劉云飛，寧文爍,2，陸秀君*，李瑞軍，郭 巍(.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 0700；2.河北省寧晉縣農(nóng)業(yè)局，河北 寧晉 055550)

蘇云金桿菌低成本固體發(fā)酵培養(yǎng)基的研制

劉云飛1，寧文爍1,2，陸秀君1*，李瑞軍1，郭 巍1
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001；2.河北省寧晉縣農(nóng)業(yè)局，河北 寧晉 055550)

蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一類對(duì)多種害蟲有效的病原微生物。為降低該菌產(chǎn)品制劑的生產(chǎn)成本，以北方常見的玉米芯粉、棉粕、豆粕等農(nóng)產(chǎn)品下腳料為培養(yǎng)基質(zhì)，研究了對(duì)多種鱗翅目、雙翅目害蟲具有特異殺蟲活性的Bt 菌株CYZ-4的固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。經(jīng)對(duì)培養(yǎng)基的初始含水量、pH值等單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始含水量為70%、pH值為8.2時(shí)，玉米芯固體發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量達(dá)到最大；當(dāng)玉米芯粉與棉粕質(zhì)量比為5∶5和6∶4，與豆粕質(zhì)量比為6∶4或7∶3時(shí)，發(fā)酵效果優(yōu)于其他組合，產(chǎn)物孢子濃度在9.3×109個(gè)/g以上；復(fù)合固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中，玉米芯粉、棉粕、豆粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.1%、7.2%、3.6%時(shí)發(fā)酵Bt的效果最好。培養(yǎng)基3種成分及pH值的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表明，將玉米芯粉、豆粕、棉粕按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.0%、6.7%、7.2%的比例混合，添加0.075%KH2PO4、0.05%MgSO4、0.035%CaCO3，調(diào)節(jié)初始含水量為70%、pH值為8.2，按4%的接種量接種，30 ℃下培養(yǎng)6 d，菌株的產(chǎn)孢量最大，達(dá)到1.80×1010個(gè)/g。該固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方成本低，發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，適于以藥肥撒施毒土方式施用防治鱗翅目和雙翅目地下害蟲。

蘇云金桿菌； 固體發(fā)酵； 培養(yǎng)基； 玉米芯； 發(fā)酵工藝

蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，研究發(fā)現(xiàn)其殺蟲活性蛋白對(duì)多種農(nóng)林業(yè)害蟲毒性較強(qiáng)，因此，利用其特異菌株發(fā)酵，進(jìn)而開發(fā)的生物殺蟲劑在農(nóng)林、衛(wèi)生等領(lǐng)域被大范圍推廣應(yīng)用[1]。但目前Bt商品制劑的獲得主要采取液體發(fā)酵，導(dǎo)致藥劑生產(chǎn)成本偏高，提高了害蟲防治的投入，這一因素已經(jīng)成為限制Bt商品制劑擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如何降低Bt的發(fā)酵成本，研制其低成本發(fā)酵培養(yǎng)基具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

Bt發(fā)酵生產(chǎn)有深層液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵具有明顯的優(yōu)勢(shì)。一方面，固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的含水量偏少，發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生后，其廢水少，發(fā)酵殘?jiān)苌偕踔翢o(wú)廢渣，對(duì)環(huán)境影響小。另一方面，固體發(fā)酵還具有投入低、產(chǎn)出高、使用方便簡(jiǎn)潔、低能耗等優(yōu)點(diǎn)[2]，生產(chǎn)中和液體發(fā)酵相比逐漸體現(xiàn)出它的優(yōu)越性。

Bt是一類易培養(yǎng)的細(xì)菌，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境要求簡(jiǎn)單，一些農(nóng)副產(chǎn)品的下腳料甚至廢物仍能被Bt利用進(jìn)而正常生長(zhǎng)，這為開發(fā)Bt的低成本固體發(fā)酵培養(yǎng)基奠定了理論基礎(chǔ)。為了得到高毒性的Bt發(fā)酵產(chǎn)物，人們通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)基各組分的比例和培養(yǎng)條件，調(diào)整其生長(zhǎng)周期及殺蟲蛋白的產(chǎn)量來(lái)達(dá)到預(yù)期效果，其中培養(yǎng)基配方對(duì)于Bt固體發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量尤為重要[3]。鑒于此，為了開發(fā)出具有實(shí)踐生產(chǎn)價(jià)值的低成本固體發(fā)酵培養(yǎng)基，人們對(duì)麥麩、棉粕、花生餅粉、豆粕、米糠等常見農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)行了試驗(yàn)[4-5]。在此基礎(chǔ)上，人們開始嘗試?yán)棉r(nóng)產(chǎn)品的下腳料進(jìn)行Bt固體發(fā)酵培養(yǎng)，如杜雷等[5]利用煙梗廢料為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)Bt；張靈玲等[6]以食用菌生產(chǎn)的下腳料菌糠為主要培養(yǎng)基質(zhì)，探索出成本降低50%的Bt新型固體發(fā)酵培養(yǎng)基。以上研究結(jié)果說(shuō)明，利用農(nóng)產(chǎn)品下腳料來(lái)降低Bt菌的發(fā)酵成本是可行的。

