王媛花，顏志明，解振強(qiáng)，馮英娜，蔡善亞

(1 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2 江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212400)

?

SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用

王媛花1,2，顏志明1,2，解振強(qiáng)1,2，馮英娜1,2，蔡善亞1,2

(1 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2 江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212400)

以番茄(SolanumlycopersicumL.)品種‘Micro Tom’為試材，分析番茄葉片和果實(shí)的灰霉病發(fā)病規(guī)律，及番茄類鈣調(diào)磷酸酶B基因(tomato calcineurin B-like gene，SlCBL1)在葉片和果實(shí)中的表達(dá)變化；比較轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄與對(duì)照的葉片和果實(shí)的灰霉病發(fā)病過程，分析轉(zhuǎn)基因番茄抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化。結(jié)果表明：(1)非轉(zhuǎn)基因番茄中，不同葉齡的葉片均在接種灰霉病4 d開始發(fā)??；不同發(fā)育階段的果實(shí)接種灰霉病后發(fā)病時(shí)間也不同，其中綠果(花后16～18 d)接種5 d還未發(fā)病，白果(花后34～36 d)接種11 d開始發(fā)病，紅果(花后40～42 d)接種5 d開始發(fā)?。籗lCBL1基因表達(dá)量在番茄葉片中較低，在綠果期和白果期的果實(shí)中表達(dá)量最高，紅果期果實(shí)中表達(dá)量最低。(2)轉(zhuǎn)SlCBL1基因后，SlCBL1基因的過量表達(dá)能夠抑制番茄葉片和果實(shí)灰霉病發(fā)生；同時(shí)番茄葉片和果實(shí)中幾乎所有的抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量都上調(diào)，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因SlWRKY33和SlWRKY70受到強(qiáng)烈調(diào)控。研究說明，SlCBL1基因過量表達(dá)能夠提高番茄的抗灰霉能力，其主要機(jī)理是通過影響抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控番茄抗灰霉病的能力。

番茄；SlCBL1；抗灰霉病

類鈣調(diào)磷酸酶B基因(calcineurin B-like gene，CBL)家族是一類鈣感應(yīng)器。CBL基因最初在擬南芥中克隆出來，同酵母中鈣調(diào)磷酸酶B和動(dòng)物中的神經(jīng)鈣調(diào)傳感器非常相似，因此被命名為類鈣調(diào)磷酸酶B[1-3]。CBL1基因是CBL基因家族中研究最多的基因[4-6]。目前對(duì)CBL1基因的研究多集中于非生物脅迫，包括鹽、低溫、ABA和干旱等作用。近年來，多個(gè)物種中的CBL1 基因已被成功分離并進(jìn)行了功能驗(yàn)證[7-12]。研究發(fā)現(xiàn)CBL1基因在不同逆境脅迫與生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同表達(dá)模式，是植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)[13-15]。病害作為一種逆境，而關(guān)于CBL1基因在病害中的調(diào)控作用研究極少，尤其是對(duì)園藝作物中多發(fā)的灰霉病幾乎沒有相關(guān)研究。因此CBL1基因在植物抗灰霉病中是否也有作用，是未來研究CBL1基因功能的一個(gè)新方向。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是一種重要的園藝作物，灰霉病是設(shè)施栽培番茄的主要病害之一，如果發(fā)生灰霉病會(huì)導(dǎo)致番茄減產(chǎn)30%～40%，造成嚴(yán)重?fù)p失[16]。目前番茄的灰霉病發(fā)生機(jī)理以及抗病機(jī)制研究已經(jīng)取得了一些相關(guān)成果[17-22]，但還未見關(guān)于CBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用報(bào)道。 ‘Micro Tom’是一種番茄矮化突變體。它保留了普通番茄作為模式植物的基本特征，植株矮小、生命周期更短，具有節(jié)省研究空間、縮短研究時(shí)間的巨大優(yōu)勢(shì)[23]，更易于在實(shí)驗(yàn)室可控環(huán)境條件下進(jìn)行灰霉病接種處理，可以大量取樣進(jìn)行試驗(yàn)。本研究分析了SlCBL1基因在番茄中過量葉片和果實(shí)發(fā)病規(guī)律，并且進(jìn)行相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析，探究SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的特殊作用，對(duì)深入理解番茄抗病機(jī)理有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年5月～2016年3月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。番茄品種‘Micro Tom’普通種子購買自美國Ball Horticultural Company，‘Micro Tom’轉(zhuǎn)基因番茄種子由本實(shí)驗(yàn)室獲得。試驗(yàn)用的灰霉菌(Botrytiscinerea)由本校生物工程中心從田間分離所得。病菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)?；颐咕猿Ｒ?guī)方法純化后，接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)14 d。葉片和果實(shí)采用不同接種方法。葉片接種時(shí)，用直徑3 mm打孔器在培養(yǎng)基上打孔，打孔出來的菌餅置于葉片傷口處。果實(shí)處理時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基切下放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩10 h后用4層紗布過濾，顯微鏡鏡檢調(diào)整，制備孢子懸浮濃度為1×105cfu/mL懸浮液，用于接種果實(shí)[24-25]。

