陳 帆，謝伶俐，袁程飛，許本波(長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

甘藍型油菜BnTIR1基因的克隆和表達特征分析

陳 帆，謝伶俐，袁程飛，許本波*
(長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

植物的轉(zhuǎn)運抑制應(yīng)答因子1(transport inhibitor response 1，TIR1)作為生長素的受體，在生長素信號的感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。采用RACE技術(shù)從中雙9號中克隆了甘藍型油菜BnTIR1全長cDNA序列和基因組序列。BnTIR1 的DNA序列為2 502 bp，包含2個內(nèi)含子;cDNA序列為2 355 bp，ORF為1 824 bp，其編碼蛋白含607個氨基酸。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BnTIR1蛋白存在AMN1保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明，BnTIR1 在甘藍型油菜根、莖、葉、芽、花、角果中均有表達，但表達水平不同，在葉中表達水平最高，花中最低；干旱和ABA均可誘導(dǎo)BnTIR1表達，暗示其可能參與植物逆境脅迫響應(yīng)過程。

甘藍型油菜； 克?。?轉(zhuǎn)運抑制應(yīng)答因子1； ABA

植物激素影響植物細胞的分化、形態(tài)建成等多個方面[1-2]。植物對生長素信號的感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過轉(zhuǎn)運抑制應(yīng)答因子(transport inhibitor response 1/auxin signaling F-box，TIR1/AFB F-box)[3]、生長素/吲哚乙酸轉(zhuǎn)錄抑制因子(Aux/IAA transcriptional repressors)[4]和ARF轉(zhuǎn)錄因子(ARF transcription factors)[5]等激素受體實現(xiàn)的。TIR1/AFB F-box充當(dāng)激素受體，感知激素信號，促進Aux/IAA的泛素化降解[6]。人們最早從擬南芥中發(fā)現(xiàn)TIR1[7]，研究結(jié)果表明，TIR1作為生長素的受體參與生長素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。AtTIR1蛋白含有1個F-box結(jié)構(gòu)域和多個富亮氨酸重復(fù)基序LRR，TIR1通過F-box結(jié)構(gòu)域形成泛素化降解途徑中的E3連接酶復(fù)合體SCFTIR1(skp1-cullin-F-box protein)，促進Aux/IAA的泛素化降解，釋放ARF(auxin responsive factor)蛋白，進而調(diào)控相關(guān)基因的表達[8-9]。為研究TIR1在甘藍型油菜(BrassicanapusL.)生長發(fā)育與抗逆過程中的作用，從甘藍型油菜中雙9號中克隆了BnTIR1基因，并分析了其在不同組織部位及逆境下的表達特征，以期為利用TIR1調(diào)控植物的抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜品種為中雙9號，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所。

1.2BnTIR1基因的全長cDNA擴增及序列分析

利用CTAB法提取甘藍型油菜中雙9號葉片DNA[10]和RNA[11]，利用RNase-free DNase I (TaKaRa)除去RNA中混有的微量DNA，按照SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)說明書完成cDNA的合成。對擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AK221208)、醉蝶花(Tarenayahassleriana)(XM_010531809)等物種的TIR1基因的核苷酸序列進行多重比對，設(shè)計甘藍型油菜BnTIR1基因的3′和5′ RACE一擴和巢式PCR擴增引物(表1)。以葉cDNA為模板，按照GeneRacer kit (Invitrogen, USA)說明書分別進行BnTIR1的3′及5′ RACE擴增。其中，引物FBnTIR1-31和FBnTIR1-32與試劑盒3′ RACE引物配對用于3′cDNA 末端擴增，引物RBnTIR1-51和RBnTIR1-52與試劑盒5′ RACE引物配對用于5′cDNA末端擴增，按照GeneRacer kit (Invitrogen,USA)說明書分別進行甘藍型油菜BnTIR1的3′及5′RACE擴增。擴增體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、試劑盒引物1 μL、 RACE引物1 μL、cDNA 1 μL、Taq酶 (5 U/μL)0.5 μL、ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 PCR引物名稱及序列

根據(jù)5′和3′末端測序結(jié)果，設(shè)計1對引物FBnTIR1/RBnTIR1(表1)用于擴增BnTIR1全長cDNA及對應(yīng)的基因組序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳、凝膠回收后連接到pMD18-T載體，交由北京三博生物有限公司測序。利用軟件Vector NTI Advance 9.0對測定序列進行分析，查找開放閱讀框(ORF)，翻譯成蛋白，并進行蛋白質(zhì)參數(shù)計算。利用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析核酸、蛋白質(zhì)的同源性。在EXPASY網(wǎng)站 (http://www.expasy.org and http://www.softberry.com/berry.phtml)進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析。

