范 幸，周燕飛，祖月娥

(長(zhǎng)沙市婦幼保健醫(yī)院婦科門診，湖南 長(zhǎng)沙 410007 )

抑制HPV18型E7蛋白的表達(dá)對(duì)Hela 細(xì)胞生物學(xué)特性及miR-204表達(dá)的影響

范 幸，周燕飛，祖月娥

(長(zhǎng)沙市婦幼保健醫(yī)院婦科門診，湖南 長(zhǎng)沙 410007 )

目的 通過小干擾RNA(siRNA)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞中人乳頭瘤病毒(HPV)18型E7的表達(dá)，研究E7蛋白對(duì)Hela細(xì)胞的生物學(xué)特性和miR-204表達(dá)的影響和關(guān)系，探索HPV致癌的分子機(jī)制。方法設(shè)計(jì)合成靶向HPV18型E7基因的siRNA，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，抑制HPV18-E7的表達(dá)；采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)Hela細(xì)胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-204的表達(dá)水平。結(jié)果pRNAT-HPVE7與兩個(gè)對(duì)照組比較，明顯抑制了Hela細(xì)胞HPV18-E7的mRNA(t值分別為2.69、2.46，均P<0.05)和蛋白(t值分別為3.93、4.20，均P<0.05)的表達(dá)，細(xì)胞周期趨于正常，凋亡率增高(t值分別為-6.87、-6.92，均P<0.05)，miR-204表達(dá)水平也明顯升高(t值分別為0.26、0.22，均P<0.05)。結(jié)論抑制HPV18-E7基因的表達(dá)能改變Hela細(xì)胞的生物學(xué)特性和上調(diào)miR-204表達(dá)。

小干擾RNA；HPV E7蛋白；miR-204；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

全球每年有50多萬例新發(fā)的宮頸癌，而我國(guó)每年新發(fā)宮頸癌也超過13萬例，其中約8萬例死于宮頸癌，居國(guó)內(nèi)女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第2位，且宮頸癌的發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)在約90%宮頸癌組織中可檢測(cè)到人類乳頭瘤病毒，其中HPV16/18等高危型HPV感染與宮頸癌密切相關(guān)[1]。而人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的E6、E7蛋白表達(dá)是維持腫瘤細(xì)胞處于轉(zhuǎn)化活性狀態(tài)所必須的[2]。miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNAs，長(zhǎng)度18～24nt，廣泛存在于動(dòng)物等多細(xì)胞真核生物中。主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)的序列互補(bǔ)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。多項(xiàng)研究顯示，miRNA表達(dá)的改變與人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展和病毒感染密切相關(guān)[3]。研究HPV致病蛋白與miRNA的關(guān)系是探索宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的新途徑，為宮頸癌的基因治療提供了新的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究于2014年9月至2015年8月在中南大學(xué)肝病研究所完成，相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料包括：胎牛血清購自Gibico公司，DMEM(高糖)細(xì)胞培養(yǎng)基購自HyClone公司，胰酶購自Amresco公司，轉(zhuǎn)染陽離子脂質(zhì)體lipofectemin 2000購于美國(guó)Invitrogen公司，G418和MTT試劑購自Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)試劑盒購自Fermentas公司。鼠抗HPV18 E7單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司，HeLa細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小干擾RNA的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genebank上公布的HPV18-E7編碼基因的序列(Y18491.1)，按照小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)篩選原則獲得多個(gè)靶點(diǎn)序列，通過同源性驗(yàn)證確定與人類基因并無同源，最后篩選獲得一個(gè)靶點(diǎn)序列為：CGAGCAATTAAGCGACTCA，再根據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)成E7-siRNA：CGAGCAAUUAAGCGACUCA，按照以上步驟設(shè)計(jì)一條隨機(jī)序列的陰性對(duì)照NC-siRNA：AGUAGUAACGAUGC￣CACCA，并由上海生工生物工程有限公司合成，并用綠色的異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)作標(biāo)記，以示蹤siRNA的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將宮頸癌Hela細(xì)胞株從液氮中取出、復(fù)蘇，使用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)重懸，置37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)的Hela細(xì)胞分三組接種到60mm培養(yǎng)皿中，按照說明書，使用陽離子脂質(zhì)體lipofectemin 2000將對(duì)照NC-siRNA和靶標(biāo)E7-siRNA分別轉(zhuǎn)染其中兩組細(xì)胞，另一個(gè)組細(xì)胞作為空白對(duì)照不作任何處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，收集細(xì)胞。