1.2 主要培養(yǎng)基配方

番茄種子培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基)：1/2MS +20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂；番茄共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS1)：MS+20 g/L蔗糖+ 5.5 g/L瓊脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA；番茄篩選培養(yǎng)基(MS2)：MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA，高壓滅菌，冷卻至60 ℃加入75 mg/L卡那霉素、400 mg/L羧芐青霉素，分裝培養(yǎng)瓶備用；番茄生根篩選培養(yǎng)基(MS3)：1/2MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂，高壓滅菌，冷卻至60 ℃加入50 mg/L卡那霉素和350 mg/L羧芐青霉素，分裝培養(yǎng)瓶備用。所有培養(yǎng)基pH 5.8。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 離體番茄葉片和果實(shí)的發(fā)病規(guī)律觀察 葉片：取30、50、70 d葉齡的番茄葉片，在葉片中間用消毒的接種針輕輕扎孔，用打孔器在灰霉病培養(yǎng)平板上去菌餅放置于葉片傷口處。將葉片放置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部放置4～5張濾紙，用無菌水打濕濾紙，保證葉片在培養(yǎng)皿中不失水。果實(shí)：按照果實(shí)不同發(fā)育階段取綠果(花后16～18 d)、白果(花后34～36 d)、紅果(花后40～42 d)等3個(gè)發(fā)育時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行處理。在果實(shí)上面用消毒的接種針扎2個(gè)小孔，配制好的灰霉病懸浮液用毛筆均勻地涂抹在果實(shí)表面，將果實(shí)放置于濕度合適的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿條件與葉片相同)。

所有處理的葉片和果實(shí)均放在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光周期16 h/8 h。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次分別處理15個(gè)葉片和果實(shí)。從處理開始每天拍照，直到完全發(fā)病。

1.3.2 番茄葉片和果實(shí)中的SlCBL1基因表達(dá)量的檢測 分別提取不同葉齡葉片和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登錄號(hào)NM_001252118.1)，設(shè)計(jì)目的基因SlCBL1熒光定量引物(表1)，并且在NCBI中比對(duì)驗(yàn)證，確認(rèn)引物后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，檢測SlCBL1基因相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR用ABI公司的熒光定量Step oneplus儀操作，SlCBL1基因和內(nèi)標(biāo)Actin基因總反應(yīng)體系為10 μL，包括3.5 μL super Mix，2 μL Primer Mix (10 μmol/L each)，1 μL cDNA，3.5 μL無核酸污染的ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性10 s， 55 ℃退火 30 s，40個(gè)循環(huán)后程序結(jié)束，用ABI的Stepone2.3軟件分析SlCBL1基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 目的基因克隆及番茄穩(wěn)定轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株鑒定 (1)目的基因克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的番茄SlCBL1基因序列，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)目的基因SlCBL1全長引物(表1)，PCR擴(kuò)增獲得SlCBL1基因全長序列。將SlCBL1基因正向構(gòu)建于gateway系列表達(dá)載體pK7WG2D上，構(gòu)建得到載體pK7WG2D-SlCBL1(以下簡稱p-SlCBL1載體)。構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，穿刺保存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)番茄的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。

(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 將含質(zhì)粒pK7WG2D(空載)和p-SlCBL1的農(nóng)桿菌EHA105在LB培養(yǎng)基上(含50 mg/L SPR和50 mg/L Rif)劃板，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取平板上長得好的單菌落，接種到50 mL液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、2 200 r/min 在搖床中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4，常溫下，5 000轉(zhuǎn)離心8 min，去掉上清液，在無菌濾紙上倒扣離心管，盡量將上清液去除后用MS液體培養(yǎng)基懸浮沉淀菌體，振蕩培養(yǎng)活化菌液，至菌液OD600為0.2～0.3后備用。