玉米是我國(guó)北方旱作區(qū)重要的糧食作物，其產(chǎn)量高，收益好，種植面積大。玉米芯是玉米生產(chǎn)中的廢棄物，年產(chǎn)量在6 000萬(wàn)t左右，通常被丟棄或者焚燒，一方面造成巨大浪費(fèi)，另一方面還可能對(duì)環(huán)境造成污染[7]，玉米芯如何能夠變廢為寶，參與能量的循環(huán)利用引起了研究人員的極大興趣。文獻(xiàn)表明，1999年研究人員已成功應(yīng)用玉米芯作基質(zhì)培育出食用菌——平菇[8]。在這一研究成果的啟發(fā)下，人們先后應(yīng)用玉米芯作培養(yǎng)基質(zhì)來(lái)生產(chǎn)杏鮑菇、金針菇、木耳等多種優(yōu)質(zhì)食用菌，目前玉米芯培養(yǎng)基已經(jīng)替代棉籽成為生產(chǎn)食用菌的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基[9]。此外，科研人員還利用玉米芯進(jìn)行多方面有益嘗試，高禮芳等[10]優(yōu)化了玉米芯高溫條件下利用稀酸催化水解生產(chǎn)糠醛的工藝；封功能等[11]進(jìn)行了利用黑曲霉和啤酒酵母發(fā)酵玉米芯生產(chǎn)生物飼料的試驗(yàn)；趙龍等[12]進(jìn)行了玉米芯載體固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸工藝的研究，其發(fā)酵產(chǎn)物中L-乳酸積累量達(dá)到32.23 g/L，葡萄糖對(duì)L-乳酸轉(zhuǎn)化率達(dá)80.58%。這些研究結(jié)果表明，玉米芯是一類開發(fā)價(jià)值明顯的生物資源，其蘊(yùn)含的巨大生物量能夠通過(guò)合理的利用技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用其作為多種微生物的發(fā)酵原材料具有廣闊的前景。Bt制劑是一類重要的生物農(nóng)藥，其能否應(yīng)用玉米芯進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)目前尚未見報(bào)道，為了明確玉米芯在Bt固體發(fā)酵生產(chǎn)中的可行性，減少Bt發(fā)酵的投入，簡(jiǎn)化發(fā)酵條件，以北方常見的農(nóng)產(chǎn)品下腳料玉米芯、豆粕、棉粕等為材料，進(jìn)行了Bt菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基研究，以期得到優(yōu)化的固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：Bt CYZ-4菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究室保存，含有基因cry1Ac、cry1Ab和cry2Ab，為對(duì)多種鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲具有高活性的蘇云金桿菌野生菌株[13]。

試劑：牛肉膏蛋白胨、酵母粉、氯化鈉(NaCl)、瓊脂粉、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、碳酸鈣(CaCO3)及硫酸鎂(MgSO4)均為分析純，由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)。

基質(zhì)：玉米芯由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園試驗(yàn)地種植玉米脫粒后獲得，豆粕、棉粕從市場(chǎng)購(gòu)得。

培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl 1%，pH值7.5。 固體LB培養(yǎng)基在液體LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.3%的瓊脂即可。以上培養(yǎng)基用于CYZ-4菌株的活化及種子菌的培養(yǎng)。

儀器：超凈工作臺(tái)，SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；電子天平，ACCULAB ALC-1100.2，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；pH計(jì)，DELTA 320，梅特勒-托多利儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱，GXZ型，寧波江南儀器廠生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，13395H2X型，德國(guó)Leica公司生產(chǎn)；空氣浴振蕩器，HZQ-C，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 玉米芯為基質(zhì)的固體發(fā)酵工藝研究