1.2.3 人乳頭瘤病毒18-E7的mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

收集細(xì)胞，用Trizol試劑吹打溶解細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明書步驟，提取細(xì)胞總RNA。各取2μgRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照RT-PCR試劑盒操作步驟合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH作為內(nèi)參照，運(yùn)用PCR擴(kuò)增目的基因HPV-E7，HPV-E7的上游引物為：5'- ATGCATGGACCTAAGGCA -3'， HPV-E7的下游引物為：5'- TTACTGCTGGGATGCACA -3'，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為318bp；GAPDH的上游引物為：5'- CAAGGTCATCCATGA￣CAACTTTG -3'，GAPDH的下游引物為：5'- GTCCACCACC￣CTGTTGCTGTAG -3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為496bp。PCR條件為：94℃預(yù)變性3min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec,共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，電泳圖片應(yīng)用Scion Image軟件分析灰度值，并計(jì)算相對(duì)定量值,公式為：相對(duì)定量值=目的基因灰度值/內(nèi)參基因灰度值。

收集3組Hela細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(50mmoL/LTris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1%PMSF，0.1% Aprotinin，1% Trinton X-100)，混勻后置冰上15 min，13 000rpm，離心5min，收集上清液為胞漿蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。分別取等量蛋白40ug，12%SDS-PAGE電泳，濕式電轉(zhuǎn)移法把蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，再用3%脫脂牛奶室溫封閉2h。加鼠抗HPV18 E7單克隆抗體為一抗(1：1 000)，以鼠抗人β-actin單克隆抗體為內(nèi)參抗體(1：2 000)。4℃孵育過夜，PBST洗膜3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(1：2 000)，37℃孵育2 h, PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，然后壓片、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Scion Image軟件分析灰度值，并計(jì)算相對(duì)定量值,公式為：相對(duì)定量值=目的基因灰度值/內(nèi)參基因灰度值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的周期變化和凋亡水平

分別轉(zhuǎn)染了對(duì)照NC-shRNA和靶標(biāo)E7-shRNA的細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞，培養(yǎng)72h后使用0.25%的胰酶將細(xì)胞消化下來，各加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，2 000rpm離心5min，然后用PBS洗滌細(xì)胞一次，2 000rpm離心5min收集細(xì)胞沉淀，最后用70%乙醇重懸固定細(xì)胞。細(xì)胞送北京鼎國(guó)生物公司進(jìn)行細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。

1.2.5 Real-Time檢測(cè)miR-204在3組細(xì)胞中的水平

按照Trizol一步法提取細(xì)胞中總RNA，并通過分光光度計(jì)定量。各取2μgRNA，加入miR-204及U6逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列分別是miR204-RT：5'-GTCGTATCCAGTG￣CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCAT-3'，U6-RT：5'- TTCACGAATTTGCGTGTCAT -3'。轉(zhuǎn)錄完成后，取cDNA適量加入miR-204或U6擴(kuò)增引物，對(duì)miR-204和U6進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，引物序列分別是：U6-F：5'- CGCTT￣CGGCAGCACATATAC-3'；U6-R：5'- TTCACGAATTTG￣CGTGT￣CAT -3'；Mir204 -F：5'-TCGCCTTCCCTTTGTCATCCT-3'；Mir204-R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR儀自動(dòng)讀取熒光數(shù)據(jù)繪制擴(kuò)增曲線，最終獲得擴(kuò)增CT值，按照相對(duì)定量的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)公式：RQ=2-△△CT，計(jì)算出miR-204在3組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

由于合成的siRNA都標(biāo)記了綠色熒光素FITC，在siRNA轉(zhuǎn)染后24h即可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光素FITC，而空白對(duì)照細(xì)胞則無法觀察到綠色熒光，證明NC-siRNA和E7-siRNA均已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中(圖1)。

2.2 RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)HPV18-E7的mRNA和蛋白表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示，HPV18-E7的mRNA在空白對(duì)照組細(xì)胞(Blank)和隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(NC-siRNA)中均高表達(dá)，而E7-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HPV18-E7的mRNA表達(dá)水平很低，說明E7-siRNA對(duì)HPV18-E7的mRNA起到了RNA干擾作用(圖2、圖3)。Wester Blot結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組細(xì)胞(Blank)和隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(NC-siRNA)中，HPV18-E7蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均很高。而E7-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HPV18-E7的蛋白質(zhì)表達(dá)水平很低，說明E7-siRNA對(duì)HPV18-E7的蛋白表達(dá)水平也起到了很大的抑制作用(圖4、圖5)。