挑選生長飽滿的種子在超凈工作臺(tái)用70%乙醇沖洗30 s，無菌水沖洗2次，10%次氯酸鈉消毒8 min，無菌水沖洗3次，接種于1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)番茄無菌苗，15 d以后，選取幼嫩平展的子葉用于基因轉(zhuǎn)化。沿葉脈將葉片剪成大約3 mm2葉塊。將活化好的菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染30 min。倒出菌液，葉片放置于無菌濾紙上吸干表面的菌液。侵染后的葉片接種于番茄共培養(yǎng)基MS1中，24 ℃培養(yǎng)箱中黑暗共培養(yǎng)3 d。完成共培養(yǎng)的番茄葉片，接種番茄篩選培養(yǎng)基MS2上，使傷口與培養(yǎng)基充分接觸，在培養(yǎng)室中(25±2)℃、光照培養(yǎng)。大約40 d左右，可分化出抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)入番茄生根篩選培養(yǎng)基MS3上生根。獲得完整的抗性苗。

(3)轉(zhuǎn)基因植株鑒定 載體pK7WG2D和 p-SlCBL1上均攜帶超強(qiáng)表達(dá)的綠色熒光蛋白基因(eGFP)，番茄葉片切口部位長愈傷組織時(shí)，將培養(yǎng)瓶放在體式熒光顯微鏡下，抗性植株愈傷組織有明顯的綠色光發(fā)出。愈傷組織分化出芽以后抗性植株的芽在熒光顯微鏡下發(fā)綠光，而非抗性植株發(fā)紅光，可以直接將抗性植株篩選出來。將抗性植株移栽后可用體視熒光顯微鏡再次分別檢測番茄的不同組織器官的熒光。熒光檢測的同時(shí)，用PCR法檢測CaM-35S啟動(dòng)子序列，并且用qRT-PCR方法檢測目的基因SlCBL1表達(dá)量。通過以上3種方法檢測，確認(rèn)基因轉(zhuǎn)化成功。

表1 番茄抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和引物序列

1.3.4 轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄的灰霉病抗性分析 經(jīng)檢測轉(zhuǎn)基因番茄，開花結(jié)果之后收取T1代轉(zhuǎn)基因種子。種子經(jīng)低溫春化后，將空載對(duì)照、轉(zhuǎn)SlCBL1基因的種子播種于直徑18 cm育苗盆中，基質(zhì)按照泥炭土和蛭石1∶1比例混勻使用。番茄培養(yǎng)在白天溫度25～28 ℃、夜間15～18 ℃溫室中。

(1)轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實(shí)灰霉病發(fā)生規(guī)律觀察 觀察轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的離體葉片和果實(shí)分別接種灰霉病發(fā)病過程，從接種灰霉病到完全發(fā)病，每天拍照記錄，觀察轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄和對(duì)照的發(fā)病時(shí)間差異。

(2)轉(zhuǎn)基因番茄與抗病相關(guān)基因的表達(dá)量變化分析 用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄與空載對(duì)照相比較，果實(shí)發(fā)育不同階段的抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量變化。選取與番茄抗灰霉病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子3類，共7個(gè)。分別是番茄WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70[26-28]；ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的SlERF1和SlERF5[29-30]；NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的SlNAC1 和SlNAC4[31-32]。基因名稱、 NCBI登錄號(hào)以及qRT-PCR引物見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

所有基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因番茄的7個(gè)抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均以空載對(duì)照植株的相應(yīng)基因表達(dá)量為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體番茄葉片和果實(shí)的發(fā)病規(guī)律分析

對(duì)番茄離體葉片和果實(shí)的發(fā)病規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，葉片和果實(shí)發(fā)病規(guī)律有差異。不同葉齡葉片，接種灰霉病后開始發(fā)病時(shí)間都在接種后第4天，發(fā)病后第5天開始病癥慢慢嚴(yán)重，直至葉片死亡(圖1)。果實(shí)不同發(fā)育階段的發(fā)病規(guī)律有很大差異(圖2)。紅果接種后第5天開始發(fā)病，一旦發(fā)病后，病菌很快蔓延到全部果實(shí)，果實(shí)開始腐爛變質(zhì)；白果接種后第11天才開始發(fā)病，發(fā)病后果實(shí)也開始腐爛，在第15天時(shí)腐爛嚴(yán)重，果實(shí)開始滲水。而綠果在接種后15 d仍然未發(fā)病。這個(gè)結(jié)果說明番茄果實(shí)不同發(fā)育階段，對(duì)灰霉病的抗性不同。綠果期抗性最強(qiáng)；白果期抗病相對(duì)綠果較弱，但是白果采后會(huì)變色，在轉(zhuǎn)色期抗病性就會(huì)減弱，一般白果采后一旦轉(zhuǎn)色，就容易感染灰霉?。患t果期果實(shí)抗性最弱。