1.2.1.1 培養(yǎng)基最適含水量的篩選 培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中配制，每瓶均加入10 g玉米芯粉，無(wú)機(jī)鹽含量為KH2PO40.075%、MgSO40.05%和CaCO30.035%，初始pH值7.8。而后分別添加不同量的蒸餾水，設(shè)含水量為84%、80%、75%、73%、70%、67%、63%、57%、50%共9個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。各培養(yǎng)基在121 ℃下高壓滅菌備用。在LB培養(yǎng)基平板上活化Bt CYZ-4菌株，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)好的種子菌[11]，在超級(jí)工作臺(tái)中按照4%的接種量接種，并用滅菌的玻璃棒攪拌混勻，后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，連續(xù)培養(yǎng)6 d得到發(fā)酵產(chǎn)物。將發(fā)酵產(chǎn)物用滅菌水稀釋10倍，置于搖床中200 r/min搖2 h，使培養(yǎng)基質(zhì)與孢子分離；靜置后取澄清液，稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每重復(fù)計(jì)3次，計(jì)算孢子產(chǎn)量，統(tǒng)計(jì)孢子濃度，利用SPSS 19軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.1.2 培養(yǎng)基最適初始pH值的篩選 選取最適含水量培養(yǎng)基進(jìn)行最適初始pH值試驗(yàn)。按照pH值相差0.5的梯度，介于4.5～9.5設(shè)計(jì)11個(gè)初始pH值處理，試驗(yàn)操作及分析方法同1.2.1.1，分析培養(yǎng)基的酸堿性對(duì)Bt CYZ-4菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響；在初步得到合適pH值的基礎(chǔ)上，按照pH值相差0.3的梯度，再設(shè)計(jì)7個(gè)pH值處理，得到含水量和初始pH值最優(yōu)的Bt玉米芯固體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 玉米芯、棉粕為基質(zhì)的固體發(fā)酵工藝研究 在1.2.1.2結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行添加棉粕作為氮源的固體發(fā)酵試驗(yàn)。以玉米芯發(fā)酵配方為對(duì)照，分別按照玉米芯與棉粕質(zhì)量比4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1配制培養(yǎng)基[3]，其他同1.2.1.1，探討玉米芯、棉粕為基質(zhì)的最佳固體發(fā)酵配方。

1.2.3 玉米芯、豆粕為基質(zhì)的固體發(fā)酵工藝研究 豆粕是常用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)，試驗(yàn)在研制的玉米芯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同比例豆粕，研制由豆粕與玉米芯組成的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)方法同1.2.2。

1.2.4 玉米芯復(fù)合固體發(fā)酵培養(yǎng)基研制

1.2.4.1 基礎(chǔ)配方篩選 在1.2.2和1.2.3試驗(yàn)得到的2種成分最優(yōu)配方基礎(chǔ)上，將兩配方分別按照質(zhì)量比4∶1(處理Ⅰ)、3∶2(處理Ⅱ)、2∶3(處理Ⅲ)和1∶4(處理Ⅳ)的比例配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基總量仍為10 g，同時(shí)以2種成分最優(yōu)配方為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，得到以玉米芯為主的3種成分的Bt固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方。

1.2.4.2 玉米芯復(fù)合固體發(fā)酵配方的優(yōu)化 在得到基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，優(yōu)化3種組分比例和pH值。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯固體發(fā)酵培養(yǎng)基的研制

2.1.1 培養(yǎng)基含水量的確定 試驗(yàn)結(jié)果表明，利用玉米芯可以成功發(fā)酵Bt菌，發(fā)酵產(chǎn)物中孢子濃度均達(dá)到1×108個(gè)/g以上(圖1)。培養(yǎng)基含水量是影響B(tài)t菌發(fā)酵質(zhì)量的重要因素，不同含水量的玉米芯發(fā)酵Bt菌產(chǎn)物孢子濃度由高到低的順序依次為：70%、73%、75%、67%、80%、63%、50%、84%、57%。其中70%為最適含水量，與其他處理間存在顯著差異(P<0.05)。

2.1.2 最適pH值的確定 由圖2可以發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基pH值4.5～9.5的11個(gè)處理中，培養(yǎng)基的酸堿度直接影響B(tài)t菌的發(fā)酵質(zhì)量。在堿性條件下，Bt菌有較好的發(fā)酵效果，其發(fā)酵產(chǎn)物孢子濃度均大于2.0×109個(gè)/g，其中，pH值8.0為該試驗(yàn)發(fā)酵的最適pH值，其產(chǎn)物中孢子濃度達(dá)到4.7×109個(gè)/g。

