌多出1條蛋白質條帶，其分子質量約25 ku，與預期表達蛋白的大小一致(圖5)。

2.5 gD蛋白抗原表位Western blot分析結果

gD蛋白抗原表位經SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質條帶電轉移到NC膜上，并進行Wes-tern blot分析。結果顯示，在25 ku大小的位置呈現(xiàn)特異性反應條帶(圖6)。表明，表達產物能被偽狂犬陽性血清特異性識別，具有生物學活性。

M.廣譜彩虹預染蛋白Marker; 1.IPTG誘導菌； 2.IPTG未誘導菌圖5 gD蛋白抗原表位SDS-PAGE 電泳

M.預染蛋白質Marker； 1.His單抗(誘導)； 2.His單抗(未誘導)； 3.PRV 陽性血清(誘導)； 4.PRV 陽性血清(未誘導)；5.PRV 陰性血清(誘導)； 6.PRV 陰性血清(未誘導)圖6 gD蛋白抗原表位Western blot分析結果

3 結論與討論

PRV gD蛋白作為成熟病毒粒子囊膜表面主要糖蛋白，能誘導機體產生中和抗體，而這些抗體無論在有無補體存在的情況下，都具有中和PRV的能力[15]，在機體保護方面發(fā)揮主要作用。表達gD糖蛋白，利用表達蛋白建立ELISA檢測方法，檢測免疫豬血清中的對應抗體效價，是評價疫苗的免疫效果的有效方法之一[16]。

由于PRV病毒基因組的GC含量較高，使得目的片段的擴增難度增加，常用的ExTaq酶擴增方法往往無法得到目的片段，使用LATaq酶及GC Buffer方可有效擴增[17]。前人研究表明，gD蛋白存在一定數(shù)量的線性抗原表位[18-19]，這些抗原表位能夠被不同的單克隆抗體識別，具有較強的抗原反應原性。因此，體外表達抗原表位蛋白用于疫苗免疫效果的評價，是一種行之有效的方法。此外，該方法也可用于缺失疫苗免疫豬群的鑒別診斷。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)PRV蛋白的表達有一定的難度，構建的表達載體往往不能夠表達，其主要原因可能是PRV 蛋白與工程菌體的兼容性較小所致。因此，在研究PRV蛋白體外表達時最好采用真核表達系統(tǒng)。本研究采用原核表達系統(tǒng)成功表達了PRV gD抗原表位，為豬群PRV免疫效價的檢測奠定了基礎。

[1] 殷震,劉景華.動物病毒學[M].1版.北京:科學出版祉,1985:705.

[2] 樊振華,姚敬明,孟帆,等.山西部分種豬場豬偽狂犬病分子流行病學調研[J].山西農業(yè)科學,2012,40(9):989-992.

[3] 楊慶芳,寧官保,李俊達.豬偽狂犬病病毒的分離鑒定[J].山西農業(yè)科學,2011,39(8):886-889.

[4] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].3版.北京:中國農業(yè)出版社,2001:472.

[5] 余波,周思旋,譚詩文,等.豬偽狂犬病毒野毒株SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR診斷試劑盒的研制[J].河南農業(yè)科學,2014,43(6):128-131,144.

[6] 高曉云,顧陽,潘鑫龍,等.豬偽狂犬病病毒河南分離株gE全基因的克隆與序列分析[J].華北農學報,2015,3(1):137-141.

[7] 顧陽,高曉云,程琨,等.鑒別豬偽狂犬病病毒強毒與疫苗毒雙重PCR檢測方法的建立[J].華北農學報,2014,29(2):94-97.

[8] 李檸摘.偽狂犬病病毒[J].國外獸醫(yī)學——畜禽疾病,1995,16(3):29-32.

[9] 杜念興.獸醫(yī)免疫學[M].北京:中國農業(yè)出版社,1995.

[10] 殷震.動物病毒學[M].北京:科學出版社,1997:988-1009.

[11] 楊慶芳,寧關寶.豬偽狂犬病的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,7(9):15-18.

[12] 母安雄,谷根林,蔣建一,等.規(guī)模豬場主要疫病抗體水平監(jiān)測及免疫效果分析[J].畜牧與獸醫(yī),2002,34(3):29-30.

[13] 白挨泉,王曉清,甄勁松,等.廣東部分集約化豬場豬偽狂犬病毒野毒感染的血清學調查[J].中國畜牧獸醫(yī),2005,32(3):55-58.

[14] 李學伍,陳煥春,楊艷艷,等.PCR法對偽狂犬病病豬不同部位的檢測及敏感性試驗[J].中國畜禽傳染病,1998,20(6):365-368.

[15] Hampl H,Ben-Porat T,Ehrlicher L,etal.Characterization of envelope proteins of pseudorabies virus[J].J Viro1,1984,52:583-590.

[16] 費流芳,伍時達,吳虹,等.豬瘟與偽狂犬病混合感染的防制[J].中國獸醫(yī)科技，1995,33(4):33.

[17] 陳煥春,方六榮,何啟蓋,等.豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報,1998,29(2):156-161.

[18] 范偉興,魏榮,張雪蓮,等.PRV LA 株gD基因的序列測定及其重復高變區(qū)的發(fā)現(xiàn)[J].中國獸醫(yī)學報,2003,23(4):350-352.

[19] 陳煥春,周復春,力六榮,等.偽狂犬病病毒鄂A株TK-gG/LacZ突變株的構建[J].病毒學報,2001,17(1):69-74.

Cloning and Expression of Epitopes of gD Protein of Pseudorabies Virus

LIU Fang1,ZHANG Chong1，2,WANG Yinbiao2,ZHAO Pu2,DENG Ruiguang2,LI Xuewu2*
(1.College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Henan Key Laboratory of Animal Immunology/Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

According to the pseudorabies virus strain BJ/YTgDgene sequences in GenBank,a pair of primers were designed .The B-cell epitopes of gD was amplified,and the length of PCR product was 702 bp.The amplified fragment was cloned into the cloning vector pMD19-T successfully named pMD19-T-gD.The fragment was digested byBamH I andHindIII restriction enzymes and then cloned into the expression vector pET-28a named pET-28a-gD.The expression of protein was induced with IPTG,specific protein bands appeared at the site of 25 ku by SDS-PAGE electrophoresis.Western blot analysis showed that the expression product could be identified by pseudorabies virus positive serum .In this study，gD protein epitope was cloned and expressed successfully,and the expression product had good biological activity.

pseudorabies virus;gDgene; epitope; protein expression

2015-11-20

國家自然科學基金項目(31172348)

劉 芳(1988-)，女，河南洛陽人，在讀碩士研究生，研究方向：畜禽疫病快速檢測與防制。 E-mail：346103828@qq.com

*通訊作者：李學伍(1964-)男，河南通許人，研究員，博士，主要從事動物病毒生物學研究。E-mail：lixuewu2002@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)04-0122-04