2.2 番茄葉片和果實(shí)中的SlCBL1基因表達(dá)量分析

番茄不同葉齡葉片中SlCBL1基因表達(dá)量差異不大。果實(shí)中的SlCBL1基因表達(dá)量差異較大，綠果中SlCBL1基因表達(dá)量與葉片相比明顯升高，隨著果實(shí)發(fā)育，白果中SlCBL1基因表達(dá)量最高，紅果中SlCBL1基因表達(dá)量最低(圖3)。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，和前面灰霉病發(fā)生規(guī)律相對(duì)應(yīng)，初步認(rèn)為SlCBL1基因表達(dá)量高低會(huì)影響番茄的抗病性。葉片中和紅果中SlCBL1基因表達(dá)量相對(duì)較低，相對(duì)應(yīng)葉片和紅果的抗病性較弱。綠果和白果中SlCBL1基因表達(dá)量較高，抗病性也較強(qiáng)。白果中SlCBL1基因表達(dá)量最高，但是番茄轉(zhuǎn)紅后會(huì)發(fā)病，從圖2觀察到白果在不轉(zhuǎn)紅之前不發(fā)病，在變紅之后幾天開始發(fā)病，這可能是因?yàn)镾lCBL1基因也參與果實(shí)的成熟發(fā)育，本課題組正在進(jìn)行此方面的研究。在白果期，SlCBL1基因表達(dá)量最高，此時(shí)SlCBL1基因的一部分功能用來抗病，一部分功能用來調(diào)控果實(shí)成熟發(fā)育。

2.3 目的基因克隆及番茄穩(wěn)定轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株鑒定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登錄號(hào)NM_001252118.1)，設(shè)計(jì)引物克隆SlCBL1基因?？寺〉玫降幕蚱未笮∨c目的基因片段大小一致，對(duì)基因進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫中的SlCBL1基因序列比對(duì)后一致性為100%。為了縮短后期轉(zhuǎn)基因植株的篩選檢測時(shí)間，以及檢測時(shí)更加便利，選擇了gataway系列植物表達(dá)載體pK7WG2D。pK7WG2D載體上攜帶有過量表達(dá)報(bào)告基因eGFP，便于后期轉(zhuǎn)基因植株檢測。獲得轉(zhuǎn)基因株系10株，并且通過熒光、PCR和q-PCR檢測，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因成功。

2.4 轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄的灰霉病抗性分析

對(duì)轉(zhuǎn)SlCBL1基因和空載對(duì)照的灰霉病抗性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照不同葉齡葉片接種灰霉病后第4天均開始發(fā)病，到第8天發(fā)病嚴(yán)重，大部分壞死。轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄的葉片在接種后8 d仍不發(fā)病(圖4)。結(jié)果說明過量表達(dá)SlCBL1基因能夠提高番茄葉片對(duì)灰霉病的抗性。對(duì)于果實(shí)，因?yàn)榫G果對(duì)照本身不易發(fā)病，轉(zhuǎn)基因果實(shí)也不發(fā)病，在綠果期抗性差異不大。白果期果實(shí)，對(duì)照在轉(zhuǎn)紅之后第2天也就是處理后第4天就開始發(fā)病，而轉(zhuǎn)基因果實(shí)在處理15 d后依然未發(fā)病。紅果對(duì)照在處理后第5天開始發(fā)病，第7天開始發(fā)病嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因紅果比對(duì)照的發(fā)病期推遲了3 d左右(圖5)。結(jié)果說明SlCBL1基因過量表達(dá)也能夠提高番茄果實(shí)對(duì)灰霉病的抗性。

圖1 不同葉齡的番茄葉片灰霉病發(fā)病規(guī)律Fig.1 B. cinerea pathogenesis regularity of different leaf ages of tomato

圖2 不同發(fā)育階段番茄果實(shí)灰霉病發(fā)病規(guī)律Fig.2 B. cinerea pathogenesis regularity of different fruit development stages of tomato