1.3BnTIR1基因的表達特征分析

將中雙9號盆栽于長江大學(xué)人工氣候室，于成熟期取根、莖、芽、葉、花和角果材料于-80 ℃保存。

以20 d苗齡的中雙9號幼苗為材料，分別進行ABA處理和干旱處理。在ABA處理中，利用10 μmol/L ABA噴施幼苗，清水處理為對照，正常澆水，連續(xù)處理5 d后分別取處理植株和對照植株葉片于-80 ℃保存；在干旱處理中，對幼苗停止?jié)菜?，處? d后，取干旱處理植株葉片。

利用CTAB法提取組織RNA[11]。利用RNase-free DNase Ⅰ (TaKaRa)除去RNA中混有的微量DNA，按照SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)說明書完成cDNA的合成。根據(jù)擬南芥actin基因序列設(shè)計甘藍型油菜actin基因擴增引物FACT/RACT(表1)。按照SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)說明書完成cDNA的合成。以actin基因為內(nèi)參基因，采用BnTIR1基因的qRT-PCR引物QFTIR1/QRTIR1(表1)擴增檢測BnTIR1基因表達水平。其qRT-PCR體系按照TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq試劑盒的操作說明配制，擴增體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、試劑盒引物1 μL、 RACE引物1 μL、cDNA 1 μL、Taq酶 (5 U/μL)0.5 μL、ddH2O 37.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1BnTIR1基因的克隆及序列分析

分別以cDNA和基因組DNA為模板，利用引物FBnTIR1/RBnTIR1成功地擴增出1條約2.3 kb的亮帶和1條約2.5 kb的亮帶，將得到的序列命名為BnTIR1，經(jīng)回收、連接、測序發(fā)現(xiàn)，其基因組DNA全長為2 502 bp，其遵循標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)含子剪接方式：GT…AG，包含2個內(nèi)含子；其cDNA全長為2 355 bp (不包括polyA)，5′UTR長度為135 bp，3′UTR長度為396 bp，ORF長度為1 824 bp(圖1)。

ATG和TAG用下劃線和粗體表示，內(nèi)含子用灰背景表示圖1 BnTIR1的核酸序列和氨基酸序列

經(jīng)NCBI Blastn分析表明,BnTIR1和來自十字花科的白菜(Brassicarapa)、甘藍(Brassicaoleracea)的TIR1基因的同源性最高，分別為98.6%、90.6%，和其他一些植物的TIR1基因也有較高的同源性。

翻譯BnTIR1的開放讀碼框，得到1個由607個氨基酸組成的多肽鏈，其分子質(zhì)量為68.96 ku，等電點為5.55。Blastp(protein-protein BLAST)結(jié)果表明，BnTIR1蛋白序列與許多已知的植物TIR1蛋白具有很高的相似性，與白菜TIR1蛋白的相似性最高，其與白菜、甘藍、擬南芥和薺藍(Camelinasativa)TIR1蛋白的一致性/相似性分別為99.2%/99.7%、95.9%/97.4%、76.8%/84.0%和83.9%/87.5%，說明在十字花科TIR1蛋白進化過程中，該蛋白序列非常保守。

多重比對和聚類分析結(jié)果(圖2)表明，BnTIR1蛋白和來自十字花科植物甘藍和白菜的TIR1蛋白聚成1個亞類。其中，BnTIR1與白菜TIR1的遺傳距離最近，它們與醉蝶花、擬南芥、薺藍以及黃瓜(Cucumissativus)的TIR1遺傳距離也比較近，形成一個大類。

NCBI保守結(jié)構(gòu)域搜索表明，BnTIR1蛋白的V149

各TIR蛋白的GenBank序列號分別為AtTIR1:CAB45074.1,ThTIR1:XP_010530111.1,BrTIR1:XP_009134037.1,BoTIR1:XP_013629743.1,CsTIR1:XP_010445996.1,CsaTIR1:XP_011652571.1,GrTIR1:XP_012450171.1,JcTIR1:XP_012067953.1,PeTIR1:XP_011010387.1,MdTIR1:XP_008338910.1,PmuTIR1:XP_008219380.1,CaTIR1:XP_004490408.1,GmTIR1:XP_003544234.1,VvTIR1:XP_002283927.2,EgTIR1:XP_010939729.1,PdTIR1:XP_008812967.1,ZmTIR1:KMZ63694.1,NnTIR1:XP_010266465.1,NsTIR1:XP_009763830.1,到R252和C372到P526區(qū)域分別對應(yīng)存在AMN1(antagonist of mitotic exit network protein 1)保守結(jié)構(gòu)域。

StTIR1:XP_006338135.1

圖2 BnTIR1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

SignalP 3.0預(yù)測表明，BnTIR1蛋白沒有信號肽；TargetP預(yù)測表明，BnTIR1蛋白位于葉綠體、線粒體的可能性很小；PSORT預(yù)測表明，BnTIR1蛋白可能定位于細胞核中，結(jié)合BnTIR1蛋白功能分析，BnTIR1蛋白應(yīng)該位于細胞核中；而TMpred預(yù)測表明，BnTIR1蛋白具有5個強的跨膜結(jié)構(gòu)。