為了得到更準(zhǔn)確的玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)基pH值，進(jìn)一步在pH值6.7～8.5設(shè)計(jì)7個(gè)pH值梯度處理進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可見，pH值為7.9～8.5時(shí)發(fā)酵效果好于其他處理，優(yōu)化試驗(yàn)得到了與初步試驗(yàn)相似的結(jié)論，培養(yǎng)基初始pH值8.2處理組的發(fā)酵產(chǎn)物孢子濃度最高，可達(dá)4.9×109個(gè)/g。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同圖1 不同初始含水量對(duì)Bt固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

圖2 不同pH值對(duì)Bt固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

圖3 玉米芯固體發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的確定

2.2 玉米芯、棉粕為基質(zhì)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的研制

從表2可以看出，發(fā)酵效果因添加棉粕比例不同存在較大差異。其中，當(dāng)玉米芯與棉粕質(zhì)量比為5∶5、6∶4時(shí)，Bt菌的發(fā)酵效果最好，產(chǎn)物孢子濃度達(dá)到9.3×109～9.6×109個(gè)/g，約為玉米芯培養(yǎng)基的2倍，且與其他處理差異顯著(P<0.05)。

2.3 玉米芯、豆粕為基質(zhì)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的研制

從表2可以看出，添加不同比例豆粕(玉米芯與豆粕質(zhì)量比為9∶1除外)與單一玉米芯培養(yǎng)基相比，發(fā)酵產(chǎn)物孢子濃度具有不同程度的提高，初步說(shuō)明，豆粕中含有Bt生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)成分。但對(duì)添加不同比例豆粕發(fā)酵結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，豆粕的添加比例與發(fā)酵產(chǎn)物孢子濃度并未呈現(xiàn)正相關(guān)，其中玉米芯與豆粕質(zhì)量比為6∶4、7∶3時(shí)，培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵Bt的效果最好，產(chǎn)物孢子濃度大于1×1010個(gè)/g，兩處理與其他處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 不同比例棉粕和豆粕培養(yǎng)基對(duì)孢子濃度的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.4 玉米芯、棉粕和豆粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的研制

2.4.1 基礎(chǔ)配方組成 以玉米芯為主要基質(zhì)，添加豆粕和棉粕進(jìn)行復(fù)合配方研制試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可以看出，不同配比固體培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果存在差異，其中處理Ⅱ的發(fā)酵產(chǎn)物孢子濃度為1.12×1010個(gè)/g，其培養(yǎng)基中玉米芯、棉粕、豆粕分別為6.4、2.4、1.2 g，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.1%、7.2%、3.6%。該處理發(fā)酵效果最優(yōu)，且與除處理Ⅲ外的其他處理間差異顯著(P<0.05)，因此，選用該復(fù)合配方進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

表3 玉米芯、豆粕和棉粕復(fù)合固體培養(yǎng)基的研制

2.4.2 玉米芯復(fù)合固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。根據(jù)極差判斷出各因子對(duì)產(chǎn)孢量影響的主次順序?yàn)锽>D>C>A，即豆粕添加比例是影響發(fā)酵效果的最關(guān)鍵因素，其次為pH值，棉粕的比例影響最小。正交試驗(yàn)中組合3(A1B3C3D3)的孢子濃度最高，達(dá)到1.67×1010個(gè)/g；同時(shí)推斷出的最佳組合為A3B3C3D3，即豆粕3.0 g、棉粕3.2 g、玉米芯7.2 g，pH值8.2。為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，采用推斷的最優(yōu)組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其孢子濃度高于組合3，為1.80×1010個(gè)/g，但兩者間差異不顯著，再次說(shuō)明棉粕不是影響發(fā)酵質(zhì)量的關(guān)鍵因子。綜上，以玉米芯為基質(zhì)的復(fù)合固體發(fā)酵培養(yǎng)基按照玉米芯16.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)、豆粕6.7%、棉粕7.2%、KH2PO40.075%、MgSO40.05%、CaCO30.035%的比例配制，調(diào)節(jié)pH值為8.2，接種種子菌后至于30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)6 d，能達(dá)到最好的發(fā)酵效果。

表4 復(fù)合固體發(fā)酵培養(yǎng)基的L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