對(duì)轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄和空載對(duì)照葉片和果實(shí)中抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlCBL1基因過量表達(dá)后，葉片中幾乎所有抗病轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量都上調(diào)，上調(diào)最明顯的是WRKY TF 家族中的SlWRKY33和SlWRKY70基因，表達(dá)量上調(diào)均超過5倍以上，尤其是SlWRKY33，上調(diào)超過10倍(圖6)。果實(shí)中上調(diào)最明顯的也是WRKY TF 家族中的SlWRKY33和SlWRKY70。SlWRKY1的上調(diào)倍數(shù)受果實(shí)成熟度影響較大，隨著果實(shí)成熟，上調(diào)倍數(shù)增加。尤其在紅果中SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70的表達(dá)量上調(diào)更為明顯，3個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)都超過10倍(圖6)。

LA30d. 葉齡30 d； LA50d. 葉齡50 d；LA70d. 葉齡70 d；GF. 小綠果；WF. 白果； RF. 紅果；下同圖3 番茄葉片和果實(shí)中SlCBL1基因相對(duì)表達(dá)量LA30d. Leaf age 30 days； LA50d. Leaf age 50 days；LA70d. Leaf age 70 days；GF. Green fruit；WF. White fruit； RF. Red fruit；The same as belowFig.3 SlCBL1 gene relative expression in tomato leaf and fruit

轉(zhuǎn)SlCBL1基因植株為株系S3圖4 轉(zhuǎn)基因和對(duì)照番茄葉片接種灰霉病后發(fā)病過程對(duì)比SlCBL1 transgenic plant is strain S3Fig.4 Leaf disease process comparison of genetically modified tomato and control tomato after inoculation of B. cinerea

轉(zhuǎn)SlCBL1基因植株為株系S3圖5 轉(zhuǎn)基因和對(duì)照番茄果實(shí)接種灰霉病后發(fā)病過程對(duì)比SlCBL1 transgenic plant strain S3Fig.5 Fruit disease process comparison of genetically modified tomato and control tomato after inoculation of B. cinerea

通過以上結(jié)果能夠得出結(jié)論，SlCBL1基因過量表達(dá)能夠提高番茄的抗灰霉病能力。而目前初步研究證明SlCBL1基因調(diào)控番茄抗灰霉病主要是通過調(diào)控相關(guān)抗病轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。分別是番茄WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的SlWRKY1、SlWRKY33和SlWRKY70，ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中的SlERF1和SlERF5以及NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中的SlNAC1 和SlNAC4都有不同程度上調(diào)。而上調(diào)程度最為明顯的是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的SlWRKY33和SlWRKY70這2個(gè)基因。這說明在番茄抗灰霉病的過程中SlCBL1、SlWRKY33和SlWRKY70等3個(gè)基因都起著非常重要的作用，相互之間也有聯(lián)系并且相互作用。詳細(xì)機(jī)理有待后續(xù)研究。

3 討 論

CBL基因家族在植物抗逆中起著重要的作用，目前CBL家族的分析研究多集中于擬南芥、水稻和玉米等作物[2-5]，對(duì)園藝作物研究較少。番茄作為重要的園藝作物，對(duì)其CBL基因功能進(jìn)行研究，能夠?yàn)榉芽鼓嫘愿牧继峁├碚撘馈Ｑ芯孔C明，CBL基因除了在非生物逆境中發(fā)揮重要作用以外，在植物響應(yīng)生物逆境脅迫方面也發(fā)揮著重要作用[33]，而目前此方面的研究較少。鑒于此，未來可以將研究CBL基因在植物響應(yīng)生物逆境過程中的作用[34]作為一個(gè)重要研究方向。這對(duì)解析CBL與植物響應(yīng)生物逆境脅迫的機(jī)制具有重要的意義，CBL在生物逆境脅迫中的探索將成為CBL功能的研究趨勢(shì)。

圖6 轉(zhuǎn)SlCBL1基因番茄葉片和果實(shí)抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of genetically modified SlCBL1 gene tomato leaf and fruit disease resistance related transcription factor expression

目前已經(jīng)從番茄中分離鑒定出13個(gè)CBL基因，并對(duì)它們的基因組分布、分子特征、系統(tǒng)進(jìn)化以及順式元件進(jìn)行了分析，為研究番茄CBL的功能提供線索[35]。而盡管相關(guān)的研究很多，但是目前幾乎所有關(guān)于CBL基因的研究都是探討其在抗旱、抗鹽或者是抗低溫脅迫中的作用[3,5-6]，很少涉及到其在抗病方面的作用研究。番茄灰霉病作為番茄的重要病害之一，尤其在設(shè)施栽培中多發(fā)，而且在葉片和果實(shí)中都發(fā)病，因此給番茄產(chǎn)量造成了很大損失[16-17]。目前，有效的防治番茄灰霉病的方法通常都是藥劑防治[22-25]。要從根本上解決灰霉病，只有培育抗病品種才能最大限度地降低其危害，而分子育種是最為直接有效的方法，這就需要我們尋找有效的抗病基因來實(shí)現(xiàn)。