利用SOPMA軟件預(yù)測BnTIR1二級結(jié)構(gòu)(圖3)發(fā)現(xiàn)，BnTIR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)含有48.43%的α螺旋(α helix)、14.66%的延伸鏈(extended strand)、7.25%的β轉(zhuǎn)角(β turn)和29.65%的隨機卷曲(random coil)。BnTIR1蛋白的中部有3個大型的α螺旋，N-末端具有大量的隨機卷曲。在其尾部(C-末端)均有大量隨機卷曲和延伸鏈，且不存在α螺旋；同時在其中部α螺旋與尾部α螺旋之間，存在轉(zhuǎn)角與延伸鏈交錯的結(jié)構(gòu)。

h：螺旋； e：延伸鏈； t：beta 轉(zhuǎn)角； c：隨機轉(zhuǎn)曲。線條從長變短分別表示h、e、t和c圖3 BnTIR1-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2BnTIR1基因的表達特征分析

2.2.1BnTIR1基因在不同組織中的表達情況 由圖4可知，BnTIR1基因在甘藍型油菜中雙9號的根、莖、葉、芽、花、角果中均有表達，且表達量差異極顯著(除花和角果外)，BnTIR1在葉中表達水平最高，其次為根部，而在花和角果中轉(zhuǎn)錄水平最低。由于BnTIR1主要參與激素的應(yīng)答和運輸，因此BnTIR1基因的組織表達模式可能與各組織的生物學(xué)功能相關(guān)。

2.2.2BnTIR1基因在不同逆境條件下的表達情況 對甘藍型油菜中雙9號幼苗進行干旱和ABA處理發(fā)現(xiàn)，干旱和ABA處理均可誘導(dǎo)BnTIR1基因表達，且其表達量極顯著高于未處理對照(圖5)，表明BnTIR1可能參與植物抗逆過程。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同圖4 BnTIR1基因在甘藍型油菜不同組織中的表達水平

圖5 ABA和干旱對BnTIR1基因.的誘導(dǎo)表達作用

3 結(jié)論與討論

生長素在根系的形成等植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。本研究從甘藍型油菜中雙9號中克隆了生長素受體基因TIR1的全長cDNA序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列與其他植物的TIR1蛋白序列有較高的同源性。生物信息學(xué)分析表明，該基因是1個典型的TIR1基因。本研究發(fā)現(xiàn)，TIR1基因在甘藍型油菜各組織器官中的表達水平不同，該結(jié)果與唐壯等[12]的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，在植物的生長發(fā)育過程中，幾種植物激素相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的發(fā)育過程[13-16]。IAA的作用受其他植物激素，如ABA[17]、GA3[18]等的調(diào)控。曹紅利等[18]的研究結(jié)果表明，ABA、GA3、茉莉酸甲酯和油菜素內(nèi)酯可以誘導(dǎo)CsTIR1表達，并且在短時間(1 h)內(nèi)就能夠顯著上調(diào)該基因的表達量。本研究發(fā)現(xiàn)，BnTIR1 能夠響應(yīng)ABA和干旱脅迫，也說明植物激素之間存在廣泛的互作。而且BnTIR1受干旱誘導(dǎo)，說明該基因在植物抗逆過程中發(fā)揮一定作用，但有待于深入研究。

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Cloning and Expression Characteristics ofBnTIR1 fromBrassicanapusL.

CHEN Fan,XIE Lingli,YUAN Chengfei,XU Benbo*
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

Transport inhibitor response 1 (TIR1),as an auxin receptor,plays an key role in response to auxin signals.AnTIR1 gene,denoted asBnTIR1,was cloned by the rapid amplification of cDNA ends (RACE) from Zhongshuang No.9.The genomic sequence length ofBnTIR1 was 2 502 bp,which contained two introns.The cDNA sequence length ofBnTIR1 was of 2 355 bp,which had a 1 824 bp ORF encoding a polypeptide of 607 amino acids.The prediction results indicated that the BnTIR1 protein contained conserved AMN1 domain.qRT-PCR results showed theBnTIR1 gene were expressed in roots,stems,shoots,eaves,flowers and siliques,but the transcription level were different among the six tissues,which was the highest in leaves,lowest in flowers;BnTIR1 were induced by drought and ABA,which indicated thatBnTIR1 could involve in responding to stress.

BrassicanapusL.; cloning; transport inhibitor response 1; ABA

2015-11-05

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目(教外司[2014]1685號)

陳 帆(1991-)，男，湖北荊州人，在讀碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail:565275863@qq.com

*通訊作者：許本波(1977-)，男，湖北安陸人，副教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。 E-mail:benboxu@yangtzeu.edu.cn

S565.4；Q78

A

1004-3268(2016)04-0049-05