注：Blank為空白對(duì)照細(xì)胞；NC-siRNA為隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；E7-siRNA為HPV-E7的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

注：1.空白對(duì)照細(xì)胞；2.隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3.HPV18-E7的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

注：* 表示與兩個(gè)對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為2.69和2.46，均P<0.05)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的周期變化和凋亡水平

由流式細(xì)胞結(jié)果可知，兩個(gè)對(duì)照組之間沒有顯著性差異，而與兩個(gè)對(duì)照組相比，E7-siRNA組細(xì)胞的G1期阻滯，G2期和S期比率相應(yīng)降低，凋亡率卻明顯升高(見表1、圖6)。

2.4 Real-Time PCR檢測(cè)miR-204在3組細(xì)胞中的水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組之間比較，miR-204的表達(dá)水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而E7-siRNA組與兩個(gè)對(duì)照組比較，miR-204表達(dá)顯著升高，這表明HPV18-E7被抑制后上調(diào)了miR-204的表達(dá)(見圖7)。

注：1.空白對(duì)照細(xì)胞；2.隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3.HPV18-E7的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

注：*表示與兩個(gè)對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為3.93和4.20，均P<0.05)

Blank NC-siRNA E7-siRNA

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率

注：(Blank：空白對(duì)照細(xì)胞，NC-siRNA：隨機(jī)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；E7-siRNA：HPV-E7的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。*表示與兩個(gè)對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.26和0.22，P<0.05)

圖7 Real-time PCR檢測(cè)miR-204在3組細(xì)胞中的水平

Fig.7 The levels of miR-204 in cells among three groups detected by Real-time PCR

3 討論

3.1 靶向siRNA對(duì)Hela細(xì)胞HPV18-E7的mRNA和蛋白水平的影響

Hela細(xì)胞是取自一位美國(guó)婦女的子宮頸癌組織，它是被人乳頭狀病毒第18型(HPV18)感染并轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞系。1984年，德國(guó)病毒學(xué)家楚爾豪森利用Hela細(xì)胞證明了人乳頭狀病毒(HPV)會(huì)導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高，非常適合對(duì)HPV蛋白的功能研究。

本數(shù)據(jù)表明，E7-siRNA可在mRNA和蛋白質(zhì)水平上明顯下調(diào)HPV18-E7的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV的E6、E7能夠增加外源DNA 插入宿主基因組的頻率，導(dǎo)致在大多數(shù)浸潤(rùn)性宮頸癌均有高危型 HPV 的DNA 插入宿主的基因組；而且高危型HPV的E6和E7整合于宮頸癌宿主細(xì)胞基因組后可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)E6和E7蛋白，并干擾已發(fā)生DNA損傷細(xì)胞的依賴于p53的G1期阻滯、DNA修復(fù)的過程，從而使宿主DNA不穩(wěn)定，損傷得以累積，易于致癌[4-5]。HPV18-E7在Hela細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，通過下調(diào)E7的表達(dá)，能觀察到細(xì)胞生物學(xué)特性和某些關(guān)鍵分子的變化，可以初步確定E7在致癌方面的分子機(jī)制。

3.2 siRNA靶向HPV18-E7對(duì)Hela細(xì)胞周期和凋亡的影響

當(dāng)HPV18-E7蛋白的表達(dá)下調(diào)后，通過流式細(xì)胞術(shù)觀察到Hela細(xì)胞的G1期阻滯，凋亡率明顯升高。這可能是因?yàn)镠PV18-E7被siRNA靶向抑制后可上調(diào)P53、pRb、P16等細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并促進(jìn)了Hela細(xì)胞的凋亡[6]。同時(shí)也說明HPV18-E7在改變細(xì)胞周期和細(xì)胞抗凋亡方面的重要作用。

3.3 si RNA靶向HPV18-E7對(duì)Hela細(xì)胞miR-204水平的影響

miR-204定位于人類9號(hào)染色體上73424891～73425000位置之間。成熟的單鏈miRNA分子序列為5'UUCCCU￣UUGUCAUCCU￣AUGCCU3'，miR-204的成熟序列在人、小鼠、大鼠、大象和金魚等脊椎動(dòng)物中表現(xiàn)為高度保守。近年研究表明miR-204可能成為一種新的抑癌基因，它通過抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，具有抑癌基因的功能[7-9]。據(jù)報(bào)道，miRNA-204等在子宮內(nèi)膜腺癌中與鄰近的非腫瘤性的內(nèi)膜組織相比，顯著低表達(dá)，這對(duì)于研究miR-204在HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌中的作用起到了指導(dǎo)作用[10]。