本課題組前期的研究證實(shí)了番茄中的SlCBL1基因在番茄果實(shí)成熟中的作用，該過程中發(fā)現(xiàn)SlCBL1基因不僅僅影響番茄果實(shí)成熟，而且在抗病方面也起作用。本研究結(jié)果表明，SlCBL1在番茄中的功能除了操縱植物的抗逆性，還能夠在番茄中起到抗灰霉病的作用。番茄果實(shí)中SlCBL1基因過量表達(dá)可以提高番茄抗灰霉病能力，初步研究認(rèn)為是通過SlCBL1基因過量表達(dá)調(diào)控抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來增強(qiáng)抗性的。雖然目前本研究還不能夠詳細(xì)解釋相關(guān)機(jī)理，但是對(duì)深入解析番茄抗病的分子機(jī)理具有參考價(jià)值，同時(shí)對(duì)CBL基因家族的研究提供了一條新的方向和思路。

[1] ZHU J K，LIU J，XIONG L. Genetic analysis of salt tolerance inArabidopsis[J].ThePlantCell, 1998,10(7):1 181-1 191.

[2] MARTINEZ-ATIENZA J, JIANG X, GARCIADEBLAS B,etal. Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice[J].PlantPhysiology, 2007,143 (2):1 001-1 012.

[3] WANG M Y, GU D, LIU T S,etal. Overexpression of a putative maize calcineurin B-like protein inArabidopsisconfers salt tolerance[J].PlantMolecularBiology, 2007,65(6): 733-746.

[4] SHI S S, CHEN W, SUNW N. Comparative proteomic analysis of theArabidopsiscbl1 mutant in response to salt stress[J].Proteomics, 2011,11(24): 4 712-4 725.

[5] ALBRECHT V, WEINL S, BLAZEVIC D,etal. The calcium sensor CBL1 intergrates plant responses to abiotic stresses[J].ThePlantJournal, 2003,36(4): 457-470.

[6] CHEONG Y H, KIM K N,etal. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses inArabidopsis[J].ThePlantCell, 2003,15(8): 1 833-1 845.

[7] 馬齊軍, 胡大剛, 由春香, 等. 蘋果MdCBL家族基因表達(dá)分析及MdCBL1的功能鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)2014,41(6): 1 053-1 062.

MA Q J, HU D G, YOU C X,etal. Classification and expression analysis of appleMdCBLfamily genes with a functional characterization ofMdCBL1[J].ActaHorticulturaeSinica, 2014,41(6): 1 053-1 062.

[8] 韓金龍, 李 慧, 叢 郁, 等. 杜梨CBL1和CBL7基因?qū)Ψ巧锬婢车捻憫?yīng)[J]. 果樹學(xué)報(bào), 2014,31(4): 529-535.

HAN J L, LI H, CONG Y,etal. Comparison of twoCBLgenes on stress tolerance functions fromPyrusbetulaefolia[J].JournalofFruitScience, 2014,31(4): 529-535.

[9] 許園園, 藺 經(jīng), 李曉剛, 等. 梨CBL基因家族全基因組序列的鑒定及非生物脅迫下的表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,48(4): 735-747.

XU Y Y, LIN J, LI X G,etal. Identification and expression analysis under abiotic stresses of the CBL gene family in pear[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2015,48(4): 735-747.

[10] GAO P, ZHAO P M, WANG J,etal. Co-expression and preferential interaction between two calcineurin B-like proteins and a CBL-interacting protein kinase from cotton[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2008,46(10): 935-940.

[11] 趙晉鋒, 余愛麗, 田 崗, 等. 谷子CBL基因鑒定及其在干旱、高鹽脅迫下的表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2013,39(2): 360-367.

ZHAO J F, YU A L, TIAN G,etal. Identification of CBL genes from foxtail millet (Setariaitalic[L.]Beauv.) and its expression under drought and salt stresses[J].ActaAgronomicaSinica, 2013,39(2): 360-367.

[12] ZHAO J F, SUN Z F, ZHENG J,etal. Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize[J].PlantMolecularBiology, 2009,69(6): 661-674.