Bt作為全球應(yīng)用范圍最廣、對(duì)多種害蟲高效的生物殺蟲劑，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。但其生產(chǎn)成本高引起防治成本居高不下，進(jìn)而導(dǎo)致使用者難以承受已經(jīng)成為其擴(kuò)大應(yīng)用的關(guān)鍵限制因素。因此，開發(fā)利用低成本的發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)，簡(jiǎn)化發(fā)酵環(huán)節(jié)，降低其生產(chǎn)成本將為Bt的進(jìn)一步應(yīng)用提供可能。杜雷等[5]以煙梗廢料、玉米粉和豆餅粉為原料，進(jìn)行Bt HD-1的固體發(fā)酵，發(fā)酵后的芽孢數(shù)可穩(wěn)定在9.5×1010cfu/mL；張群林等[14]以玉米粉、黃豆餅粉和葡萄糖為原料對(duì)Bt BRC-ZQL3進(jìn)行固體發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)物孢子濃度達(dá)到2.4×108個(gè)/mL；盧娜等[15]利用玉米浸泡液制備蘇云金桿菌生物殺蟲劑，27 h的芽孢數(shù)能達(dá)到1.5×109cfu/mL。上述培養(yǎng)基中，均用到了與玉米相關(guān)的產(chǎn)物，證明玉米中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適合Bt的生長(zhǎng)。但是以玉米芯作為固體培養(yǎng)基基質(zhì)進(jìn)行Bt發(fā)酵的研究尚未見報(bào)道。為了得到低成本、高產(chǎn)量的Bt固體發(fā)酵培養(yǎng)基，本試驗(yàn)以玉米芯粉為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)Bt CYZ-4發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，找到了一種適合該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝，將玉米芯粉、豆粕、棉粕按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.0%、6.7%、7.2%的比例混合，添加0.075% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.035% CaCO3，調(diào)節(jié)初始含水量為70%、pH值為8.2，按4%的接種量接種種子菌，30 ℃下培養(yǎng)6 d，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)孢量最大，達(dá)到1.80×1010個(gè)/g。與普通發(fā)酵工藝相比，該工藝發(fā)酵成本降低，為其進(jìn)一步用于Bt工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)，后續(xù)工作將對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

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Development of Low-cost Solid Fermentation Medium ofBacillusthuringiensis

LIU Yunfei1,NING Wenshuo1,2,LU Xiujun1*,LI Ruijun1,GUO Wei1
(1.College of Plant Protection,Agricultural University of Hebei/Engineering Research Center for Biological Control of Agricultural Pests in Hebei Province,Baoding 071001,China; 2.Agriculture Bureau of Ningjin County,Ningjin 055550,China)

Bacillusthuringiensis(Bt) is a biological insecticide used widely.This paper proposes to study the solid fermentation of Bt CYZ-4 strain,which has specific insecticidal activity to Lepidoptera and Diptera.In order to reduce production costs,some agricultural products such as corncob powder,cottonseed meal and soybean meal were used as culture medium.The single factor experiments showed that the amount of spores was improved most under the treatment of corncob powder with the initial water content of 70% and pH value of 8.2.When the mass ratio of corncob powder and cottonseed meal was 5∶5 or 6∶4,and that of corncob powder and soybean meal was 6∶4 or 7∶3,the fermentation effects were better than others,with the product spore concentration more than 9.3×109cells/g.In composite solid fermentation base formulation,the optimum composition was 19.1% of corncob powder,7.2% of cottonseed meal,and 3.6% of soybean meal.The optimum culture medium composition and pH value were obtained through the orthogonal design.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: the medium contained 16.0% corncob powder,7.2% cottonseed meal,6.7% soybean meal,0.075% KH2PO4,0.05% MgSO4,and 0.035% CaCO3,with 70% of the initial moisture content and pH value of 8.2,the inoculums amount was 4%,and the strain was cultivated at 30 ℃ for 6 d.Under these conditions,the maximum spore yield reached 1.80×1010cells/g,which was higher than that under the initial fermentation level.The solid fermentation medium had low cost and simple fermentation conditions,also easy for use in the field.

Bacillusthuringiensis； solid fermentation； medium； corn cob； fermentation condition

2015-09-28

國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蟲害防控崗位項(xiàng)目(CARS-14)；河北省“十二五”重點(diǎn)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14236811D，14226502D)；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士基金及教研項(xiàng)目(2012-B33)

劉云飛(1987-)，男，湖北安陸人，碩士，主要從事植物保護(hù)研究。E-mail：282815536@qq.com

*通訊作者：陸秀君(1970-)，女，河北昌黎人，教授，博士，主要從事害蟲生物防治與綜合治理研究。 E-mail:luxiujun@hebau.edu.cn

S476.11;TQ920.4

A

1004-3268(2016)04-0102-06