通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Hela細(xì)胞內(nèi)源性病毒蛋白HPV18-E7的表達(dá)，還觀察到具有抑癌作用的miR-204水平隨著HPV18-E7蛋白表達(dá)的抑制而升高。我們經(jīng)過軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與宮頸癌關(guān)系密切的癌基因Ezrin[11]的3'非編碼序列上有miR-204結(jié)合的靶點(diǎn)。因此推斷，HPV18-E7可能通過抑制miR-204的表達(dá)，來上調(diào)Ezrin的表達(dá)，這有可能是HPV致宮頸癌的一條分子途徑，其分子機(jī)制有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證和探索，可能為宮頸癌的基因治療提供新的靶標(biāo)。

[1]de Sanjose S, Quint W G, Alemany L,etal.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study[J]. Lancet Oncol,2010,11(11):1048-1056.

[2]任睿,劉會(huì)玲,祝秉東,等.高危型HPV E6、E7蛋白致宮頸癌的分子機(jī)制研究[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,27(4):70-74.

[3]Hu X, Schwarz J K, Lewis J S Jr,etal.A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis[J].Cancer Res,2010,70 (4):1441-1448.

[4]孫志輝,岳天孚.人乳頭瘤病毒16/18型與宮頸癌[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2010,37(2):119-121,138.

[5]Liu S S,Tsang P C,Chan K Y,etal.Distribution of six oncogenic types of human papillomavirus and type 16 integration analysis in Chinese women with cervical precancerous lesions and carcinomas[J]. Tumour Biol, 2008, 29(2):105-113.

[6]Qi Z, Xu X, Zhang B,etal. Effect of simultaneous silencing of HPV-18 E6 and E7 on inducing apoptosis in HeLa cells[J]. Biochem Cell Biol,2010,88(4):697-704.

[7]Lee Y, Yang X, Huang Y,etal. Network modeling identifies molecular functions targeted by miR-204 to suppress head and neck tumor metastasis[J]. PloS Comput Biol,2010, 6(4):e1000730.

[8]Chung T K,Lau T S,Cheung T H,etal.Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1[J]. Int J Cancer, 2012, 130(5):1036-1045.

[9]Chen L,Yan H X,Yang W,etal.The role of microRNA expression pattern in human intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. J Hepatol, 2009, 50(2):358-369.

[10]Wu W, Lin Z, Zhuang Z,etal. Expression profile of mammalian microRNAs in endometrioid adenocarcinoma[J]. Eur J Cancer Prev, 2009, 18(1):50-55.

[11]Tan J, Zhang C, Qian J.Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue[J].Tumour Biol,2011,32(6):1241-1247.

[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

Effects of inhibiting expression of human papillomavirus type18 E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204

FAN Xing, ZHOU Yan-fei, ZU Yue-e

(OutpatientDepartmentofGynecology,ChangshaHospitalforMaternalandChildHealthCare,HunanChangsha410007,China)

Objective To study on the effects of E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204 through inhibiting the expression of human papillomavirus type 18 E7 (HPV18-E7) protein in cervical cancer Hela cells with small interfering RNA (siRNA) so as to explore the molecular mechanism of HPV carcinogenesis. Methods SiRNA targeting HPV18-E7 was designed and synthesized, and siRNA was transfected into Hela cells to inhibit the expression of HPV18-E7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to assess the level of mRNA and protein of HPV18-E7 in Hela cells. In addition, flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis of Hela cells. Florescent real-time quantitative PCR was used to measure the level of miR-204 expression. Results Compared with two control groups, results showed that pRNAT-HPVE7 could significantly inhibit the expression of mRNA (tvalue was 2.69 and 2.46, respectively, bothP<0.05) and protein (tvalue was 3.93 and 4.20, respectively, bothP<0.05) of HPV18-E7 in Hela cells. Besides, cell cycle showed a tendency to be normal while an increase was witnessed in apoptosis rate (tvalue was -6.87 and -6.92, respectively, bothP<0.05). In addition, a significant increase in miR-204 expression was also seen (tvalue was 0.26 and 0.22, respectively, bothP<0.05).Conclusion Inhibited expression of HPV18-E7 genes can lead to changes in the biological properties of Hela cells and up-regulation of miR-204 expression.

small interfering RNA (siRNA); HPV18-E7 protein; miR-204; cell cycle; apoptosis

2015-09-07

范 幸(1977-)，女，副主任醫(yī)師，在讀碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

祖月娥，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.06.008

R737.3

A

1673-5293(2016)06-0694-04