[13] TOKAS I, PANDEY A,etal. Role of calcium-mediated CBL-CIPK network in plant mineral nutrition and abiotic stress[M].MolecularStressPhysiologyofPlants, 2013: 241-261.

[14] DRERUP M M, SCHLUCKING K, HASHIMOTO K,etal. The calcineurin B-like calcium sensors CBL1 and CBL9 together with their interacting protein kinase CIPK26 regulate theArabidopsisNADPH oxidase RBOHF[J].MolecularPlant, 2013,6(2): 559 -569.

[15] MAHS A, STEINHORST L, HAN J P,etal. The calcineurin B-like Ca2+sensors CBL1 and CBL9 function in pollen germination and pollen tube growth inArabidopsis[J].MolecularPlant, 2013,6(4): 1 149-1 162.

[16] 趙統(tǒng)敏, 余文貴, 趙麗萍, 等. 番茄抗灰霉病育種研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011,27(5) : 1 141-1 147.

ZHAO T M, YU W G, ZHAO L P,etal. Research progress in breeding of tomato resistance toBotrytiscinerea[J].JiangsuJournalofAgriculturalSciences, 2011,27(5) : 1 141-1 147.

[17] VEGA A, CANESSA P, HOPPE G,etal. Transcriptome analysis reveals regulatory networks underlying differential susceptibility toBotrytiscinereain response to nitrogen availability inSolanumlycopersicum[J].FrontiersinPlantScience, 2015,6(142): 911-921.

[18] AUDENAERT K, PATTERY T, CORNELIS P,etal. Induction of systemic resistance toBotrytiscinereain tomato byPseudomonasaeruginosa7NSK2: role of salicylic acid, pyochelin, and pyocyanin[J].MoleculerPlant-MicrobeInteractions, 2002,15(11): 1 147-1 156.

[19] BLANCO-ULATE B, VINCENTI E, POWELL A L,etal. Tomato transcriptome and mutant analyses suggest a role for plant stress hormones in the interaction between fruit andBotrytiscinerea[J].FrontiersinPlantScience, 2013,4(7): 142-152.

[20] CANTU D, VICENTE A R, GREVE L C,etal. The intersection between cell wall disassembly, ripening, and fruit susceptibility toBotrytiscinerea[J].ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerican, 2008,105(3): 859-864.

[21] JIN W, WU F. Characterization of miRNAs associated withBotrytiscinereainfection of tomato leaves[J].BMCPlantBiology, 2015,15(15): 1-14.

[22] 李保聚, 朱國仁, 趙奎華, 等. 番茄灰霉病在果實(shí)上的侵染部位及防治新技術(shù)[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1999,1(12): 63-67.

LI B J, ZHU G R, ZHAO K H,etal. Infection gates of gery mould of tomato fruits and a new technique for its controlling[J].ActaPhytopathologicaSinica, 1999,1(12): 63-67.

[23] 劉小花, 張嵐嵐, 朱長青, 等. Micro-Tom番茄矮化微型機(jī)制及其在植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 遺傳, 2008,30(10): 1 257-1 264.

LIU X H, ZHANG L L, ZHU C Q,etal. Mechanisms for miniature dwarf characteristics of Micro-Tom tomato and its application in plant functional genomics studies[J].Hereditas, 2008,30(10): 1 257-1 264.

[24] 余朝閣, 魏 嵐, 李天來, 等. 鈣對(duì)水楊酸誘導(dǎo)番茄葉片灰霉病抗性及防御酶活性的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2012,32(6): 1 166-1 170.

YU C G, WEI L, LI T L,etal. Effects of calcium on resistance to gray mold and aactivities of defensive eenzymes induced by salicylic acid in tomato leave[J].ActaBotanicaBoreal-OccidentaliaSinica, 2012,32(6): 1 166-1 170.

[25] 李琳琳, 李天來, 余朝閣, 等. 鈣素對(duì)SA誘導(dǎo)番茄幼苗抗灰霉病的調(diào)控作用[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2012,39(2): 273-280.

LI L L, LI T L, YU C G,etal. Effect of calcium on regulation of SA-induced Resistance toBotrytiscinereain tomato[J].ActaHorticulturaeSinica, 2012,39(2): 273-280.

[26] LU M, WANG L F, DU X H,etal. Molecular cloning and expression analysis of jasmonic acid dependent but salicylic acid independentLeWRKY1[J].GeneticsandMolecularResearch, 2015,14(4): 15 390-15 398.

[27] ZHOU J, WANG J, ZHENG Z,etal. Characterization of the promoter and extended C-terminal domain ofArabidopsisWRKY33 and functional analysis of tomato WRKY33 homologues in plant stress responses[J].JournalofExperimentalBotany, 2015,66(15): 4 567-4 583.

[28] ATAMIAN H S, EULGEM T, KALOSHIAN I.SlWRKY70 is required for Mi-1-mediated resistance to aphids and nematodes in tomato[J].Planta, 2012,235(2): 299-309.

[29] HUANG W, MIAO M, KUD J,etal.SlNAC1, a stress-related transcription factor, is fine-tuned on both the transcriptional and the post-translational level[J].NewPhytologist, 2013,197(4): 1 214-1 224.

[30] ZHU M, CHEN G,etal. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factorSlNAC4 regulates salt and drought tolerance and stress-related genes in tomato (Solanumlycopersicum)[J].PlantCellReports, 2014,33(11): 1 851-1 863.

[31] 劉 茜, 王愛云, 榮 瑋, 等. ERF轉(zhuǎn)錄因子在作物抗病基因工程中的研究進(jìn)展[J]. 種子, 2014,33(1): 48-52.

LIU Q, WANG A Y, RONG W,etal. Progress of ERF transcription factors in genetic engineering for disease resistance in crops[J].Seed, 2014,33(1): 48-52.

[32] LIU M, GOMES B L,etal. Comprehensive profiling of ethylene response factor expression identifies ripening-associated ERF genes and their link to key regulators of fruit ripening in tomato[J].PlantPhysiology, 2016,170(3): 1 732-1 744.

[33] KIM K N. Stress responses mediated by the CBL calcium sensors in plants[J].PlantBiotechnologyReports, 2013,7(1): 1-8.

[34] 董連紅, 史素娟, 蘇玉龍, 等. 植物 CBL基因家族的研究進(jìn)展[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2015,9 (5): 892-898.

DONG L H, SHI S J, SU Y L,etal. Advances in research of CBL family in plant[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences, 2015,9 (5): 892-898.

[35] 劉淑梅, 王施慧, 劉明毓, 等. 番茄CBL 家族基因的鑒定和遺傳進(jìn)化分析[J]. 分子植物育種, 2015,13(10): 2 268-2 273.

LIU S M, WANG S H, LIU M Y,etal. Identification and characterization of CBL family genes in tomato[J].MolecularPlantBreeding, 2015,13(10): 2 268-2 273.

(編輯:宋亞珍)

The Role ofSlCBL1 Gene in the Resistance toBotrytiscinereaof Tomato

WANG Yuanhua1,2, YAN Zhiming1,2, XIE Zhenqiang1,2, FENG Yingna1,2, CAI Shanya1,2

(1 Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang，Jiangsu 212400，China; 2 Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang，Jiangsu 212400，China)

With tomato (SolanumlycopersicumL.) variety ‘Micro Tom’ as test materials, we analyzed the pathogenesis regularity andSlCBL1 gene expression in tomato leaf and fruit. After inoculation withBotrytiscinerea, we observed the incidence ofSlCBL1 gene in tomato leaves and fruits in transgenic tomato and control. We analyzed the expression change of transcription factor related to disease resistance in transgenic tomato and control. The results show that: (1) for Non-gmo tomatoes, the leaves began to attack after inoculationB.cinerea4 days. Green fruit inoculationB.cinerea15 days still no disease. White fruit began to attack after inoculationB.cinerea11 days. Red fruit began to attack after inoculationB.cinerea5 days.SlCBL1 gene expression in tomato leaves was lower than in fruit, green fruit and white fruit stage is the highest, the red fruit is the lowest. (2) For genetically modified tomatoes, overexpression ofSlCBL1 gene can inhibit the occurrence ofB.cinereain tomato leaves and fruits. Almost all the transcription factor expression was up-regulated in leaves and fruits. WRKY transcription factor family geneSlWRKY33 andSlWRKY70 were strongly up-regulated. The results showed that the over expression ofSlCBL1 gene could improve the ability of the tomato to resist theB.cinerea. And by influencing the disease resistance related transcription factors to regulation tomato resistance toB.cinerea.

tomato；SlCBL1； resistance toBotrytiscinerea

1000-4025(2016)12-2376-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2376

2016-09-30;修改稿收到日期:2016-11-17

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20160567);江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)項(xiàng)目(2014kj15)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015B173)

王媛花(1981-),女，博士，講師，主要從事園藝植物分子生物學(xué)研究。E-mail:wangyuanhua0511@163.com

Q785;Q786

A